张禄捷，李 荣，姜子涛*
（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134）
摘 要：采用二次回归 正交旋转组合设计法优化茼蒿叶总黄酮的提取条件，并利用制备色谱对粗黄酮进行纯 化，最后通过不同的方法从4 个方面评价总黄酮的抗氧化活性。结果表明，茼蒿叶总黄酮的最佳提取工艺条件为：微波温度73 ℃、乙醇体积分数68%、液料比30∶1（mL/g）、微波功率400 W和微波时间8 min。在此条件下实际总黄酮提取率为0.554%。优化后的总黄酮提取物在总抗氧化活性、羟自由基和DPPH自由基的清除作用，以及对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用方面表现出较高的活性。
关键词：茼蒿叶总黄酮；二次回归正交旋转；制备色谱；抗氧化性
茼蒿（Chrysanthemum coronarium L.）为我国常见的蔬菜，又名蓬蒿，菊科茼蒿属，一年生或二年生草本植物。原产于我国，也有说其原产于地中海地区 ［1］。茎叶可食用，亦可入药，具有调胃健脾、降压补脑等效用。茼蒿中含有多种氨基酸、胆碱、精油和维生素等多种物质，能够调节机体代谢、消除水肿及抑制肿瘤转移 ［2-3］。此外，茼蒿还具有改善记忆力和调理脾胃等功能 ［4］。
黄酮类化合物是植物中主要的药理活性成分，具有降血脂、降血糖、抗肿瘤、增强机体免疫力等功能。有关茼蒿中黄酮类成分的分离鉴定已有少量报道，Anyos等 ［5］从茼蒿花序中检测出槲皮素-7-O-葡萄糖苷、六羟基黄酮、木犀草素和少量的山奈酚糖苷，Ibrahim等 ［6］发现茼蒿还含有芹黄素。林丹英等 ［7］发现茼蒿黄酮提取液对羟自由基的清除作用比较明显，其清除能力随黄酮质量浓度的增加而增大。另外，酚及多酚类也是广泛存在于茼蒿中的另一类生物活性成分。人们已从茼蒿中检测出异阿魏酸 ［8］、阿魏酸甲酯 ［9］和对羟基苯甲酸甲酯 ［8］等3种酚类化合物，以及绿原酸、异绿原酸和3，5-二咖啡酰基奎宁酸等3 种多酚类化合物的存在 ［10-11］。
近年来，微波辅助提取技术在提取多糖、生物碱以及其他活性物质等领域已经显露出常规的提取技术无法比拟的优点，并具有广阔的应用前景 ［12-13］。鉴于不同国家的地理条件、降雨量、光照时间等有较大的差异，导致植物成分会有较大的不同。因此，开展中国产茼蒿黄酮的研究，具有一定理论和实际意义。本实验采用二次回归正交旋转组合设计优化了茼蒿叶黄酮的提取条件，然后利用制备色谱对粗黄酮提取物进行了快速纯化，并分别从总体抗氧化活性、羟自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除以及对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用几方面对茼蒿叶黄酮的抗氧化活性进行了评价，为该植物黄酮在食品及相关领域的应用提供了理论依据。
1.1 材料与试剂
茼蒿叶2014年6月购自于天津当地市场（天津本地产，食用期），剔除腐烂叶，洗涤并沥干水分，70 ℃烘干48 h，恒质量，粉碎，过40 目筛。
芦丁标准品（分析纯） 北京化学试剂公司；甲醇（色谱纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；超纯水本实验室自制；石油醚（分析纯） 天津市风船化学试剂科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Multisynth微波合成仪 意大利Milestone公司；U-3900型紫外-可见分光光度计 日本Hitachi High-Technologie公司；Lambda25紫外-可见分光光度计珀金埃尔默仪器有限公司；Grace Reveleris TM全息快速纯化色谱系统 美国Alltech公司；1100 Series高效液相色谱仪 美国Agilent公司；FA1104N型电子天平 上海精密仪器有限公司；RE52-86A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；纯水器 成都超纯科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 茼蒿叶总黄酮的微波辅助工艺
称取1.0 g茼蒿叶粉末置于微波反应器的圆底烧瓶中，以乙醇溶液为溶剂，按照一定的温度、微波功率、液料比和时间进行提取，待提取液冷却后采用布氏漏斗进行抽滤以除去叶渣，滤液经石油醚萃取3 次，弃去石油醚层，滤液即总黄酮提取液用相应的乙醇溶液定 容到30 mL。
1.3.2 茼蒿叶总黄酮提取率测定
参照文献［14］，适当修改如下，芦丁标准品，精确称量20.0 mg，用30%的乙醇溶液溶解，移入100 mL容量瓶中，定容，即为质量浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。精密量取上述芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL分别置于10 mL比色管中，依次加入0.40 mL 5%的NaNO 2溶液，摇匀后静置5 min，分别加入0.40 mL 10% Al（NO 3） 3溶液，静置6 min，加入4.0 mL 4% 的NaOH溶液，摇匀后定容。静置10 min，以试剂空白作为参比，于508 nm波长处测定吸光度。所得数据经回归处理，得到各反应体系中芦丁含量与吸光度的回归方程为A=10.902 8C－0.000 7（R 2=0.999 0），式中：A为508 nm波长处的吸光度；C为芦丁质量浓度。
取1.0 mL黄酮提取液，稀释4 倍以确保显色后吸光度在标准曲线范围内，取1 mL稀释液按上述方法，测定其在508 nm波长处的吸光度，根据回归方程，得到茼蒿叶提取液中黄酮质量浓度C，每组做3 次平行实验，总黄酮提取率见式（1）：
式中：C为由回归方程计算的茼蒿提取液中总黄酮的质量浓度/（mg/mL）。
1.3.3 单因素试验
通过单因素试验和正交试验，确定了各因素对茼蒿叶总黄酮提取率的影响大小依次为：乙醇体积分数＞液料比＞微波温度＞微波功率＞提取时间，其中液料比、乙醇体积分数和微波温度3 个因素对总黄酮提取率影响较显著，其余2 个因素的影响不显著。鉴于实验中所用的Multisynth微波合成仪具有自动温控功能，当温度达到设定温度时，仪器会自动调整微波功率使提取液维持在设定温度。微波功率越大，达到设定温度的时间就越短。因此，微波功率和温度对总黄酮提取的影响要综合起来进行考察。
以乙醇溶液作为提取剂，分别考察乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%和90%）、微波温度（60、65、70、75、80 ℃）、液料比（20∶1、25∶1、30∶1、35∶1和40∶1），以及微波功率（300、400、500 W）与微波时间（7、8、9、10 min）对茼蒿叶总黄酮提取率的影响。根据公式（1）计算总黄酮的提取率。
1.3.4 二次回归正交旋转组合试验设计
参照文献［15］的方法，根据单因素试验结果分析，确定以乙醇体积分数（X
1，变化范围为50%～80%）、液料比（X
2，变化范围为20∶1～40∶1）、微波温度（X
3，变化范围为60～80 ℃）为影响因素，按照1.3.2节方法测定黄酮含量，进行二次回归正交组合试验。由于因素数m=3，故选用正交表L
8（2
7）进行变换，二水平试验次数m
c为8，星号试验次数m
γ为2，m为6，零水平试验次数m
0为4，依照星号臂长γ的计算公式
得γ=1.414。水平编码表见表1
［16-18］。
表1 水平取值及编码表
Taabbllee 11 CCooddeedd lleevveellss ooff iinnddeeppeennddeenntt vvaarriiaabblleess cchhoosseenn ffoorr qquuaaddrraattiicc regression orthogonal rotary desiggnn
规范变量z j自然变量X jX 1乙醇体积分数/% X 2液料比（mL/g） X 3微波温度/℃上星号臂γ 80 40∶1 80上水平1 75.61 37.07∶1 77.07零水平0 65 30∶1 70下水平－1 54.39 22.93∶1 62.93下星号臂－γ 50 20∶1 60变化间距Δ j 10.61 7.07∶1 7.07
1.3.5 制备色谱纯化茼蒿叶总黄酮及纯化效果检测
按照1.3.4节在最佳工艺条件下得到的总黄酮提取液，经减压旋蒸至无乙醇后，冷冻干燥。称取冷冻干燥后的茼蒿叶粗黄酮粉末5 g，溶于200 mL甲醇后转移到500 mL容量瓶，蒸馏水定容，得到质量浓度为10 mg/mL的总黄酮溶液，为制备样品液。
制备色谱纯化条件：柱填料为12g Reveleris TMRP C 18Cartridge，流动相为1%乙酸溶液（A）和甲醇（B），流速为10 mL/min，进样量为15 mL，检测波长为UV 272 nm，梯度洗脱条件为：0～15 min：0～70% B，15～20 min：70%～80% B，流动相A始终保持10%不变，设置仪器收集峰所对应洗脱液得制备色谱纯化总黄酮溶液。将上述制得纯化后茼蒿叶总黄酮溶液，减压旋蒸至无乙醇后，冷冻干燥，得到纯化后茼蒿叶总黄酮粉末。
高效液相色谱条件：Zorbax SB-C 18（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）、水（B）和1%乙酸溶液（C），流速为0.9 mL/min，进样量为10 μL，洗脱条件为0～30 min，10%～80% A，1%乙酸溶液一直保持10%，检测波长为272 nm。
总黄酮得率计算见式（2）：
1.3.6 茼蒿叶总黄酮的抗氧化活性的测定
参照文献［19-20］方法采用磷钼络合物法并稍加改进。配制质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL经制备色谱纯化并冻干成粉末的茼蒿叶总黄酮溶液和VC溶液。在一系列10 mL比色管中分别加入4.0 mL磷钼试剂（终浓度0.6 mol/L硫酸、4.0 mmol/L钼酸铵和28.0 mmol/L磷酸钠）和0.4 mL总黄酮样品液，迅速摇匀后置于95 ℃水浴中恒温90 min，在695 nm波长处分别测量不同样品液的吸光度A，对照组为4.0 mL磷钼试剂和0.4 mL 70%乙醇溶液。
1.3.7 茼蒿叶总黄酮清除DPPH能力的测定
参照文献［21］方法改进，分别配制质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL纯化后的茼蒿叶总黄酮及VC溶液，在一系列10 mL比色管中分别加入3.5 mL 1.0×10 －4mol/L的DPPH溶液，后加入0.5 mL无水乙醇，摇匀闭光反应30 min，以无水乙醇为参比，测定其在517 nm波长处吸光度A 1；同时用同样方法测定3.5 mL 1.0×10 －4mol/L的DPPH溶液和0.5 mL样品液的吸光度A；测定3.5 mL无水乙醇与0.5 mL样品液在517 nm波长处的吸光度A 0，则样品液对DPPH自由基的清除率计算见式（3）：
根据吸光度分别计算样品液对DPPH自由基的清除率。
1.3.8 茼蒿叶总黄酮对羟自由基的清除率 测定
参照文献［22］方法改进。采用结晶紫法，配制0.05 mg/mL的 VC和纯化后茼蒿叶总黄酮溶液。在10 mL比色管中加入0.2 mL结晶紫（0.4 mmol/L），后加入3 mL磷酸氢二钾-柠檬酸缓 冲溶液（pH 4.0），继续添加2 mL FeSO 4溶液（15 mmol/L）和2 mL H 2O 2（15 mmol/L）溶液，缓冲溶液定容至10 mL，摇匀放置30 min，在58 0 nm波长处测吸光度A 0，同时测定不加H 2O 2时，其吸光度为A b。实验组中，加入H 2O 2之前，加入不同体积纯化后茼蒿黄酮样品液，测定其吸光度为A x。则样品液对羟自由基的清除率计算见式（4）：
1.3.9 Fe 2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸过氧化体系中抗氧化活性的测定
分别配制质量浓度为0.1、0.2、0.3 mg/mL纯化后茼蒿叶总黄酮溶液和VC溶液。将卵黄悬浮液（pH 7.45）与0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液按1∶1的比例混合，磁力搅拌10 min后，进一步用磷酸盐缓冲液稀释至1∶25，适当搅拌后得到的悬浮液。吸取配好的卵黄悬浮液0.2 mL、茼蒿叶总黄酮溶液0.6 mL、25 mmol/L的 FeSO 40.2 mL于离心管中，用磷酸盐缓冲液补充至 2.0 mL，于37 ℃培养箱中培养12 h，取出后加入0.5 mL质量浓度为 20%三氯乙酸溶液，摇匀，静置10 min，放入离心机中，以 3 500 r/min的速率离心10 min。离心后取2.0 mL 上清液，在其中加入1.0 mL 0.8%硫代巴比妥酸溶液，沸水浴15 min。冷却后于532 nm波长处测定吸光度A x。空白管为磷酸盐缓冲液。对照管A o操作步骤同上，只是不加样品液。按照式（5）计算样品液对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率：
2.1 单因素试验结果
分别测定乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%和90%时茼蒿叶总黄酮的提取率。由图1A可知，茼蒿叶总黄酮的提取率随乙醇体积分数的升高而逐渐增大，乙醇体积分数达到一定值时，提取率反而降低，原因可能是在一定乙醇体积分数范围内黄酮类化合物的溶解度会升高，但过高时会促使细胞内的蛋白质凝固，导致黄酮类物质不易溶出 ［23］。所以选择进一步优化茼蒿总黄酮的乙醇体积分数在50%～80%之间。
选择乙醇的体积分数70%、微波温度75 ℃，固定其他条件，选择不同液料比20∶1、25∶1、30∶1、35∶1及40∶1（mL/g）时，分别测定茼蒿叶黄酮提取率。由图1B可知，随着乙醇溶液体积的增加，黄酮类化合物溶出增多，30∶1时提取率最大，随后减小。选择进一步优化提取茼蒿叶总黄酮的液料比为20∶1～40∶1。
选择乙醇体积分数为70%，固定其他条件，测定微波温度在60、65、70、75、80 ℃时，测定茼蒿叶总黄酮的提取率。由图1C可知，在 60～80 ℃范围内，随着微波温度的升高，茼蒿叶总黄酮提取率逐渐升高，但随着温度的升高提取率会下降。由于5 个温度条件下黄酮提取率相差不大，故选择优化时的温度范围为60～80 ℃。
当乙醇体积分数为70%、微波温度为70 ℃、液料比为30∶1时，选择不同的微波功率及时间，根据方法1.3.1节提取茼蒿叶总黄酮。由图1D可知，微波功率300 W时的提取率较400 W和500 W稍低，400 W和500 W的提取率相当，根据试验经验，当微波温度达到设定温度时，功率就不再升高，只需数十瓦即可维持设定温度，所以选取微波功率400 W条件下提取8 min为最佳提取条件。
图 1 单因素对茼蒿叶总黄酮提取率的影响
Fig.1 Effect of process conditions on the extraction effi ciency of total fl avonoids
2.2 二次回归正交旋转试验设计与处理
2.2.1 二次回归正交旋转试验设计
根据方法1.3.4节，二次回归正交旋转组合试验设计及结果见表2。
表2 二次回归正交组合设计表及结果
TTaabbllee 22 OOrrtthhooggoonnaall rreeggrreessssiioonn ddeessiiggnn wwiitthh eexxppeerriimmeennttaall rreessuullttss
试验号 z 1 z 2 z 3X 1乙醇体积分数/% X 2液料比（mL/g）X 3微波温度/℃总黄酮提取率/% 1 1 1 1 75.61 37.07∶1 77.1 0.497 2 1 1 －1 75.61 37.07∶1 62.9 0.371 3 1 －1 1 75.61 22.93∶1 77.1 0.472 4 1 －1 －1 75.61 22.93∶1 62.9 0.377 5 －1 1 1 54.39 33.07∶1 77.1 0.341 6 －1 1 －1 54.39 33.07∶1 62.9 0.319 7 －1 －1 1 54.39 22.93∶1 77.1 0.388 8 －1 －1 －1 54.39 22.93∶1 62.9 0.350 9 1.414 0 0 80 30∶1 70 0.448 10－1.414 0 0 50 30∶1 70 0.319 11 0 1.414 0 65 40∶1 70 0.497 12 0 －1.414 0 65 20∶1 70 0.489 13 0 0 1.414 65 30∶1 80 0.525 14 0 0 －1.414 65 30∶1 60 0.470 15 0 0 0 65 30∶1 70 0.588 16 0 0 0 65 30∶1 70 0.514 17 0 0 0 65 30∶1 70 0.539 18 0 0 0 65 30∶1 70 0.585
2.2.2 二次回归正交试验数据的分析与处理
运用SAS 9.2软件对试验数据进行统计计算，各项方差分析和参数估计及显著性分析的主要结果归纳分别见表3、4。由表3二次回归模型F=13.38，P=0.000 6＜0.001；失拟性检验的F=0.67，P=0.674 9＞0.05，说明该模型拟合得很好。一次项、二次项和交互项的P值分别P＜0.05、P＜0.001和P=0.224 6，说明3 个因素均对提取率有显著影响，而交互作用的影响则不显著。
表3 总黄酮提取条件的回归正交试验方差分析表
TTaabbllee 33 AAnnaallyyssiiss ooff vvaarriiaannccee ooff tthhee eexxttrraaccttiioonn eeffffi i cciieennccyy ooff ttoottaall fl avonoids with extraction conditionss
注：P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著。
变异来源 方差 自由度 均方差 F值 P值一次项 3.185 7 3 1.061 9 10.22 0.004 1二次项 8.758 8 3 2.919 6 28.11 0.000 1交互项 0.561 5 3 0.187 2 1.80 0.224 6回归模型 12.504 0 9 1.389 3 13.38 0.000 6失拟项 0.439 1 5 0.087 8 0.67 0.674 9纯误差 0.391 7 3 0.130 6总误差 0.830 8 8 0.103 8总和 13.334 8 17
表 4 提取试验二次回归模型参数
Taabbllee 44 PPaarraammeetteerrss ooff qquuaaddrraattiicc rreeggrreessssiioonn oorrtthhooggoonnaall mmooddeell
模型 Uncoded系数 t值 P值常数项 －63.914 5 －4.30 0.002 6 X 1乙醇体积分数 0.899 1 5.11 0.000 9 X 2液料比 0.224 6 0.91 0.387 0 X 3微波温度 0.974 8 2.85 0.021 4 X 1 2 －0.008 6 －8.44 ＜0.000 1 X 1X 2 0.002 6 1.50 0.171 4 X 2 2 －0.007 5 －3.10 0.014 6 X 1X 3 0.002 64 1.72 0.124 4 X 2X 3 0.000 4 0.17 0.868 6 X3 2 －0.008 0 －3.48 0.008 4
由表4可知，各因素的影响程度由大到小依次为X 1＞X 3＞X 2，即乙醇体积分数＞微波温度＞液料比。对数据进行多元二次回归拟合，去除X 1X 2、X 1X 3、X 2X 3交互项以及X 2项，得到优化后的茼蒿叶总黄酮提取率（y）的 二次多项回归方程为：
y=－63.914 5+0.899 1X+0.974 8X－0.008 6X 2－
1310.007 59X 2－0.008 0X 2 23
对回归方程进行优化后整个模型（P=0.000 6＜0.001）极为显著；失拟项（F=0.67，P=0.674 9＞0.05）不显著，说明试验无其他显著因素的影响，试验条件合适 ［24］，该回归方程与实际情况拟合的较好，其中R 2=0.937 7。通过回归模型预测的茼蒿叶总黄酮的最佳提取条件为：乙醇体积分数68.17%、液料比29.76∶1、温度73.19 ℃，微波功率400 W和微波时间8 min。在此条件下总黄酮提取率的预测值为0.575%，考虑到实际可操作性，将工艺参数修正为乙醇体积分数68%、液料比30∶1、温度73 ℃、微波功率400 W和微波时间8 min。在此条件下验证后实际总黄酮提取率为0.554%，相对误差为－3.65%，与预测值差异较小，证明此方法可以较好地对茼蒿叶总黄酮的提取条件进行优化，并且是真实可靠的。2.3 茼蒿叶总黄酮纯化效果
2.3.1 纯化得率和纯度
根据公式（5）计算，纯化前粗黄酮粉末为5 g， 纯化后冷冻干燥粉末0.89 g，则纯化得率为17.8%。分别称取纯化前的茼蒿叶粗黄酮粉末和纯化后的茼蒿叶黄酮粉末各10 mg，分别溶于10 mL 70%乙醇溶液，得到质量浓度为1 mg/mL的溶液，取1 mL溶液与比色管中，按1.3.2节方法显色，根据标准曲线计算茼蒿叶粗黄酮粉和纯化后黄酮粉中茼蒿叶总黄酮的含量，结果如表5所示。
表5 茼蒿叶粗黄酮粉经制备色谱纯化前后结果对比
Table 5 Total fl avonoid contents of Chrysanthemum coronariiuumm L. leeaaff eexxttrraacctt bbeeffoorree aanndd aafftteerr ppuurriiffi i ccaattiioonn bbyy pprreeppaarraattiivvee cchhrroommaattooggrraapphhyy
指标 纯化前 纯化后A 508 nm 0.057 0.217 C/（mg/mL） 0.005 3 0.020 0含量/% 0.53 2.00
由表5可知，茼蒿叶粗黄酮粉末经纯化后总黄酮含量是纯化前的3.8 倍，纯化效果较好。
2.3.2 纯化前后茼蒿叶总黄酮成分的高效液相色谱图
如图2所示，茼蒿叶粗黄酮纯化前图谱中14～20 min时响应值偏离零线较高，这可能是由于提取液存在杂质引起的，而在纯化后的图谱中则未见此情况，说明利用制备色谱得到的成分比较纯净，杂质大大减少且纯度明显提高。制备色谱在较短的时间内完成了5 g茼蒿叶粗黄酮的纯化，表明制备色谱高效快速，具有大孔树脂不可比拟的优势 ［25］。
图 2 茼蒿叶粗黄酮纯化前（A）和纯化后（B）的高效液相色谱图
Fig.2 HPLC profi les of fl avonoids from Chrysanthemum coronarium L. leaves before and after purifi cation by preparative chromatography
2.4 茼蒿叶总黄酮的抗氧化活性
2.4.1 总抗氧化能力
图 3 吸光度与样品液质量浓度的关系
Fig.3 Relationship between absorbance and fl avonoid concentration
具有抗氧化能力的物质能将磷钼络合物中的Mo （+6价）还原为绿色的Mo（+5价），这种络合物在695 nm波长处有最大吸收波长，并且其吸光度与它具有的抗氧化活性呈正相关。由图3可知，随着样品液质量浓度的增加，吸光度越大，说明茼蒿叶总黄酮具有抗氧化活性，与VC溶液趋势基本一致，但相比之下茼蒿叶总黄酮抗氧化能力较VC弱。
图 4 DPPH自由基清除率与样品液质量浓度的关系
Fig.4 Relationship between DPPH radical scavenging activity and fl avonoid concentration
2.4.2 清除DPPH自由基能力由图4可知，茼蒿叶总黄酮成分具有清除DPPH自由基的作用，且随质量浓度增加清除率增大。但与VC这种人工抗氧化剂相比，其清除效果仍然低于同质量浓度的VC。
2.4.3 清除羟自由基能力
图 5 羟自由基清除率与样品液质量浓度的关系
Fig.5 Relationship between hydroxyl radical scavenging and fl avonoid concentrations
如图5所示，随总黄酮溶液质量浓度增大羟自由基清除率也逐渐升高，说明茼蒿叶总黄酮成分具有清除羟自由基的能力，但较VC的清除能力低。
2.4.4 卵黄脂蛋白体系中抗氧化活性
图 6 样品质量浓度对卵黄脂蛋白脂质的抑制率
Fig.6 Inhibitory rate of fl avonoids from Chrysanthemum coronarium L. leaves at different concentrations on lipid peroxidation of yolk lipoprotein
由图6可知，茼蒿叶总黄酮和VC对Fe 2+引发的卵磷脂脂质体过氧化均有抑制作用。茼蒿叶总黄酮的抑制率随着质量浓度的增加而逐渐增大，虽然低质量浓度时，VC较茼蒿叶总黄酮抑制率高，但其随质量浓度增大抑制率没有明显变化，茼蒿叶总黄酮则在质量浓度为0.8 mg/mL时抑制率达到73.7%，VC在0.6 mg/mL时的抑制率最高为67.2%，表明茼蒿叶总黄酮具有良好的抗脂质氧化能力。
采用二次回归正交旋转试验对茼蒿叶黄酮微波提取条件进行优化，得到最优提取条件为：乙醇体积分数68%、液料比30∶1、微波温度73 ℃、微波功率400 W和微波时间8 min，在此条件下茼蒿叶总黄酮的提取率为0.554%。利用制备色谱实现了对茼蒿叶粗黄酮的快速纯化。实验结果表明，茼蒿叶黄酮类物质表现出较好的抗氧化活性，在自由基的清除以及卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制方面均有一定的作用。研究 ［26］表明，没有一种单一的方法能够充分地评价一种物质的抗氧化能力，需采用多种方法从不同角度对其进行，在本次实验中茼蒿叶黄酮提取液在总抗氧化性、清除羟自由基和DPPH自由基方面略逊于VC，但在卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制方面比其稍强，因此也可以作为一种天然抗氧化剂在食品工业领域得到开发利用。但实验对所提取的黄酮类物质的组分结构目前还不清楚，需要进一步研究确定。
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Extraction， Purifi cation and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Chrysanthemum coronarium L. Leaves
ZHANG Lujie， LI Rong， JIANG Zitao*
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce， Tianjin 300134， China）
Abstract：The extraction conditions of total flavonoids from Chrysanthemum coronarium L. leaves were optimized using quadratic regression o rthogonal rotary method. The flavonoids extracted were purified by preparative chromatography. Their antioxidant activities were evaluated by four different methods. The optimal extraction conditions were determined as follows：extraction temperature， 73 ℃； ethanol concentration， 68%； ratio of solvent to sample， 30:1； microwave power， 400 W； and extraction time， 8 min. Under the optimal extraction conditions， the extraction rate of total flavonoids was 0.554%. The fl avonoids showed high total antioxidant activity， radical scavenging activity against hydroxyl and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH） free radicals， and inhibitory effect on lipid peroxidation of yolk lipoprotein.
Key words：flavonoids from Chrysanthemum coronarium L. leaves； quadratic regression orthogonal rotary method；preparative chromatography； antioxidant activity
中图分类号：TS218
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）24-0040-06
doi：10.7506/spkx1002-6630-201524007
收稿日期：2015-04-25
基金项目：天津市自然科学基金重点项目（12JCZDJC34100）
作者简介：张禄捷（ 1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品添加剂。E-mail：362235435@qq.com
*通信作者：姜子涛（1956—），男，教授，博士，研究方向为食品添加剂及食品分析。E-mail：ztjiang@tjcu.edu.cn