田盼盼 1，程 超 1，2，汪兴平 1，2，*
（1.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000）
摘 要：利用逐级盐析法结合双水相萃取对葛仙米藻蓝蛋白进行纯化，设计三因素二次回归正交旋转组合试验对提取工艺进行优化，并应用Design-Expert 7.0软件建立了各影响因素与萃取纯度的数学回归模型。结果显示最佳的提取工艺为：20% （NH 4） 2SO 4盐析去沉淀后用40%和50% （NH 4） 2SO 4盐析得藻蓝蛋白，再用质量分数10%的聚乙二醇6 000、质量分数18%的（NH 4） 2SO 4进行双水相萃取。所得产物纯度可达到8.6，回收率为71.40%。对所得产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，得到清晰的两条条带（条带1和条带2），其分子质量分别在35 ku和15 ku左右。通过质谱分析可知，条带2的分子质量为15 ku左右，等电点5.35，部分肽的氨基酸序列为TPLTEAVAAADSQGR和DIGYYLR。通过SWISS-MODEL网站模拟蛋白质结构得出，条带2可能是葛仙米藻蓝蛋白的α亚基。
关键词：葛仙米；藻蓝蛋白；逐级盐析；双水相萃取；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；质谱分析
SDS-PAGE electrophoresis； mass spectrometry
葛仙米（Nostoc spharoids Kützing），属蓝藻门（Cyanophyta）蓝藻纲（Cyanophyceae）念珠藻科（Nostocaceae）念珠藻属（Nostoc），又名水木耳，古名天仙菜、天仙米 ［1］，是一种珍贵的食用藻类资源，同时具有药用价值。据《本草纲目拾遗》、《本草纲目》记载，葛仙米不仅对烫伤、脱肛、夜盲症等病症有疗效，还具美容功效 ［2］。藻胆蛋白是蓝藻和红藻特有的捕光色素蛋白，是一种具有重要生理活性的天然色素。常用于食品、染料、化妆品和医疗保健等方面。其荧光性还可用于生物工程、免疫化学和临床医学等领域 ［3］。此外，它还是一种极具开发潜力的光敏剂，在光合作用的理论研究方面具有重要价值，并可用于肿瘤治疗 ［4］。葛仙米中藻胆蛋白含量丰富，随着研究的不断深入，其商业价值日益凸显，藻胆蛋白的开发和最大限度的利用已备受关注。已知的藻胆蛋白包括藻红蓝蛋白、异藻蓝蛋白、藻蓝蛋白和藻红蛋白 ［5］。目前，通过转基因方法生产藻胆蛋白的技术尚不成熟，因此获取该物质的主要途径还停留在直接从藻类植物中提取的阶段 ［6］。对葛仙米藻胆蛋白的提取、分离与纯化工作已取得一定程度的进展。汪兴平等 ［7］用反复冻融法对葛仙米进行细胞壁破除，将葛仙米在0 ℃条件下放置0.5 h后研磨，重复3 次后提取，其细胞壁破除效果良好，蛋白质得率高。采用正交旋转组合实验对藻胆蛋白提取工艺进行优化，确定了最佳提取条件为含0.21 mol/L NaCl的pH 7.3的磷酸盐缓冲液，浸提4.5 h，得率为7.125% ［8］。
双水相萃取（aqueous two-phase extration，ATPE）技术始于20世纪60年代，由Albertsson最早发现。因其具有容易操作、适于放大生产且能充分保证成分的生物活性等优点而被广泛应用 ［9］。国内外关于双水相萃取的报道很多，不少学者通过双水相萃取出了纯度较高的蛋白质。如甘林火 ［10］、刘清新 ［11］、刘杨 ［12］、王巍杰 ［13］等都做了双水相萃取技术纯化蛋白质的研究。对于双水相萃取中各种条件的确定也有不少的研究，有研究指出降低上下相体积比可以使目标蛋白纯度和产量提高 ［14］。Pati等 ［15］发现逐渐提高结线长度，可在结线长度为33.53%时，提高蛋白总产量，最大产量可达97.47%。且结线长度的持续增加会导致界面中的蛋白质不断沉淀，使藻胆蛋白产量下降。Benavides等 ［16］研究发现，用低相对分子质量（1 000和1 450）的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）对B-藻红蛋白分离效果较好。本研究结合盐析的方法对葛仙米藻蓝蛋白进行双水相萃取，旨在为葛仙米藻蓝蛋白的纯化提供一定的理论依据和技术基础。并对纯化后的产物进行电泳分析和质谱分析，意在为后续的深入研究提供一定的参考。
1.1 材料与试剂
葛仙米 鹤峰县走马镇鹤峰县葛仙米开发公司。
PEG、（NH 4） 2SO 4、磷酸二氢钾、三水合磷酸氢二钾、氯化钠、甘氨酸、考马斯亮蓝G250、溴酚蓝国药集团化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） Biosharp生物科技公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris） 美国Amresco公司；过硫酸铵 中国医药上海化学试剂公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺 北京拜尔迪生物技术有限公司；fermentas蛋白标准品 上海泽迈生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
RT-02A型2两装粉碎机 荣聪精密科技有限公司；SHY-2A数显水浴恒温振荡器 金坛市科兴器厂；ALPHA1-4型真空冷冻干燥机 德国Christ公司；Avanti J-30I冷冻高速离心机 美国Beckman公司；WFJ7200紫外-可见光分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；FA 2140电子天平 上海天平仪器公司；透析袋（3 500） Biosharp生物科技公司；Infinite 200PRO多功能酶标仪 瑞士Tecan公司；TDL-60B飞鸽牌低速台式离心机 上海右一仪器有限公司；IKA旋涡混匀器北京中科星宇商贸有限公司；DYCZ-24D型电泳槽、DYY型三恒电泳仪 北京市六一仪器厂；STS-2型脱色摇床 上海琪特分析仪器有限公司；GENEX单道可调移液枪 芬兰百得实验室仪器（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 葛仙米藻胆蛋白粗提液的制备
称取100 g干燥的葛仙米，粉碎，蒸馏水4 ℃充分溶胀，反复冻融3 次使细胞壁充分破除，用pH 7.3的0.5 mol/L磷酸缓冲液（含0.2 mol/L NaCl）浸提4.3 h，4℃、10 000 r/min离心20 min得藻胆蛋白粗提液。
1.3.2 逐级盐析法制取葛仙米藻胆蛋白
在1.3.1节所得粗提液中加入一定质量的（NH 4） 2SO 4，使溶液质量分数达到20%，盐析过夜后冷冻离心（4 ℃、10 000 r/min离心20 min）除去沉淀得上清液。逐次在所得上清液中缓慢加入（NH 4） 2SO 4（注意低温条件下缓慢加入且不断搅拌，以防止因部分（NH 4） 2SO 4质量分数过高导致蛋白质的结构和活性变化），使（NH 4） 2SO 4溶液质量分数依次达到30%、40%、50%、60%、70%。低温静置过夜，高速冷冻离心，透析，真空冷冻干燥得不同盐析条件下的蛋白质粉末。
1.3.3 双水相萃取体系的优化
1.3.3.1 双水相体系相图的绘制
参考Albertsson ［17］浊点法，分别配制40%的PEG 1 500、4 000、6 000、8 000溶液和40%的（NH 4） 2SO 4溶液，称取0.700 g的PEG于大试管中，加0.5 mL水，然后向内滴入（NH 4） 2SO 4溶液，直到溶液刚好变浑浊，记下滴定体积，重复以上加水和滴定操作，分别计算出每次达到浑浊时溶液中PEG和（NH 4） 2SO 4的质量分数 ［18］。以（NH 4） 2SO 4质量分数为横坐标，PEG质量分数为纵坐标绘制相图。
1.3.3.2 葛仙米藻蓝蛋白的双水相萃取体系
取1.3.2节40%和50%盐析所得产物作为双水相萃取实验材料进行双水相萃取实验。
称取一定质量（NH 4） 2SO 4和PEG于15 mL带刻度试管中，加蒸馏水漩涡混匀使其完全溶解，加入10 mg/mL的葛仙米藻胆蛋白粗提液2 mL，蒸馏水调至体系总质量为10 g。混匀后避光萃取30 min，2 000 r/min离心5 min，待彻底分层后读取上下相体积，多功能酶标仪分别测定上下相在波长280、568 nm和615 nm处的吸光度，据公式（1）～（5） ［10］计算藻蓝蛋白的回收率和纯度。
式（1）～（5）中：C、C t、C b分别为藻蓝蛋白、上相藻蓝蛋白和下相藻蓝蛋白的质量分数/%；K为分配系数；R为相比；V t为上相体积/mL；V b为下相体积/mL；E p为藻蓝蛋白纯度；A 280 nm和A 615 nm分别为相应波长条件下的吸光度；Y为藻蓝蛋白回收率/%。
1.3.3.3 PEG相对分子质量对葛仙米藻蓝蛋白萃取效果的影响
依据1.3.3.1节方法所得相图，选取一定质量分数PEG和（NH 4） 2SO 4组成双水相体系。取40%和50%盐析所得藻胆蛋白作为双水相萃取实验材料，按照1.3.3.2节方法进行双水相萃取。以葛仙米藻蓝蛋白的纯度和回收率为主要参考指标，分别考察相对分子质量为1 500、4 000、6 000、8 000的PEG对双水相萃取效果的影响。
1.3.3.4 PEG质量分数对葛仙米藻蓝蛋白萃取效果的影响
在1.3.3.3节基础上选取相对分子质量最优的PEG，并分别配制成6%、8%、10%、12%、14%的PEG溶液，和一定质量分数（NH 4） 2SO 4构成双水相体系，得出PEG质量分数对双水相萃取藻蓝蛋白效果的影响。
1.3.3.5 （NH 4） 2SO 4质量分数对葛仙米藻蓝蛋白萃取效果的影响
参考1.3.3.4节结果，选用最优质量分数的PEG，分别和质量分数为12%、14%、16%、18%、20%的（NH 4） 2SO 4溶液构成双水相体系，得出（NH 4） 2SO 4质量分数对双水相萃取效果的影响。
1.3.3.6 中心组合试验设计
基于单因素试验结果，运用中心组合试验设计原理，对显著影响双水相萃取藻蓝蛋白纯度的3 个因素PEG相对分子质量（X 1）、PEG质量分数（X 2）、（NH 4） 2SO 4质量分数（X 3）做三因素三水平响应面分析试验（表1）。
表1 响应面设计因素水平表
Taabbllee 11 FFaaccttoorrss aanndd lleevveellss uusseedd iinn tthhee cceenntteerr ccoommppoossiittee ddeessiiggnn
因素 水平－1 0 1 X 1PEG相对分子质量 4 000 6 000 8 000 X 2PEG质量分数/% 13 14 15 X 3（NH 4） 2SO 4质量分数/% 15 16 17
1.3.4 藻胆蛋白的质量及纯度分析
分别称量1.3.2节各盐析条件下所得葛仙米藻胆蛋白，并按式（6）计算得率。
分别称取1.3.2节盐析所得藻胆蛋白及1.3.3节双水相萃取所得藻蓝蛋白，配成1 mg/mL溶液，于紫外-可见光分光光度计下进行光谱扫描，扫描波长250～750 nm，得光谱扫描曲线。
1.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）分析
配制溶液：3.0 mol/L pH 8.9的Tris-HCl分离胶缓冲液；0.5 mol/L pH 6.7的Tris-HCl浓缩胶缓冲液；pH 8.3的Tris（0.05 mol/L）-甘氨酸（0.384 mol/L）电极缓冲液；50%甲醇溶液和冰醋酸按一定比例混合成固定液；考马斯亮蓝G-250染色液；样品溶解液；甲醇和冰醋酸混合配制成脱色液。
制胶：按一定要求和比例分别配制质量分数为3%的浓缩胶和12.5%的分离胶 ［19］。
样品处理：称取双水相萃取所得葛仙米藻蓝蛋白粉末，配成2 mg/mL溶液，样品溶解液溶解，煮沸5 min冷却后上样，上样量20 μL，标准蛋白上样量5 μL。
电泳：连接电泳装置，放入适量电极缓冲液后开始电泳。初始电流稳定在10 mA左右，待样品完全进入分离胶后，电流调至20～30 mA。待染料前沿距离胶片底部1.5 cm时停止电泳。小心取出胶片，蒸馏水浸泡10 min以除去残留的SDS，放入固定液中固定1 h，染色液染色1 h，脱色液中脱色（前期每隔0.5 h换一次脱色液）直到胶带清晰透明为止。
1.3.6 葛仙米藻蓝蛋白的质谱鉴定
切下电泳胶片上的条带1和条带2，经除盐、浓缩，于2 μL基质（含5 mg/mL的α-4-羟基肉桂酸的50%硝酸铈铵，0.1%三氟乙酸溶液）中混合溶解后点样。利用质谱仪进行质谱分析。紫外波长为355nm，重复速率为200 Hz，加速电压为20 000 V，最优质量分辨率为1 500 D，扫描质量范围为700～3 200 D ［20-21］。
利用软件Mascot distiller过滤基线峰、识别信号峰。利用Matrixscience公司的Mascot软件搜索IPI_mouse数据库，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能，来明确鉴定的蛋白质种类。
2.1 逐级盐析法所得藻胆蛋白分析
2.1.1 逐级盐析所得藻胆蛋白得率和藻蓝蛋白纯度分析
表2 逐级盐析所得纯度和得率
Taabbllee 22 TThhee ppuurriittyy ooff pphhyyccoobbiilliipprrootteeiinn ssaalltteedd oouutt wwiitthh ddiiffffeerreenntt concentrations of ammonium sulfattee
（NH 4） 2SO 4质量分数 30% 40% 50% 60% 70% 先20%后60% A 280 nm 0.636 1.057 1.154 0.238 0.300 1.003 A 615 nm 0.199 1.215 1.187 0.088 0.071 0.660藻蓝蛋白纯度 0.314 1.150 1.029 0.368 0.236 0.658藻胆蛋白得率/% 0.150 0.621 0.848 7.372 0.413 7.135
如表2所示，不同质量分数（NH 4） 2SO 4盐析所得蛋白质得率不同，其中60%盐析蛋白质得率最大。（NH 4） 2SO 4质量分数在30%～50%范围内逐级盐析时，藻胆蛋白的得率随着质量分数的增大而增大。实验观察发现，30%盐析产物呈红棕色，60%盐析产物呈淡蓝色，70%盐析产物呈淡粉色，40%和50%盐析产物呈深蓝色。由产物颜色推断：30%盐析产物可能大部分是杂蛋白；40%和50%盐析产物中可能含有较大量的藻蓝蛋白；60%盐析产物中可能仅含少量藻蓝蛋白；70%盐析产物中可能几乎不含藻蓝蛋白。40%和50%盐析产物中藻蓝蛋白纯度可达到1以上。与先20%后60%盐析的方法比较，逐级盐析法可以逐级除去粗提液中的杂质，得到纯度较高的藻蓝蛋白。
2.1.2 逐级盐析藻胆蛋白紫外-可见扫描图谱
图 1 逐级盐析藻胆蛋白紫外-可见光谱扫描曲线
Fig.1 UV-Vis spectra of phycobiliprotein purifi ed by stepwise salting-out
如图1所示，40%和50%盐析产物在波长280 nm处有较高峰值，在可见光区有明显的两个峰，且615 nm波长处（藻蓝蛋白）的峰值高于波长568 nm处（藻红蛋白）的峰值。说明这部分盐析产物中含有大量藻胆蛋白，且前者含量高于后者。30%盐析产物在波长280 nm处有较高的吸收峰，但568 nm和615 nm波长处的峰值较小，表明这部分物质中虽含有较多的蛋白质，但藻红蛋白和藻蓝蛋白的含量较低，也可能是藻蓝蛋白和藻红蛋白在处理过程中丢失了色基基团。60%和70%盐析产物在波长280 nm处的吸收很少，说明这两部分物质中蛋白质含量少。结合表2各质量分数逐级盐析产物质量判断，主要杂质可能在60%盐析时被除去。通过以上比较可以看出，逐级盐析方法可有效除去蛋白质中的其他成分，得到纯度较高的藻蓝蛋白和藻红蛋白。
2.2 葛仙米藻蓝蛋白的双水相萃取
图 2 PEG 1 500、4 000、6 000、8 000和（NH
4）
2SSOO
4双水相相图
Fig.2 Two-phase aqueous diagrams with PEG 1 500， 4 000，6 000 or 8 000/（NH
4）
2SO
4
2.2.1 PEG-（NH 4） 2SO 4双水相系统相图图2为4 种不同相对分子质量PEG和（NH 4） 2SO 4组成双水相体系的相图。曲线下方各点为均匀混合体系，曲线上各点为临界点，曲线上方各点为两相区。从图2可以看出，PEG相对分子质量越小，体系分相需要（NH 4） 2SO 4和
PEG质量分数越高。当PEG质量分数一定时，PEG相对分子质量越小，形成双水相所需的（NH 4） 2SO 4质量分数越大。实验过程中发现，PEG相对分子质量越高，越难在水中溶解，且溶解分相后PEG相黏度越大。这可能是由于PEG相对分子质量越大憎水能力越强所致。
2.2.2 双水相萃取单因素试验结果
2.2.2.1 PEG相对分子质量对双水相萃取效果的影响
图 3 PEG相对分子质量对萃取效率的影响
Fig.3 Infl uence of PEG molecular weight on the extracting effi ciency
选择质量分数12%的PEG和16%的（NH 4） 2SO 4组成双水相体系。萃取分层后藻蓝蛋白富集在上相PEG相，上相为蓝绿色，下相无色。如图3所示，纯度和回收率呈现相反的变化趋势，纯度高时回收率低，回收率高时纯度低。各体系的回收率均在50%以上，PEG 6 000与（NH 4） 2SO 4形成双水相体系萃取出的藻蓝蛋白纯度可达3.5以上，比其他体系的纯度高出2 倍以上。故选择PEG 6 000为最佳的相对分子质量。
2.2.2.2 PEG质量分数对双水相萃取效果的影响
图 4 PEG质量分数对双水相体系萃取效果的影响
Fig.4 Effect of PEG percentage on the purity and recovery of phycobiliprotein
用不同质量分数的PEG 6 000和16%（NH 4） 2SO 4形成双水相体系，萃取藻蓝蛋白。结果如图4所示，随着PEG质量分数提高，藻蓝蛋白纯度和回收率均逐渐提高。14%的PEG 6 000和（NH 4） 2SO 4形成体系萃取所得藻蓝蛋白的纯度和回收率均明显高于其他体系，纯度可达到4以上，回收率近60%。所以选择14%为PEG 6 000的最佳质量分数。
2.2.2.3 （NH 4） 2SO 4质量分数对双水相萃取效果的影响
图5 （NNHH
4）
2SSOO
4质量分数对双水相体系萃取效果的影响
Fig.5 Effect of （NH
4）
2SO
4concentration on the purity and recovery of phycobiliprotein
用不同质量分数的（NH 4） 2SO 4和14% PEG 6 000构成双水相体系，如图5所示，（NH 4） 2SO 4质量分数在14%～18%变化时，体系萃取藻蓝蛋白的纯度和回收率随着质量分数的增大而提高。18% （NH 4） 2SO 4和14%的PEG 6 000形成体系萃取出的藻蓝蛋白纯度和回收率优于其他组，但是试验过程中发现，18% （NH 4） 2SO 4与PEG形成双水相体系时，由于（NH 4） 2SO 4质量分数太大不易溶解，且形成的体系黏度较大不易分相，不利于实际操作，故选择16%为（NH 4） 2SO 4的最佳质量分数，该体系萃取藻蓝蛋白的纯度在4左右，回收率可达到90%以上。
2.2.3 葛仙米藻蓝蛋白双水相萃取回归模型的建立
在单因素试验基础上，根据中心组合试验设计原理 ［22］设计了17 组试验，分别测定并计算各组藻蓝蛋白的纯度和回收率，试验结果见表3。
表3 中心组合试验设计及结果
Taabbllee 33 EExxppeerriimmeennttaall ddeessiiggnn mmaattrriixx wwiitthh eexxppeerriimmeennttaall rreessuullttss
试验号 X 1PEG相对分子质量X 2PEG质量分数X 3（NH 4） 2SO 4质量分数 纯度 回收率/% 1 0 1 －1 6.19 80.69 2 0 0 0 5.45 68.14 3 0 －1 1 6.01 57.92 4 0 0 0 5.19 61.39 5 1 1 0 1.33 68.94 6 0 0 0 6.12 63.84 7 1 －1 0 5.31 73.46 8 －1 －1 0 1.37 94.81 9 －1 0 1 1.88 71.53 10 －1 1 0 1.76 78.79 11 －1 0 －1 1.84 73.11 12 0 0 0 6.32 63.41 13 0 1 1 4.55 64.11 14 0 0 0 6.57 64.78 15 1 0 －1 2.99 70.81 16 0 －1 －1 2.02 81.54 17 1 0 1 1.35 84.48
用Design-Expert 7.0软件对表3结果进行分析，得出各影响因素的效应及其交互效应的关联方程 ［23］。利用软件对双水相萃取工艺条件进行优化，得出响应面图。本研究重点考虑葛仙米藻蓝蛋白的纯度，因此多元回归拟合主要以葛仙米藻蓝蛋白纯度作为响应值，分析得到葛仙米藻蓝蛋白纯度与各因素变量的二次方程模型为：y=－696.63+ 0.02X 1+37.03X 2+47.65X 3－5.45×10 －4X 1X 2－2.30×10 －4X 1X 3－1.41X 2X 3－7.70×10 －7X 1 2－0.41X 2
2－0.83X 3 2。2.2.4 最佳双水相萃取工艺方差分析及响应面优化
表 4 响应面法方差分析
Taabbllee 44 AAnnaallyyssiiss ooff vvaarriiaannccee （AANNOOVVAA） ffoorr qquuaaddrraattiicc rreessppoonnssee ssuurrffaaccee mmooddeell
注：**. P＜0.01，差异极显著；*. P＜0.05，差异显著。
方差 平方和自由度 均方 F值 P值 显著性模型 61.457 9 6.829 5.120 0.021 * X 1PEG相对分子质量 2.141 1 2.141 1.605 0.246 X 2PEG质量分数 0.098 1 0.098 0.073 0.794 X 3（NH 4） 2SO 4质量分数 0.068 1 0.068 0.050 0.828 X 1X 2 4.759 1 4.759 3.569 0.101 X 1X 3 0.702 1 0.702 0.527 0.492 X 2X 3 7.933 1 7.933 5.948 0.045 * X1 2 39.956 1 39.956 29.959 0.001 ** X2 2 0.610 1 0.690 0.517 0.495 X3 2 2.906 1 2.906 2.179 0.183残差 9.336 7 1.334失拟项 7.965 3 2.655 7.746 0.038 *纯误差 1.371 4 0.343总和 70.793 16
由表4的方差分析可知，各因素中，一次项X 1、X 2、X 3不显著，X 2X 3显著，X 1 2极显著。由此可见，各影响因素与响应值之间不呈简单的线性相关关系。由方差分析结果看出，回归模型也是显著的，相关系数R 2=61.457/70.793=0.868，说明响应值（藻蓝蛋白纯度）有86.8%的变化由试验各影响因素决定，即PEG相对分子质量、PEG质量分数和（NH 4） 2SO 4质量分数。因此，该方程可以对试验各因素与响应值之间的真实关系进行较好的描述，可利用此回归模型对实验可能产生的真实结果进行预测和分析 ［24］，得出最佳双水相萃取工艺条件。
图 6 各因素交互作用的响应面与等高线
Fig.6 Response surface plot and contour plot showing the effects of process conditions on phycobiliprotein purity
由图6响应面3D图和等高线分析图可以直观地看出各个因素的交互作用 ［25］。PEG相对分子质量与（NH 4） 2SO 4质量分数交互作用较强，在因素所选范围内响应值存在极值，即响应面的最高点，也是等高线最小椭圆的中心点，较大的X 1、X 3反而使响应值趋于减小。这可能是由于PEG相对分子质量过大或者（NH 4） 2SO 4质量分数过大反而阻止了蛋白质分子进入体系上相PEG相，从而分离效果变差。X 1、X 2之间也有交互作用，但是相对于X 1、X 3的交互作用较弱，X 2、X 3之间没有明显的交互作用。
由Design-Expert 7.0软件拟合二次回归模型预测得到最佳萃取工艺为PEG相对分子质量6 000、（NH 4） 2SO 4质量分数18.29%、PEG质量分数10%，藻蓝蛋白纯度为8.6，回收率为71.40%。考虑到实际操作和生产的便利，最佳工艺确定为PEG相对分子质量6 000、（NH 4） 2SO 4质量分数18%、PEG质量分数10%。
2.2.5 双水相萃取藻蓝蛋白纯度分析
2.2.5.1 双水相萃取藻蓝蛋白光谱扫描分析
图 7 双水相萃取藻蓝蛋白紫外-可见光谱扫描曲线
Fig.7 UV-Vis spectra of phycocyanin extracted by aqueous two-phase system
由图7可知，双水相萃取可以纯化粗提液，去除杂质成分，从而得到纯度较高的藻蓝蛋白。
2.2.5.2 双水相萃取藻蓝蛋白的SDS-PAGE
双水相萃取得到的蛋白质经SDS-PAGE电泳，如图8所示，图谱上有清晰的颜色很深的两条带，其他条带较少且颜色较浅。说明经过双水相萃取，得到了葛仙米藻蓝蛋白中杂质含量少，纯度较高。且由图8可知，蛋白质经SDS-PAGE得到两条带（条带1和条带2），条带1的分子质量在35 ku左右，条带2的分子质量在15 ku左右。
图 8 双水相萃取蛋白质的SDS-PAGGEE图
Fig.8 SDS-PAGE analysis of phycocyanin extracted by aqueous two-phase system
2.2.5.3 萃取后的藻蓝蛋白的质谱鉴定
通过质谱仪进行分析，并与Synpcc7942_1048数据进行对比，可知条带2的分子质量约为15 ku，等电点为5.35。匹配肽的氨基酸序列（斜体加黑表示）见图9a。
利用SWISS-MODEL网站对其蛋白结构进行模拟，结果见图9b，通过结构模拟得出，此氨基酸序列可能是藻蓝蛋白的α亚基。
图 9 条带2的氨基酸序列（a）和模拟蛋白结构（bb）
Fig.9 Amino acid sequence （a） and simulated protein structure （b） of band 2
本研究首先用（NH 4） 2SO 4逐级盐析法获得葛仙米藻胆蛋白，然后在此基础上用双水相萃取技术对所得产物进一步纯化，并对所得产物的质量和纯度进行分析。实验发现，通过逐级盐析的方法，可有效除去杂质成分，明显提高产物中藻蓝蛋白纯度。与先用20%后用60%盐析方法相比，通过20% （NH 4） 2SO 4盐析除杂后对上清液采用30%、40%、50%、60%、70% （NH 4） 2SO 4逐级盐析法，可使藻蓝蛋白纯度提高近1倍，产物的纯度可达1.1左右。用双水相萃取法对逐级盐析所得纯度在1.1左右葛仙米藻胆蛋白进一步纯化，并通过中心组合试验设计，对实验结果进行响应面分析，从而对萃取工艺进行优化，得到最佳工艺条件为：PEG相对分子质量6 000、（NH 4） 2SO 4质量分数18%、PEG质量分数10%。按照此工艺所得藻蓝蛋白纯度为8.6，回收率为71.40%。
通过Design-Expert 7.0软件分析并建立了响应值（葛仙米藻蓝蛋白纯度）与各因素之间的数学模型y=－696.63+ 0.02X 1+37.03X 2+47.65X 3－5.45×10 －4X 1X 2－2.30×10 －4X 1X 3－1.41X 2X 3－7.70×10 －7X 1 2－0.41X 2 2－0.83X 3 2，该模型回归显著，且对试验有较好的拟合度，可用于指导生产。
对双水相萃取所得藻蓝蛋白进行SDS-PAGE分析，得到清晰的两条条带（条带1和条带2），其分子质量分别在35 ku（条带1）和15 ku（条带2）左右。通过质谱分析可知，条带2的分子质量为15 ku左右，等电点5.35，部分肽的氨基酸序列为TPLTEAVAAADSQGR和DIGYYLR。通过SWISS-MODEL网站模拟蛋白质结构得出，条带2可能是葛仙米藻蓝蛋白的α亚基。
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Purifi cation of Phycocyanin from Nostoc spharoids Kützing by Stepwise Salting-out and Aqueous Two-Phase Extraction
TIAN Panpan
1， CHENG Chao
1，2， WANG Xingping
1，2，*
（1. School of Biological Science and Technology， Hubei University for Nationalities， Enshi 445000， China； 2. Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province， Hubei University for Nationalities， Enshi 445000， China）
Abstract：In this paper， stepwise salting-out combined with aqueous two-phase extraction was used to purify phycocyanin from Nostoc spharoids Kützing. The extraction process was optimized by using a three-factor quadratic regression orthogonal rotation combination design. Using the Design-Expert 7.0 software， a mathematical regression model was established indicating the effect of various extraction conditions on phycocyanin purity. The optimal extraction process was determined as follows: after discarding of the precipitate salted out by 20% （NH 4） 2SO 4， phycobiliproteins were salted out from the supernatant by 40% and 50% （NH 4） 2SO 4before being subjected to aqueous two-phase extraction with 10% PEG 6 000 and 18% （NH 4） 2SO 4. The purity （the absorbance ratio at 615 nm and 280 nm） and recovery of the purified product under the optimized conditions were 8.6 and 71.40%， respectively. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） analysis of the product revealed two clear bands having molecular weights of about 35 and 15 ku， respectively. Mass spectrometry （MS） analysis confi rmed that the molecular weight of band 2 was about 15 ku . Its isoelectric point was 5.35 and its partial amino acid sequences were TPLTEAVAAADSQGR and DIGYYLR， respectively. Through simulation of protein structure according to the SWISS-MODEL website， we speculated that band 2 might be the α-subunit of phycocyanin from Nostoc spharoids Kützing.
Key words：Nostoc spharoids Kützing； phycocyanin； stepwise salting-out； aqueous two-phase extraction；
中图分类号：TS201.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）24-0016-07
doi：10.7506/spkx1002-6630-201524003
收稿日期：2015-06-24
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31260365）；湖北省教育厅团队项目（T201312）
作者简介：田盼盼（1989—），女，硕士研究生，研究方向为天然产物开发与利用。E-mail：1003939513@qq.com
*通信作者：汪兴平（1963—），男，教授，博士，研究方向为生物资源的开发与利用。E-mail：hbmywxp@163.com