陈建中
1，2，葛水莲
1，昝立峰
1，邢浩春
1，付 静
1，王更先
1
（1.邯郸学院生命科学与工程学院，河北 邯郸 056005；2.冀南太行山区野生资源植物研发中心，河北 邯郸 056005）
摘 要：目的：优化大吴风草总黄酮（total flavonoids of Farfugium，TFF）双水相萃取体系并研究其抑菌活性。方法：超声波辅助C 2H 5OH-（NH 4） 2SO 4双水相萃取TFF，依据Box-Behnken试验设计原理，采用三因素三水平响应面分析法，以TFF萃取率为响应值进行方差分析，获取多元二次线性回归方程；采用K-B纸片扩散法测定6 种供试菌种的抑菌圈直径，对比最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）确定其抑菌活性。结果：24% C 2H 5OH-18% （NH 4） 2SO 4双水相萃取体系条件下TFF萃取率最高，响应面试验方差分析表明，粗提液质量分数显著影响TFF萃取率（P=0.023 9＜0.05），而pH值和NaCl质量分数对萃取率的影响不显著；最佳双水相萃取条件为粗提液质量分数20%、pH 7.64、NaCl质量分数2.68%，萃取率模型预测最大值为96.366 7%（P=0.994）；TFF对枯草芽孢杆菌抑制作用最强，高剂量作用下抑菌率可达98.67%，MIC为1.56 mg/mL；对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑制作用次之，对青霉和黑曲霉抑制作用最弱。结论：粗提液质量分数对萃取率影响较大，pH值和NaCl质量分数对萃取率的影响较小；TFF对6 种供试菌种均表现出较强的抑菌活性，抑菌率与TFF质量浓度呈正相关，TFF对细菌的抑制效果相对强于真菌。
关键词：响应面优化；双水相萃取；黄酮类物质；大吴风草；抑菌活性
黄酮类物质具有抗癌、抗病毒、抗心脑血管疾病、抗糖尿病并发症、治疗骨质疏松等多种药用作用 ［1-2］，研究 ［3-5］表明黄酮类物质具有很强的抗氧化作用，能清除人体中有害的超氧自由基团，具有抗衰老、增强机体免疫力等生理活性。大吴风草（Farfugium japonicum （L.f.）Kitam）为菊科管状花亚科千里光族款冬亚族大吴风草属，多年生草本植物，全株入药。大吴风草的嫩叶和茎可作为蔬菜食用，“辛、温、无毒，性凉、味苦”，并具有退热、解毒、活血之功效。民间广泛用于治疗湿疹、咳嗽、支气管炎、淋巴腺炎、痢疾等疾病 ［6］。大吴风草作为药食两用的资源植物具有较高的开发价值。
双水相萃取技术是广泛应用于天然产物分离、生物提取、制药、食品化工等领域的一种新型分离技术 ［7-8］。近年来由水溶性低级醇与盐双水相体系，克服了传统双水相技术成本高、效率低、目标物回收处理较困难等问题 ［9-10］，易与其他技术集成 ［11-12］，倍受人们关注。目前有关大吴风草总黄酮双水相萃取的工艺优化和抑菌活性方面研究资料非常少，本实验旨在研究超声波辅助双水相技术萃取大吴风草总黄酮（total fl avonoids of Farfugium，TFF）的工艺条件，通过响应面法分析萃取条件的最优组合，进而分析TFF的抑菌活性，为开发利用大吴风草提供药理和质量控制的理论依据。
1.1 材料与菌种
大吴风草为冀南山区野生种类，采集地上部分，采时株高多50～70 cm。材料去掉杂质、洗净尘土、沥干水分，再于60 ℃鼓风干燥箱中烘至恒质量，粉碎过40 目筛后备用。
供试菌种为E. coli ACCC11864、Salmonella ACCC01319、S. aureus ACCC01332、Bacillus subtilis ACCC01430、Penicillium ACCC30287、Aspergillus niger ACCC30005，由河北工程大学医学微生物学实验室提供。
1.2 仪器与设备
小型自动粉碎机 郑州市烽火机械设备有限公司；L5紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器公司；N-1100V-WP旋转蒸发仪 西安安泰仪器公司；YXQLS-75SⅡ高压灭菌锅 上海博迅实业有限公司；HWS-D80恒温恒湿培养箱 上海仙象仪器仪表公司。
1.3 方法
1.3.1 标准曲线绘制与TFF质量浓度测定
参考徐春明 ［13］、赵强 ［14］等的方法，根据实验数据得出吸光度（y）和质量浓度（x）的回归方程：y=9.12x－0.023，R 2=0.998 6，线性回归关系良好。吸取样品液1 mL，用70%乙醇溶液补至5 mL，加入5% NaNO 2溶液0.3 mL，摇匀置6 min；再加入10% A1（NO 3） 3溶液0.3 mL，摇匀置6 min；加4% NaOH溶液4 mL，用蒸馏水定容至10 mL，摇匀15 min后测定吸光度，得到TFF质量浓度，重复3 次求平均值 ［15］。
1.3.2 低级醇与盐双水相体系的建立
考察乙醇与无机盐双水相体系对一定质量浓度目标萃取物的萃取能力，配制乙醇和无机盐比例形成稳定的双水相体系，加入目标萃取物，充分振荡使体系完全混合，离心后取样，用紫外分光光度计测定上下相的吸光度。根据标准曲线计算上下相TFF质量浓度，按式（1）～（3）计算体系的相比（R）、分配系数（K）和萃取率（Y） ［16-17］。
式（1）～（3）中：V t、V b分别为上下相体积/mL，C t、C b分别为上下相目标萃取物的质量浓度/（mg/mL）。1.3.3 响应面优化试验设计
确定了C 2H 5OH-（NH 4） 2SO 4双水相体系两相最佳组成后，重点研究黄酮粗提液质量分数、pH值和NaCl质量分数对TFF萃取率的影响。根据单因素试验结果，借助Design-Expert 8.0设计三因素三水平17 个试验处理的响应面试验，分析TFF双水相萃取的最佳工艺条件 ［18-20］。
1.3.4 TFF抑菌率的测定
采用K-B纸片扩散法，在无菌的条件下，取100 μL菌种于琼脂培养基（muller hinton agar，MHA）内，密封并轻轻摇匀，置于摇床37 ℃培养18 h。取适量种供试菌液于试管中，稀释成0.5麦氏标准浊度。将蘸取供试药溶液直径为7 mm的无菌滤纸片，均匀摆放在涂有菌悬液的MHA培养基上，每个培养皿中均摆放4 个纸片，分别配制高、中、低3 个剂量的TFF和阳性对照药物：苯甲酸钠，做5 次平行实验。将培养皿密封后置于恒温培养箱中37 ℃培养18 h，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。以抑菌圈直径（A）和抑菌率（R）来评判供试药物的抑菌活性 ［21-22］，见式（4）。
式中：R为抑菌率/%；A为供试药抑菌圈直径/mm；B为阳性药抑菌圈直径/mm；c为滤纸片直径/mm。
1.3.5 最小抑菌浓度（m i n i m u m i n h i b i t o r y concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定
在无菌条件下，将灭菌试管根据供试菌种的类型分为6 组，每组12 支。具体配制如下：第Ⅰ支加入2 倍质量浓度的LB液体培养基2 mL，第Ⅱ～Ⅹ支试管加入LB液体培养基2 mL，向第Ⅰ支试管中加入TFF提取液2 mL，按照2 倍稀释法，使各管药液质量浓度依次为：50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.00 mg/mL，然后向这10 支试管中分别加入各菌种的菌悬液0.1 mL，第Ⅺ支管作为阳性对照，仅加入中LB液体培养基2 mL，第Ⅻ支管作为阴性对照，加入2 倍质量浓度的LB液体培养基1 mL和TFF提取液1 mL。将上述设置试管置于37 ℃恒温培养箱内培养24 h，从12 支试管中分别取0.1 mL涂布于固体LB培养基平板上，37 ℃恒温培养箱内培养，以24 h不长菌的总黄酮溶液质量浓度为MIC，以48 h不长菌的提取液质量浓度为MBC ［23-25］。
2.1 双水相萃取TFF体系的建立和评价
2.1.1 乙醇质量分数对TFF分相萃取的影响
室温（25 ℃）条件下，C 2H 5OH-（NH 4） 2SO 4双水相萃取体系组成如下：无水乙醇质量分数依次为20%、22%、24%、26%、28%，固定（NH 4） 2SO 4质量分数22%、粗提液质量分数20%，搅拌至两相充分混匀，对上下相溶液进行定量分析。
图 1 乙醇质量分数对TFF分相萃取的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on partitioning behavior of TFF
如图1所示，随着乙醇质量分数的增加，TFF萃取率和分配系数都有所增加，主要原因是黄酮在乙醇中的溶解度大于水中的溶解度，乙醇质量分数增加，提高了双水相体系的分相能力。当乙醇质量分数达到24%时，TFF萃取率和分配系数都达到最大值，而后，随乙醇质量分数的增加，TFF萃取率和分配系数都显著下降，可能是乙醇质量分数过高时，下相中TFF的质量浓度也在增加，从而抑制了TFF的析出，因此确定C 2H 5OH-（NH 4） 2SO 4双水相萃取体系最佳的乙醇质量分数为24%。
2.1.2 （NH 4） 2SO 4质量分数对TFF分相萃取的影响
室温（25 ℃）条件下，C 2H 5OH-（NH 4） 2SO 4双水相萃取体系组成如下：（NH 4） 2SO 4质量分数依次为16%、18%、20%、22%、24%，固定乙醇质量分数24%、粗提液质量分数20%，搅拌至两相充分混匀，对上下相溶液进行定量分析。
图2 （NNHH
4）
2SSOO
4质量分数对TFF分相萃取的影响
Fig.2 Effect of （NH
4）
2SO
4mass fraction on partitioning behavior of TFF
如图2所示，随着（NH 4） 2SO 4质量分数的增加，TFF萃取率和分配系数先是逐渐上升，在（NH 4） 2SO 4质量分数为18%时，TFF萃取率和分配系数都达到最大值，当（NH 4） 2SO 4质量分数过高时，双水相体系在（NH 4） 2SO 4沉淀析出同时，TFF的析出速率会受到抑制，导致萃取率和分配系数随（NH 4） 2SO 4质量分数的增加而下降，因此C 2H 5OH-（NH 4） 2SO 4双水相萃取体系中（NH 4） 2SO 4的最佳质量分数为18%。
2.2 双水相萃取TFF单因素试验结果
2.2.1 粗提液质量分数对TFF分相萃取的影响
室温（25 ℃）条件下，24% C 2H 5OH-18% （NH 4） 2SO 4双水相萃取体系粗提液质量分数依次为10%、12%、14%、16%、18%、20%，搅拌至两相充分混匀，对上下相溶液进行定量分析。
图 3 粗提液质量分数对TFF分相萃取的影响
Fig.3 Effect of crude extract concentration on partitioning behavior of TFF
如图3所示，粗提液添加量直接影响TFF萃取量，粗提液质量分数影响C 2H 5OH-（NH 4） 2SO 4双水相萃取体系上下相的萃取率和分配系数，基本变化规律曲线相似，当粗提液质量分数增加时，上相萃取率和双水相分配系数都呈现先降后升的相似变化规律曲线，当粗提液质量分数为18%时，二者都到最大值，因此24% C 2H 5OH-18% （NH 4） 2SO 4双水相萃取体系最佳TFF粗提液质量分数为18%。
2.2.2 pH值对TFF双水相萃取分相的影响
室温（25 ℃）条件下，24% C 2H 5OH-18%（NH 4） 2SO 4双水相萃取体系中粗提液质量分数18%，通过NaOH和HCl调节双水相体系pH值分别为5、6、7、8、9、10，搅拌至两相充分混匀，对上下相溶液进行定量分析。
图4 pH值对TFF分相萃取的影响
Fig.4 Effect of pH on partitioning behavior of TFF
如图4所示，24% C 2H 5OH-18% （NH 4） 2SO 4双水相萃取体系中萃取率和分配系数都呈现先增后降的规律，pH值小于7时，分配系数和萃取率随着pH值升高逐渐增大；pH值为7时，分配系数和萃取率达到最大值；当pH值大于7碱性条件时，随pH值的升高分配系数和萃取率在下降。由于24% C 2H 5OH-18% （NH 4） 2SO 4双水相萃取体系上下相的电荷特性，酸性条件下，TFF电解后电离平衡使之携带上正电荷，TFF向带有负电荷的下相富集，分配系数随之下降；而在碱性条件下，黄酮的母核易被羟基破坏，降低TFF的萃取率。因此24% C 2H 5OH-18% （NH 4） 2SO 4双水相萃取体系最佳pH值为7。
2.2.3 NaCl质量分数对TFF双水相萃取分相的影响
图 5 NaCl质量分数对TFF分相萃取的影响
Fig.5 Effect of NaCl concentration on partitioning behavior of TFF
室温（25 ℃）条件下，24% C 2H 5OH-18% （NH 4） 2SO 4双水相萃取体系中，粗提液质量分数18%、pH 7.0，NaCl质量分数分别为0.0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、 3.0%，搅拌至上下相两相充分混匀，对两相溶液进行定量分析。
由图5所示，随着萃取体系中NaCl质量分数的增加，萃取效率的两个关键指标分配系数和萃取率二者呈现同步变化趋势。对比两个指标变化曲线，分配系数曲线变化较为平缓，而萃取率的变化较大，当NaCl质量分数为2.5%时，二者都达到最大值。NaCl对萃取体系的主要作用是改变上下两相的电荷性，从而改变两相间电位差，加速TFF的萃取和分离速度，增加TFF在上相中的含量，缩短两相分相时间，黄酮溶解度下降的同时，分配系数增至50后降低。因此24% C 2H 5OH-18% （NH 4） 2SO 4双水相萃取体系NaCl质量分数为2.5%。
2.3 响应面法优化TFF提取试验设计与分析
2.3.1 试验结果与模型建立
根据Box-Behnken试验设计原理，做三因素三水平共17 个试验点（5 个中心点）的响应面分析试验（表1）。试验点可分为两大类：三变量各水平所构成12 个三维析因点；零点试验重复5 次，用以估计试验误差，TFF萃取率为响应值。
表1 响应面试验设计与结果
Taabbllee 11 AArrrraannggeemmeenntt aanndd rreessuullttss ooff rreessppoonnssee ssuurrffaaccee mmeetthhooddoollooggyy
试验号 A粗提液质量分数/% B pH C NaCl质量分数/% Y TFF萃取率/% 1 18 5 2.0 91.8 2 18 7 2.5 94.2 3 16 9 2.5 91.7 4 16 5 2.5 91.8 5 16 7 3.0 91.2 6 18 7 2.5 93.5 7 20 7 2.0 95.1 8 18 9 2.0 92.9 9 18 5 3.0 92.3 10 18 7 2.5 93.7 11 18 7 2.5 94.8 12 20 9 2.5 95.5 13 18 7 2.5 95.2 14 20 5 2.5 96.4 15 20 7 3.0 95.4 16 18 9 3.0 94.9 17 16 7 2.0 91.9
表2 萃取率影响因子二次回归模型方差分析
TTaabbllee 22 AAnnaallyyssiiss ooff vvaarriiaannccee ooff qquuaaddrraattiicc rreeggrreessssiioonn mmooddeell ffoorr TTFFFF
注：*.差异显著，P＜0.05；**.差异极显著，P＜0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 37.853 32 9 4.205 92 4.902 42 0.023 9* A粗提液质量分数 31.205 00 1 31.205 00 36.372 49 0.000 5** B pH 0.911 25 1 0.911 25 1.062 15 0.337 0 C NaCl质量分数 0.551 25 1 0.551 25 0.642 54 0.449 1 AB 0.160 00 1 0.160 00 0.186 50 0.678 8 AC 0.250 00 1 0.250 00 0.291 40 0.606 1 BC 0.562 50 1 0.562 50 0.655 65 0.444 7 A 2 0.000 03 1 0.000 03 0.000 03 0.995 7 B 2 0.769 50 1 0.769 50 0.896 93 0.375 1 C 2 3.242 13 1 3.242 13 3.779 02 0.093 0总残差 6.005 50 7 0.857 93失拟项 3.937 50 3 1.312 50 2.538 68 0.194 9纯误差 2.068 00 4 0.517 00总和 43.858 82 16
由表2分析可知，（P=0.023 9＜0.05）二次回归方程模型显著，失拟项不显著（P=0.194 9＞0.05）。通过该模型的方差分析可知，A对萃取率的影响极显著，B和C对萃取率的影响不显著，即pH值和NaCl的质量分数对萃取率的影响不显著，而粗提液质量分数显著响双水相萃取体系的TFF萃取率。各因素对TFF萃取率影响效应的大小依次为粗提液质量分数＞pH值＞NaCl质量分数。经回归模型拟合，三因素对响应值Y的影响可用以下多元二次方程表示：
Y=94.28+1.98A+0.34B+0.26C－0.2AB+0.25AC+ 0.38BC－0.002 5A 2－0.43B 2－0.88C 2
2.3.2 各因素交互作用响应面与优化验证
图 6 各因素交互作用对萃取率影响的响应面分析
Fig.6 Response surface analysis of the effect of process parameters on the extraction effi ciency of TFF
如图6所示，萃取率的响应面开口向下，萃取率和双水相萃取体系中的3个制约因素呈现明显的二次抛物线关系。随着每个因素水平的增加，响应值萃取率也在增大。根据浸提动力学理论，随着三因素的增加，响应值萃取率出现最大值，后随着三因素水平继续增加，萃取率呈现不同斜率的下降，该回归模型具有稳定点，稳定点是最大值。借助Design-Expert 8.0中多元二次回归模型对TFF萃取率进行估算，对二次抛物线函数模型进行极值分析，预测三因素的最佳组合坐标Z（1，0.32，0.36），即粗提液质量分数20%、pH 7.64、NaCl质量分数2.68%，此时模型预测最大值Y=96.366 7%（P=0.994）。在Z坐标条件下进行3 组重复实验，TFF萃取率平均高达到98.8%，表明该回归模型能准确预测TFF双水相萃取情况。
2.4 TFF体外抑菌活性结果
2.4.1 TFF体外抑菌直径及抑菌率测定结果
表3 6 种供试菌种在不同剂量条件下的抑菌圈直径和抑菌率
Table 3 Diameter of inhibition zone and bacteriostasis rate of six
注：低剂量为10.24 mg/mL；中剂量为20.48 mg/mL；高剂量为40.96 mg/mL。
菌种抑菌圈直径/mm 抑菌率/%空白 3.28 mg/mL苯甲酸钠 低剂量 中剂量 高剂量 低剂量 中剂量 高剂量E. coli ACCC11864 7.00±0.00 13.51±0.3210.32±0.32 10.89±0.05 12.37±0.15 51.00 59.75 82.49 Salmonella ACCC01319 7.00±0.00 14.37±0.0210.44±0.12 11.08±0.02 13.42±0.13 46.68 55.36 87.11 S. aureus ACCC01332 7.00±0.00 14.42±0.3510.22±0.45 11.30±0.35 13.09±0.73 43.40 57.95 82.08 Bacillus subtilis ACCC01430 7.00±0.00 13.02±0.1210.68±0.42 12.04±0.38 12.94±0.63 61.13 83.72 98.67 Penicillium ACCC30287 7.00±0.00 14.67±0.57 8.78±0.52 9.39±0.69 10.79±0.55 23.21 31.16 49.41 Aspergillus niger ACCC30005 7.00±0.00 15.85±0.43 8.83±0.34 9.55±0.75 11.78±0.39 20.68 28.81 54.01
如表3所示，TFF对6 种供试菌种均表现出良好的抑菌活性，而且6 种供试菌种对TFF的耐受性个体差异明显。高剂量作用下抑菌圈直径可达（12.94±0.63）mm，和对照苯甲酸钠作用抑菌圈直径（13.02±0.12）mm相近，抑菌率高达98.67%，说明其对枯草芽孢杆菌菌丝生长抑制作用很强；TFF对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球抑制作用次之；对青霉和黑曲霉抑制作用最弱，低剂量作用下，抑菌圈直径仅为（8.83±0.34）mm，抑菌率只有20.68%。总之，各测试菌的抑菌圈直径大小随质量浓度的增大而增大，抑菌率与TFF质量浓度呈正相关，TFF对细菌的抑制活性要强于其对真菌的作用。
2.4.2 TFF体外抑菌MIC和MBC测定结果
表 4 6 种供试菌种MIC和MBC测定结果
Table 4 Minimal inhibitory concentration and minimal bactericidal
注：+.有抑菌现象，－.无抑菌现象。
菌种 MIC/（mg/mL） MBC/ （mg/mL）0.00 0.20 0.39 0.78 1.56 3.12 6.25 12.50 25.00 50.00 E. coli ACCC11864 － － － － － － － + + + 25.00 Salmonella ACCC01319 － － － － － － + + + + 12.5 S. aureus ACCC01332 － － － － － － + + + + 12.5 Bacillus subtilis ACCC01430 － － － － + + + + + + 3.12 Penicillium ACCC30287 － － － － － － － + + + 25.00 Aspergillus niger ACCC30005 － － － － － － － + + + 25.00
如表4所示，TFF对枯草芽孢杆菌的MIC为1.56 mg/mL，对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC为6.25 mg/mL，对大肠杆菌、青霉和黑曲霉的MIC为12.50 mg/mL。表明TFF对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有很强的抑制活性，特别对枯草芽孢杆菌的抑作用最强，大肠杆菌、青霉和黑曲霉对其抑制作用耐受性较强。
实验以大吴风草为原料，利用C 2H 5OH-（NH 4） 2SO 4双水相技术对TFF进行萃取条件的优化，重点分析粗提液质量分数、pH值和NaCl质量分数3 个因素的作用规律。响应面试验方差分析表明，粗提液质量分数显著影响双水相萃取体系中TFF萃取率，而pH值和NaCl质量分数对萃取率影响不显著。响应面优化24% C 2H 5OH-18% （NH 4） 2SO 4双水相萃取体系最佳配置组合坐标Z（1，0.32，0.36），即粗提液质量分数20%、pH 7.64、NaCl质量分数2.68%，萃取率模型预测最大值为96.366 7%（P=0.994）。验证重复实验证明Box-Behnken设计法得到的模型拟合程度高，准确有效，用于双水相体系的优化筛选是实践可行的。
TFF对6 种供试菌均表现出良好的抑菌活性，而且6 种供试菌种对TFF的耐受性个体差异明显，对枯草芽孢杆菌抑制活性较强，具有很高的开发潜力；对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球抑制活性次之，而对青霉和黑曲霉抑制活性最弱。各测试菌种的抑菌圈直径大小随质量浓度的增大而增大，TFF抑菌率与质量浓度呈正相关，TFF对细菌的抑制活性要明显强于其对真菌的作用。MIC和MBC实验也证明TFF对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有很强的抑制活性，特别对枯草芽孢杆菌的抑制活性最强，大肠杆菌、青霉和黑曲霉对其抑制作用耐受性较强。
参考文献：
［1］ 裴凌鹏， 惠伯棣， 金宗濂， 等. 黄酮类化合物的生理活性及其制备技术研究进展［J］. 食品科学， 2004， 25（2）: 203-207.
［2］ 莫开菊， 柳圣， 程超. 生姜黄酮的抗氧化活性研究［J］. 食品科学，2006， 27（9）: 110-115.
［3］ HSIEH T J， LU L H， SU C C. NMR spectroscopic， mass spectroscopic，X-ray crystallographic， and theoretical studies of molecular mechanics of natural products: farformolide B and sesamin［J］. Biophysical Chemistry， 2005， 114（1）: 13-20.
［4］ KIM J Y， OH T H， KIM B J， et al. Chemical composition and. antiinflammatory effects of essential oil from Farfugium japonicum fl ower［J］. Journal of Oleo Science， 2008， 57（11）: 623-628.
［5］ DIVYASHREE R， AMIT K R， FRANCESCA G， et al. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy［J］. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology， 2013， 45（12）: 2821-2831.
［6］ 张勇， 曾鹏， 贾琦， 等. 大吴风草化学成分与药理活性研究进展［J］.中草药， 2012， 43（5）: 1009-1016.
［7］ 刘磊磊， 李秀娜， 赵帅. 双水相萃取在中药活性成分提取分离中的应用进展［J］. 中草药， 2015（5）: 766-773.
［8］ FEDERICO R R， JORGE B， OSCAR A， et al. Aqueous two-phase affi nity partitioning systems: current applications and trends［J］. Journal of Chromatography A， 2012， 1244: 1-13.
［9］ 卢晓霆， 王田田. 响应面法优化双水相提取葡萄皮多酚工艺［J］. 食品科技， 2013， 38（10）: 217-223.
［10］ AGUILAR O， RITO-PALOMARES M. Aqueous two-phase systems strategies for the recovery and characterization of biological products from plants［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2010，90（9）: 1385-1392.
［11］ BI P Y， DONG H R， YUAN Y C. Application of aqueous two-phase fl otation in the separation and concentration of puerarin from Puerariae extract［J］. Separation and Purifi cation Technology， 2010， 75（3）: 402-406.
［12］ LIU X L， MU T H， SUN H N， et al. Optimisation of aqueous twophase extraction of anthocyanins from purple sweet potatoes by response surface methodology［J］. Food Chemistry， 2013， 141（3）: 3034-3041.
［13］ 徐春明， 李婷， 王英英， 等. 响应曲面法优化微波辅助双水相提取苦荞麦麸皮中黄酮类化合物的工艺研究［J］. 中国食品添加剂，2014（2）: 80-86.
［14］ 赵强， 索有瑞， 李天才， 等. 响应面法优化苦荞皮中总黄酮超声波提取工艺［J］. 食品科学， 2014， 35（16）: 64-70. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201416012.
［15］ 汪建红， 廖立敏， 王碧. 乙醇-硫酸铵双水相体系提取柠檬渣中总黄酮研究［J］. 华中师范大学学报: 自然科学版， 2013， 47（1）: 78-81.
［16］ SHEN T， YANG X， WANG X R， et al. Eremophilane sesquiterpenoids from Farfugium japonicum［J］. Bulletin-Korean Chemical Society，2011， 32（1）: 350-352.
［17］ 滕毅， 吴琼， 何磊磊， 等. 超声波协同乙醇-磷酸氢二钾双水相体系萃取密蒙花黄色素［J］. 食品工业科技， 2012， 33（20）: 273-275.
［18］ SHENG Z L， WAN P F， DONG C L， et al. Optimization of total fl avonoids content extracted from Flos Populi using response surface methodology［J］. Industrial Crops and Products， 2013， 43: 778-786.
［19］ 王昌涛， 孙啸涛， 周雪. 响应面分析法优化雪灵芝黄酮提取工艺［J］. 食品科学， 2013， 34（14）: 91-95. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201314018.
［20］ ROOSTA M， GHAEDI M， DANESHFAR A， et al. Experimental design based response surface methodology optimization of ultrasonic assisted adsorption of safaranin O by tin sulfi de nanoparticle loaded on activated carbon［J］. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy， 2014， 122: 223-231.
［21］ 刘晓飞， 刘宁， 张娜， 等. 超声波辅助酶法提取甜玉米穗轴黄酮及抑菌性检测［J］. 食品科学， 2014， 35（20）: 79-82. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201420016.
［22］ SALEM M Z M， ALI H M， El-SHANHOREY N A， et al. Evaluation of extracts and essential oil from Callistemon viminalis leaves: antibacterial and antioxidant activities， total phenolic and flavonoid contents［J］. Asian Pacifi c Journal of Tropical Medicine， 2013， 6（10）: 785-791.
［23］ 顾采琴， 谢琳琳， 张织芬， 等. 香蕉皮黄酮的分离纯化及抑菌活性研究［J］. 食品科学， 2013， 34（16）: 98-102. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201316020.
［24］ KIM D I， PARK J D， KIM S G， et al. Screening of some crude plant extracts for their acaricidal and insecticidal efficacies［J］. Journal of Asia-Pacifi c Entomology， 2005， 8（1）: 93-100.
［25］ LIU F， WANG D， LIU W， et al. Ionic liquid-based ultrahigh pressure extraction offivetanshinones from Salvia miltiorrhiza Bunge［J］. Separation and Purifi cation Technology， 2013， 110: 86-92.
Optimization of Aqueous Two-Phase Extraction of Total Flavonoids from Farfugium japonicum （L. f.） Kitam by Response Surface Methodology and Antibacterial Activity
CHEN Jianzhong
1，2， GE Shuilian
1， ZAN Lifeng
1， XING Haochun
1， FU Jing
1， WANG Gengxian
1
（1. College of Life Science and Engineering， Handan College， Handan 056005， China；2. Wild Resources Plant Research Center of South Hebei Mt. Taihang， Handan 056005， China）
Abstract：Objective: To optimize the aqueous phase extraction system for total fl avonoids （TFF） from the aboveground parts of Farfugium japonicum and to study the antibacterial activity of the extract. Methods: Ultrasonic was used to assist C 2H 5OH-（NH 4） 2SO 4aqueous two-phase extraction of TFF， and the multivariate quadratic regression model using TFF yield as the response variable was established based on a Box-Behnken experimental design involving three factors at three levels each and subjected to analysis of variance （ANOVA） and response surface analysis. The Kirby-Bauer disk diffusion method was used to determine the diameters of inhibition zone of six tested strains and the minimum inhibitory concentration （MIC）and minimum bactericidal concentration （MBC） values were compared to study their antibacterial activities. Results: The 24% C 2H 5OH-18% （NH 4） 2SO 4aqueous two-phase extraction system was found to be optimal to extract TFF. The results of ANOVA showed that mass fraction of TFF in crude ethanolic extracts signifi cantly affected the extraction rate of TFF （P = 0.023 9 ＜ 0.05）， but the effects of pH and NaCl concentration in the aqueous two-phase system were not signifi cant. The optimal extraction conditions were determined as follows: crude extract concentration， 20%； pH， 7.64； and NaCl concentration， 2.68%. Under these conditions， the maximum extraction rate of 96.366 7% （P = 0.994） was obtained. The inhibitory effect of TFF on Bacillus subtilis was the strongest with a percentage inhibition of 98.67% at high dose and an MIC of 1.56 mg/mL， followed by Salmonella， Staphylococcus aureus and Escherichia coli， and the inhibitory effects on Penicillium and Aspergillus niger were the weakest. Conclusions: The fl avonoid concentration of crude extracts had greater infl uence on the extraction rate of TFF than pH and NaCl. TFF showed obvious antibacterial activity against the six tested strains. The percentage inhibition was positively correlated to TFF concentration. The antibacterial activity of TFF was relatively stronger against bacteria than fungi.
Key words：response surface methodology； aqueous two-phase extraction； total fl avonoids； F. japonicurn （L. f.） Kitam；antimicrobial activity
收稿日期：2015-05-06
基金项目：河北省科技计划项目（13222907）；邯郸市科技局项目（1422104057-2）；邯郸学院校级项目（15202）
作者简介：陈建中（1978—），男，副教授，硕士，研究方向为天然食药植物活性物质分析。E-mail：cjzhong@126.com
中图分类号：TS202.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）24-0057-06
doi：10.7506/spkx1002-6630-201524010