路瑞秋，胡永丹，张薄博，许赣荣*
（江南大学生物工程学院，工业与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）
摘 要：以樟芝菌固态发酵生产活性代谢产物安卓奎诺尔为目标物，采用Box-Behnken原理进行响应面分析，对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔条件进行优化，结果表明：接种量为296.80 mL/kg、Triton X-100添加量为1.10 mL/kg、辅酶Q 0的添加量为0.23 g/kg时，理论上樟芝固态发酵培养基安卓奎诺尔产量的最大值为865.85 mg/kg。经验证，安卓奎诺尔实际产量 为865.32 mg/kg，表明实验建立的模型能较好地预测实际发酵产安卓奎诺尔的情况。通过优化，樟芝固态发酵安卓奎诺尔产量比优化前（260.57 mg/kg）提高了232.09%。
关键词：樟芝；固态发酵；安卓奎诺尔；响应面
牛樟芝又名牛樟菇、血灵芝等，属于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属、多年生蕈菌类，是1995年才确定的一个新种 ［1］。至2012年从牛樟芝中已分离得到的化合物约225 种，这些化合物包括大分子化合物蛋白、核酸、多糖等，小分子化合物木质素、芳香化合物、泛醌类 ［2］、马来酸和琥珀酸衍生物 ［3］等。研究表明，樟芝的活性产物具有保肝护肝、抗癌、抗氧化、消炎等功效 ［4-7］。
樟芝仅生于台湾深山特有的“国宝”级树种——百年以上的牛樟树上，且樟芝生长极为缓慢，形成子实体的时间相当长 ［8］，野生樟芝在市场上供不应求，每公斤野生樟芝子实体价格均在万元以上，面对这种情况，通过人工培养的方法得到樟芝势在必行。目前，樟芝的人工培养方法主要有3 种方式：椴木栽培法、液态培养法、固态培养法。而固态培养法以其得到的产物中活性成分与野生樟芝子实体活性成分的近似程度较高，且与培养子实体相比发酵周期较短，生产原料不受限制等优势得到大范围推广。
2007年，Lee等 ［2］用正己烷萃取樟芝产物，得到一个新化合物安卓奎诺尔（antroquinonol），属于泛醌类化合物。研究表明，安卓奎诺尔对胰腺癌、肝癌具有显著的抑制作用 ［9-11］。Kumar等 ［12］研究显示，安卓奎诺尔可以显著地抑制3 种非小细胞型肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLS）癌细胞的增殖。目前已进入美国食品药品管理局（U.S. Food and Drug Administration，FDA）二期实验 ［13］，是具有优良前景的抗癌化合物。
目前，国内外学者关于安卓奎诺尔方面的研究多集中在其药理活性等方面，对通过发酵条件的优化和代谢调控来提高樟芝菌发酵产安卓奎诺尔产量的报道极少，喻学淳等 ［14］对樟芝菌产安卓奎诺尔的固态发酵条件进行了优化，Hu Yongdan等 ［15］对樟芝菌液态发酵安卓奎诺尔的机理进行了研究。本研究主要通过对樟芝菌体的细胞通透性和代谢的调控 ［16-18］进行研究，以提高固态发酵安卓奎诺尔的产量，并利用响应面设计优化上述条件。
1.1 材料与试剂
樟芝菌 上海福茂食品有限公司；谷物原料（粳米、籼米、糯米） 市售。
NH 4Cl、KH 2PO 4、MgSO 4、无水乙醇均为国产分析纯试剂；乙腈、甲醇（色谱纯） 德国Meker公司。
1.2 仪器与设备
DKZ-2型电热恒温振荡水槽 上海福玛实验设备有限公司；PL602-S电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；高效液相色谱仪（配有紫外检测器） 美国Waters公司；Sepax Amethyst C 18色谱柱（4.6 mm×250 mm，3 μm） 美国赛飞公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基与培养条件
樟芝接种于PDA斜面，28 ℃避光培养9 d，于4 ℃保藏。
孢子悬浮液制备：取PDA斜面，加无菌水，并用接种棒将斜面表层孢子刮下，对孢子数进行镜检，孢子数达到1×10 6个/mL。
种子培养基：葡萄糖20 g/L、KH 2PO 40.5 g/L、MgSO 40.5 g/L、黄豆粉7 g/L。种子液在28 ℃、150 r/min条件下培养4 d。
固态发酵基础培养基：谷物原料100 g、NH 4Cl 0.04 g、KH 2PO 40.025 g、MgSO 40.025 g，初始含水量 50 g水/g干基，接种量300 mL/kg干基，28 ℃培养24 d。
所有培养基均在115 ℃灭菌20 min。
1.3.2 安卓奎诺尔的分析检测方法
采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定樟芝产品中安卓奎诺尔产量。取樟芝固态发酵粉末3 g，加入无水乙醇75 mL，在35 ℃的DKZ-2型电热恒温振荡水槽内振荡提取85 min，静置后0.22 μm微膜过滤，进行HPLC分析，具体分析条件如文献［19］所示。
安卓奎诺尔参标由本实验室自行制备 ［20-21］，经过紫外（ultraviolet，UV）、质谱（mass spectrometry，MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、HPLC分析，其纯度≥91%。
1.3.3 产品收率的测定
将固态发酵产物取出，45 ℃烘干至恒质量，称质量并测定水分含量。产品收率按下式计算。
1.3.4 樟芝固态发酵条件的研究
1.3.4.1 谷物原料对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔影响的测定
分别称取粳米、籼米、糯米各100 g放于1 L锥形瓶内，接入30 mL的种子液，于恒温培养箱中28 ℃培养24 d后烘干磨粉测定安卓奎诺尔产量。根据安卓奎诺尔产量的大小确定最佳的发酵基质。
1.3.4.2 接种量对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔的影响测定
将固态发酵基础培养基（谷物原料为粳米）放于1 L茄子瓶中，分别接入100.00、200.00、300.00、400.00、500.00 mL/kg干基的种子液，于恒温培养箱中28 ℃培养24 d后烘干磨粉测定安卓奎诺尔产量。根据安卓奎诺尔产量和收率的大小确定最佳的接种量。
1.3.4.3 Triton X-100的添加对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔影响的测定
通过前期实验证实添加表面活性剂Triton X-100 ［22-23］可以促进安卓奎诺尔的产生，将固态发酵基础培养基（谷物原料为粳米）放于1 L茄子瓶中，接入200 mL/kg干基的种子液，发酵16 d进行28～25 ℃的变温调控，发酵18 d分别添加Triton X-100 0.20、0.60、1.00、1.40 mL/kg，发酵30 d结束，烘干磨粉测定安卓奎诺尔产量。根据安卓奎诺尔产量和收率的大小确定Triton X-100的最适添加量。
1.3.4.4 辅酶Q 0的添加对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔影响的测定
通过前期实验证实添加辅酶Q 0可以促进安卓奎诺尔的产生，将固态发酵基础培养基（谷物原料为粳米）放于1 L茄子瓶中，接入200 mL/kg干基的种子液，发酵16 d进行28～25 ℃的变温调控，于发酵18 d分别添加Triton X-100 1.00 mL/kg，发酵20 d分别添加辅酶Q 00.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/kg，发酵30 d结束，烘干磨粉测定安卓奎诺尔产量。根据安卓奎诺尔产量和收率的大小确定安卓奎诺尔的最适添加量。
1.3.5 响应面试验设计
综合单因素试验结果，应用Design-Expert 8.05软件，采用Box-Behnken原理建立数学模型，以接种量（A）、Triton X-100添加量（B）、辅酶Q 0添加量（C）为自变量，以安卓奎诺尔产量（Y）为因变量共设立了17 个处理组进行响应面试验设计。
2.1 樟芝固态发酵基本条件的研究
2.1.1 谷物原料的筛选
图1 不同谷物原料对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔的影响
Fig.1 Effect of cereal substrates on antroquinonol production by
A. camphorata in solid-state fermentation
固态发酵中，发酵基质作为菌体生长的附着物，为发酵提供主要的碳源及复杂的生长因子，影响着微生物的生长代谢，因此固态发酵基质的筛选对于产物的合成和积累有着非常重要的作用，大米作为樟芝固态发酵的基质有一定的优势，但大米的种类较多，每种大米对樟芝发酵的影响不尽相同，因此本实验考察了三类大米对樟芝菌生长和安卓奎诺尔合成的影响。如图1所示，以三类大米为发酵基质进行樟芝固态发酵，发酵干基中安卓奎诺尔产量依次为：粳米＞籼米＞糯米。固态发酵的基质对樟芝次级代谢产物安卓奎诺尔的合成和积累有重要影响，樟芝菌可以在实验所选取的谷物基质上生长，但是生长状况有较大差异。粳米可以良好地支持樟芝菌生长，菌体生长较快，安卓奎诺尔积累量明显高于其他两类米；同样的含水量下籼米比较干硬，樟芝菌生长较为缓慢，不利于安卓奎诺尔的合成和积累；糯米由于黏性较大，致使发酵基质的通气性差，不利于樟芝菌体的生长，因此安卓奎诺尔的产量也较低。
2.1.2 接种量对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔的影响
图2 接种量对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔的影响
Fig.2 Effect of inoculum amount on antroquinonol production by
A. camphorata in solid-state fermentation
发酵过程中，接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期 ［24］，接种量小时，菌体的延迟期延长，导致发酵周期延长，易染菌；接种量大时，由于接种的时候不仅带入种子，还有培养液，而种子液中含有一些水解酶，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，减少污染机会，但接种量过高往往又会使菌体生长过快，菌体间竞争加大，反而会抑制后期代谢产物的产生，所以接种量的大小对樟芝固态发酵有着重要的影响。如图2所示，随着接种量的增加，安卓奎诺尔产量呈现先上升后下降的趋势，产品收率呈现下降趋势但下降不明显，结合安卓奎诺尔产量和产品收率两者来看选取接种量200.00 mL/kg作为樟芝固态发酵的最适接种量。
2.1.3 Triton X-100添加量对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔的影响
发酵过程中，当胞内产物高浓度积累时可能会引起产物抑制阻碍活性产物产量的进一步提高，因此，考虑筛选合适的表面活性剂对樟芝细胞的通透性进行调节，希望可以进一步提高安卓奎诺尔产量的同时保持较高的产品收率。
表1 Triton X-100的添加量对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔的影响
Table 1 Effect of Triton X-100 concentration on antroquinonol
production by A. camphorata in solid-state fermentation
Triton X-100添加量/（mL/kg）安卓奎诺尔产量/（mg/kg） 产品收率/% 0.00 340.31 39.2 0.20 571.45 40.3 0.60 612.52 40.9 1.00 685.30 41.1 1.40 397.47 43.3
如表1所示，随着Triton X-100添加量的增加，安卓奎诺尔产量呈现先增加后下降的趋势，当Triton X-100的添加量为1.00 mL/kg时，安卓奎诺尔产量达到最高，为685.30 mg/kg。随着Triton X-100添加量的增加，产品收率呈现上升趋势，原因可能是Triton X-100的添加利于樟芝菌丝体生长的同时加速了安卓奎诺尔的分泌，从而实现了提高安卓奎诺尔产量的同时保持较高的产物的收率。
2.1.4 辅酶Q 0添加量对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔的影响
图3 辅酶QQ
0的添加对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔的影响
Fig.3 Effect of coenzyme Q
0concentration on antroquinonol production by A. camphorata in solid-state fermentation
微生物次级代谢产物的产量可以通过添加前体物质来促进合成 ［25-26］。但是目前有关安卓奎诺尔合成途径方面的文献极少，想要找到安卓奎诺尔合成的前体物质需从与安卓奎诺尔结构相似物的合成途径中寻找，安卓奎诺尔属于泛醌类化合物 ［25］，其分子结构式与辅酶Q 10极为相似，而辅酶Q 0是辅酶Q 10的前体物质，因此实验选择辅酶Q 0作为前体物研究其对安卓奎诺尔合成的影响。如图3所示，添加辅酶Q 0可以促进安卓奎诺尔的产生，随着辅酶Q 0添加量的增加，安卓奎诺尔产量呈现先上升后下降的趋势，而产品的收率变化不明显，当辅酶Q 0的添加量达到0.20 g/kg时，安卓奎诺尔产量达到834.62 mg/kg，产品收率为39.5%，因此最后确定辅酶Q 0的最适添加量为0.20 g/kg。
2.2 响应面法分析
2.2.1 响应面试验结果
表2 Box-Behnken试验设计方案及结果
Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental values of antroquinonol production
试验号 A接种量/（mL/kg）Y安卓奎诺尔产量/（mg/kg）1 -1（100.00） -1（0.60） 0（0.20） 833.82 2 1（300.00） -1 0 822.75 3 -1 1（1.40） 0 803.66 4 1 1 0 836.44 5 -1 0（1.00） -1（0.10） 817.04 6 1 0 -1 808.83 7 -1 0 1（0.30） 808.13 8 1 0 1 855.92 9 0（200.00） -1 -1 819.71 10 0 1 -1 809.66 11 0 -1 1 828.85 12 0 1 1 802.92 13 0 0 0 876.11 14 0 0 0 877.45 15 0 0 0 877.10 16 0 0 0 877.20 17 0 0 0 877.23 B Triton X-100添加量/（mL/kg）C辅酶Q 0添加量/（g/kg）
表3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation with antroquinonol yield as a function n
注：***. 差异高度显著（P＜0.000 1）；**. 差异极显著（P＜0.01）；*. 差异显著（P＜0.05）。
?
由Box-Behnken原理设计方案所得的试验结果见表2。选取接种量、Triton X-100添加量、辅酶Q 0添加量为自变量，以安卓奎诺尔产量为应变量，通过Design-Expert软件对试验数据进行二次多项式回归拟合，获得樟芝固态发酵安卓奎诺尔产量对接种量、Triton X-100、辅酶Q 0的二次多项式回归方程为：Y=877.02+7.66A-6.56B+ 5.07C+10.96AB+14.00AC-3.97BC-22.83A 2-30.02B 2-31.71C 2。
该二次项方程及各项方差分析如表3所示。模型F值为42.99，P＜0.000 1，说明模型高度显著。此模型相关系数R 2=0.982 2，表明回归方程的拟合程度较好，预测值和实测值之间具有高度的相关性，可以应用于樟芝安卓奎诺尔产量的理论预测。由表3可知，二次项B 2、C 2对樟芝发酵安卓奎诺尔有高度显著的影响（P＜0.000 1）；因素A、A 2、AB、AC对樟芝发酵安卓奎诺尔影响极显著（P＜0.01）；一次项B、C对樟芝发酵安卓奎诺尔有显著影响（P＜0.05）；其他变量的影响均不显著（P＞0.05）。表明模型中失拟项P＜0.000 1，说明由噪音引起模型偏差的概率P＜0.000 1，模型失拟项显著。
2.2.2 显著影响因素的交互作用分析
图4 各两因素交互作用对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔的影响
Fig.4 Response surface plots for the effects of culture conditions on antroquinonol production by A. camphorata
a图中固定水平：辅酶Q 0添加量为0.13 g/kg；b图中固定水平：Triton X-100添加量1.00 mL/kg。
经Design-Expert软件分析可得到3 个显著影响因素之间的响应面分析图，结果见图4。响应面分析图谱表示两组独立变量对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔的影响。由图4可知，接种量和Triton X-100的交互影响及接种量和辅酶Q 0的交互影响对樟芝发酵产安卓奎诺尔均有较显著的影响。
2.3 樟芝固态发酵产安卓奎诺尔最优培养基配方的获取与验证
对模型回归方程进行进一步分析，得到的最优培养基组成为接种量296.80 mL/kg、Triton X-100添加量1.10 mL/kg、辅酶Q 0添加量0.23 g/kg时，理论上樟芝固态发酵培养基安卓奎诺尔产量的最大值为865.85 mg/kg。由于以上最佳条件未包括在响应面优化的17 组试验中，需进一步验证。为了操作方便，将以上条件修正为接种量为300.00 mL/kg（干基）、Triton X-100添加量为1.00 mL/kg、辅酶Q 0添加量为0.23 g/kg。验证实验结果表明，在最佳发酵条件为将固态发酵基础培养基放于1 L茄子瓶中，接入20 mL的种子液，发酵16 d进行28～25 ℃的变温调控，于发酵18 d分别添加Triton X-100 1.00 mL/kg，发酵20 d添加辅酶Q 00.23 g，发酵30 d结束，樟芝发酵安卓奎诺尔的产量达到865.32 mg/kg，与预测值相差不大，说明该方程与实际情况拟合较好，充分验证了所建模型的正确性。
本实验对樟芝固态发酵产安卓奎诺尔的培养基进行响应面优化。结果显示，统计学优化策略能非常有效地优化调控樟芝固态发酵过程中活性代谢产物。接种量、Triton X-100和辅酶Q 0添加量对安卓奎诺尔的产量影响显著，在接种量为296.80 mL/kg、Triton X-100添加量为1.10 mL/kg、辅酶Q 0的添加量为0.23 g/kg时，安卓奎诺尔产量的最大值为865.85 mg/kg。通过实验验证樟芝固态发酵安卓奎诺尔的产量为865.32 mg/kg，比优化前（260.57 mg/kg）的提高了232.09%。
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Optimization of Antroquinonol Production in Solid-State Fermentation of Antrodia camphorata Using Response Surface Methodology
LU Ruiqiu， HU Yongdan， ZHANG Bobo， XU Ganrong*
（Key Laboratory of Industry and Biotechnology， Ministry of Education， School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）
Abstract：In this study， response surface methodology based on Box-Behnken design was used to optimize the culture conditions for the production of the bioactive metabolite antroquinonol in solid-state fermentation of Antrodia camphorata. The optimal culture conditions were determined as inoculum amount of 296.80 mg/kg， Triton X-100 concentration of 1.10 mL/kg and coenzyme Q 0concentration of 0.23 g/kg. Under these conditions， the maximum predicted yield of antroquinonol was 865.85 mg/kg， which was in good agreement with the experimental value of 865.32 mg/kg. Therefore， the established model could be used for predicting the culture conditions of Antrodia camphorate for antroquinonol production. After optimization， the yield of antroquinonol was increased 232.09% when compared with the control （260.57 mg/kg）.
Key words：Antrodia camphorate； solid-state fermentation； antroquinonol； response surface methodology
中图分类号：Q815
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）23-0150-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201523028
收稿日期：2014-12-23
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（21306065）；江苏省自然科学基金项目（BK20130134）
作者简介：路瑞秋（1989—），女，硕士研究生，主要从事樟芝固态发酵研究。E-mail：luruiqiu2011@163.com
*通信作者：许赣荣（1954—），男，教授，博士，主要从事药用真菌培养研究。E-mail：grxu123@126.com