苏 伟，杨旭卉，王 瑜，母应春，邱树毅
（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）
摘 要：以新鲜猪皮为原料，基于凝胶特性以羟脯氨酸含量为指标，对影响胃蛋白酶酶解过程的各个因素进行研究，通过Box-Behnken设计优化酶解工艺；以清除O 2 －·、·OH、H 2O 2能力和DNA损伤保护作用为指标研究酶解产物的抗氧化功能。结果表明：最佳酶解条件为加酶量0.25%、料液比1∶2（g/mL）、酶解时间1.65 h、酶解温度41.15 ℃，在此酶解条件下其产物清除O 2 －·的IC 50值为20.19 mg/mL；清除·OH的IC 50值为6.36 mg/mL；清除H 2O 2的IC 50值为0.65 mg/mL；对DNA损伤保护作用的IC 50值为1.86 mg/mL。
关键词：猪皮；胶原蛋白；胃蛋白酶；抗氧化性；DNA损伤
猪皮由表皮层、真皮层、皮下结缔组织构成，其主要成分是水分、蛋白质、脂肪及矿物质，其中约含有水分65%、蛋白质33%、脂肪1%、矿物质0.5%。猪皮中的胶原蛋白含量约为87.7% ［1］。猪皮胶原蛋白相对分子质量为30万左右，含有18 种氨基酸，其中甘氨 酸占1/3，丙氨酸占1/9，脯氨酸和羟脯氨酸占2/9，必需氨基酸共占1/8 ［2］。胶原蛋白是一种天然高分子可溶性蛋白，胶原蛋白不仅可用于改善食品的弹性、黏稠度和稳定性等，而且可作为抗氧化剂和血管收缩素转换酵素抑制剂应用于食品、医药、化妆品等工业中 ［3-4］。国内外有不少研究猪皮胶原的文献报道，但大多侧重于胶原的结构和生化性质的研究 ［5-6］，在提取工艺方面多集中在已水解的胶原蛋白或大分子明胶的工艺上 ［7］。Senaratne等 ［8］从棕色脊椎蟾鱼鱼皮的生产废料中分离提取出大量的胶原蛋白；Alemán等 ［9］选用多种酶酶解的方法从乌贼的内外表皮中提取出具有生物活性（抗高血压、抗癌、抗氧化活性）的酶解产物；Zhang Junhui等 ［10］以脱脂大米胚乳为原料，采用色谱分析和液相色谱-质谱联用的方法分离得到具有较强抗氧化活性的蛋白肽；羟脯氨酸的含量是衡量胶原蛋白品质的重要指标，且L-羟脯氨酸（Pro-OH）是胶原蛋白的特征组分 之一，含量约为9%。在体内羟基脯氨酸由脯氨酸酰羟化酶羟基化而成，其游离的4-羟基能清除O 2 －· 和·OH，左瑞雅等 ［11］研究得出羟脯氨酸具有一定的抗氧化能力。目前对于猪皮胶酶解产物及其抗氧化活性研究比较薄弱，本实验以新鲜猪皮为原料，基于凝胶特性以羟脯氨酸含量为指标，对影响胃蛋白酶酶解过程的各个因素进行研究，通过Box-Behnken设计优化酶解工艺；且以清除O 2 －·、·OH、H 2O 2和DNA损伤的保护作用为指标探究酶解产物的抗氧化特性， 旨在为猪皮胶原特性及功能特性在食品加工综合利用提供一定的理论依据。
1.1 材料与试剂
猪皮、米醋 市购；胃蛋白 北京索莱宝生物科技有限公司；色谱纯小牛胸腺DNA、鲁米诺 美国Sigma公司；色谱纯邻苯三酚、邻菲啰啉、抗坏血酸、氯胺T试剂、对二甲氨基苯甲醛试剂、羟脯氨酸标液 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
电子分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FW135型粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；TDL8M台式低速冷冻离心机 长沙湘仪贝克仪器仪表有限公司；BPCL-2-JZ-TGC微弱发光仪 北京建新力拓科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 原料预处理
市购新鲜猪皮，刮去表面脂肪，置于沸水中预煮3～5 min后取出，冷却后将其切成长宽为1 cm左右的小方块，用高速粉碎机打碎成颗粒状，冷冻备用 ［12］。预实验采用30%的米醋可以满足胃蛋白酶的酶解pH值，且口感适合，因此本实验采用米醋与水体积比3∶7作为酶解的液体 ［13-14］。
1.3.2 酶法制备猪皮胶工艺流程
实验所用冻干粉是样品通过恒温酶解后，90～100 ℃灭酶5 min，离心直接取其澄清透明的上清液冷却至20 ℃左右即得猪皮胶冻，再经过真空冷冻干燥得到冻干粉。
1.3.3 羟脯氨酸标准曲线的绘制
按照GB/T 9695.23—2008《肉与肉制品：羟脯氨酸含量测定》绘制羟脯氨酸标准曲线。
1.3.4 酶解工艺优化试验设计
研究胃蛋白酶在30%的米醋溶液中猪皮的酶解条件，以羟脯氨酸含量为指标，以不同的酶解时间、酶解温度、加酶量、料液比为因素条件，在单因素试验基础上，通过Box-Behnken设计优化酶解工艺。
1.3.4.1 单因素试验
考察胃蛋白酶酶解胶原蛋白的酶解时间、酶解温度、加酶量、料液比4 个因素对猪皮胶中羟脯氨酸含量的影响。按照料液比1∶3加入30%的米醋溶液，加酶量0.3%、酶解温度40 ℃的条件下，研究酶解时间（1、2、3、4、5 h）对羟脯氨酸含量的影响；按照料液比1∶3加入30%的米醋溶液，加酶量0.3%、酶解时间3 h的条件下，研究酶解温度（30、35、40、45、50 ℃）对羟脯氨酸含量的影响；按照料液比1∶3加入30%的米醋溶液，酶解温度40 ℃、酶解时间3 h的条件下，研究加酶量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）对羟脯氨酸含量的影响；按照加酶量0.3%、酶解温度40 ℃、酶解时间3 h的条件下，研究料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）对羟脯氨酸含量的影响。
1.3.4.2 响应面试验
在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计原理，以羟脯氨酸含量为响应值，以酶解时间、酶解温度、加酶量、料液比4 个因素为自变量，设计四因素三水平共29 组的响应面分析试验，优化酶法制备猪皮胶的工艺条件，试验因素与水平如表1所示。1.3.5 猪皮胶原蛋白酶解液的抗氧化功能特性
表1 酶解制备猪皮胶工艺优化设计因素水平
TTaabbllee 11 FFaaccttoorrss aanndd tthheeiirr ccooddeedd lleevveellss uusseedd iinn BBooxx--BBeehhnnkkeenn ddeessiiggnn ffoorr ooppttiimmiizzaattiioonn ooff eennzzyymmaattiicc hhyyddrroollyyssiiss ooff ppoorrcciinnee sskkiinn
因素 水平－1 0 1 X 1加酶量/% 0.1 0.2 0.3 X 2料液比（g/mL） 1∶2 1∶3 1∶4 X 3酶解时间/h 1 2 3 X 4酶解温度/℃ 35 40 45
按照响应面试验得出的胃蛋白酶酶解最佳工艺条件制备出猪皮胶冻干粉，以O
－
2·清除作用、·OH清除作用、H
2O
2清除作用、DNA损伤的保护作用为指标测其抗氧化活性。
1.3.5.1 ·清除作用的测定
采用邻苯三酚-Luminol化学发光体系测定法 ［15］，具体为：用0.05 mol/L的NaOH溶液配制0.05 mol/L鲁米诺溶液，避光保存，用前再用双蒸水稀释成1 mmol/L。邻苯三酚用1 mmol/L盐酸配成0.01 mol/L的溶液，于4 ℃冰箱中保存，用前用双蒸水稀释成6.25×10 －4mol/L溶液。0.05 mol/L pH 10.2的Na 2CO 3-NaHCO 3缓冲液（含乙二胺四乙酸0.1 mmol/L）用前现配，并与1 mmol/L鲁米诺溶液以体积比2∶1进行混合，得到鲁米诺-碳酸盐缓冲液混合物。测量时，依次向发光池中注入10 μL样品溶液、50 μL 6.25×10 －4mol/L邻苯三酚和 0.94 mL鲁米诺-碳酸缓冲液后，立即启动反应，反应温度为30 ℃，每间隔3 s记录，测定100 s的总发光强度。（对照取相同情况下不加入样品溶液，本底为未加邻苯三酚的发光强度）。
1.3.5.2 ·OH清除作用的测定
采用邻菲罗啉-Cu 2+-VC-H 2O 2体系 ［16］。向测量管中依次加入50 μL待测样品、1 mmol/L CuSO 4溶液50 μL、1 mmol/L邻菲罗啉50 μL和0.05 mol/L硼砂溶液700 μL充分混匀，然后再加入100 μL 1 mmol/L抗坏血酸溶液和50 μL 0.15% H 2O 2溶液，立即启动系统，间隔3 s记数，记录360 s内化学发光动力学曲线。
1.3.5.3 对H 2O 2清除作用的测定
采用双氧水-鲁米诺化学发光体系 ［17］。向发光池中加入样品溶液（空白对照为样品缓冲液）50 μL、0.15 mol/L H 2O 250 μL和0.1 mmol/L鲁米诺-0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.4）的混合液（体积比为1∶17） 900 μL，启动发光系统，每间隔3 s记数，记录120 s内发光强度，本底为不加双氧水时的发光值。
1.3.5.4 对DNA损伤保护作用的测定
采用CuSO 4-Phen-VC-H 2O 2-DNA 化学发光体系 ［18］。试剂配制方法：用去离子水配制0.1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液；再用缓冲液配制DNA-Cu 2+-Phen体系，配制后DNA质量浓度为3 μg/mL，CuSO 4·5H 2O浓度为7.5×10 －5mol/L，Phen浓度为5.25×10 －4mol/L。测定方法：向发光池中加入样品溶液（空白对照为样品缓冲液）100 μL、DNA-Cu 2+-Phen体系溶液800 μL、4.2× 10 －3mol/L VC 100 μL和3%的H 2O 2200 μL，启动发光装置，间隔3 s记数，记录480 s内发光强度，本底为不加双氧水时的发光值。
1.3.5.5 清除率计算
所有实验均重复3 次，取平均值，按照下式计算清除率：
式中：CL 空白为空白对照组的相对发光强度；CL 本底为本底组相对发光强度；CL 样品为样品组相对发光强度。
以清除率为横坐标，样品质量浓度为纵坐标，绘出曲线并计算出清除率为50%时的质量浓度IC 50，用来衡量样品对自由基的清除能力。IC 50值越小，表明样品清除自由基能力越强。
2.1 羟脯氨酸标准曲线绘制
以羟脯氨酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出回归方程为y=0.307 2x+0.012 2，相关系数R 2=0.997 4。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 酶解时间对猪皮胶中羟脯氨酸含量的影响
图 1 酶解时间对猪皮胶中羟脯氨酸含量的影响
Fig.1 Effects of hydrolysis time on the content of hydroxyproline in pig skin collagen
从图1可以看出，随着酶解时间的延长，羟脯氨酸含量增加，在2 h达到最大值4.812%。随着时间延长水解底物质量浓度逐渐减小，酶的特异性催化位点减少，即水解过程中酶逐渐失活 ［19］。由于在反应初期，酶活力及底物浓度比较高，有利于酶解反应进行，但随着时间的延长，猪皮胶中的胶原蛋白继续酶解为其他肽类物质，胶原蛋白随着酶解时间的延长将逐渐减少，羟脯氨酸含量也随之减少，因此酶解的最佳时间为2 h。
2.2.2 酶解温度对猪皮胶中羟脯氨酸含量的影响
图 2 酶解温度对猪皮胶中羟脯氨酸含量的影响
Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the content of hydroxyproline in pig skin collagen
如图2所示，在30～40 ℃之间，随着酶解温度的升高，羟脯氨酸含量呈上升的趋势，当酶解温度高于40 ℃时，羟脯氨酸含量呈现出下降的趋势，在温度为40 ℃时达到了最高5.389%。由于酶解反应，胃蛋白酶本身也是蛋白质，其对温度的影响比较敏感，当酶解温度为胃蛋白酶的最佳酶解温度时，其活力最强，对原料的酶解作用也最强；当酶解温度高于40 ℃时，高温使酶变性，酶活力会下降，因此最适温度为40 ℃。
2.2.3 加酶量对猪皮胶中羟脯氨酸含量的影响
如图3所示，加酶量在0.1%～0.3%范围，呈现上升趋势，加酶量在0.3%时羟脯氨酸含量为4.849%。由于底物蛋白与酶的结合位点还没被完全占据，形成的中间复合物的量也比较少，随着加酶量的增加，羟脯氨酸含量呈现出上升趋势，但随着酶的不断加入，底物的蛋白结合位点被 逐渐占据，此时便会导致酶解反应缓慢，出现下降的趋势可能是因为酶解产生的胶原蛋白继续酶解后导致羟脯氨酸含量下降，因此最适加酶量为0.3%。
图 3 加酶量对猪皮胶中羟脯氨酸含量的影响
Fig.3 Effect of enzyme concentration on the content of hydroxyproline in pig skin collagen
2.2.4 料液比对猪皮胶中羟脯氨酸含量的影响
图 4 料液比对猪皮胶中羟脯氨酸含量的影响
Fig.4 Effects of ratio of material to liquid on the content of
hydroxyproline in pig skin collagen
从图4可以看出，随着溶剂用量的增大，羟脯氨酸含量呈现出先增大后减小的趋势，在料液比为1∶3时羟脯氨酸含量为5.378%。酶法制备猪皮胶是在30%的醋酸水溶液中进行的，反应过程是酶促反应，水在反应中有利于分子的扩散和运动。当溶剂用量较小时，溶液中的分子扩散很慢，且分布不均；在溶剂用量较高时，酶被稀释，酶分子与原料蛋白的结合也会受到影响，因此最适料液比为1∶3。
2.2.5 胃蛋白酶酶解猪皮胶原蛋白工艺响应面优化
采用Box-Behnken试验设计原理，以羟脯氨酸含量为响应值，以加酶量（X 1）、料液比（X 2）、酶解时间（X 3）、酶解温度（X 4）4 个因素为自变量，设计四因素三水平的响应面试验。
由表2可以看出，一次项X 1影响不显著（P＞0.05），X 2影响极显著（P＜0.01），X 3和X 4影响不显著（P＞0.05），交互作用项X 1X 3、X 1X 4、X 2X 3、X 2X 4和X 3X 4交互作用不显著（P＞0.05），X 1X 2影响显著（P＜0.05）；二次项X 1 2、X 3
2影响极显著（P＜0.01），X 4 2影响显著（P＜0.05），X 2 2影响不显著（P＞0.05）。
表2 回归方程各项回归系数显著性检验
Ta ble 2 Signififi cance test of regression coeffifi cients in regression equation
系数项 回归系数 自由度 标准差 95%置信下限 95%置信上限 t值 P值截矩 4.39 1 0.087 26 4.205 574 4.579 882 5.810 782 0.001 1 X 1加酶量 0.091 1 0.056 326 －0.030 14 0.211 475 2.591 073 0.129 8 X 2料液比 －0.3 1 0.056 326 －0.416 26 －0.174 64 27.513 71 0.000 1 X 3酶解时间 －0.11 1 0.056 326 －0.227 84 0.013 78 3.610 534 0.078 2 X 4酶解温度 －0.031 1 0.056 326 －0.151 87 0.089 745 0.304 131 0.590 0 X 1X 2 －0.27 1 0.097 56 －0.483 58 －0.065 09 7.907 268 0.013 8 X 1X 3 －8.35×10 －3 1 0.097 56 －0.217 59 0.200 899 0.007 319 0.933 0 X 1X 4 －0.024 1 0.097 56 －0.232 95 0.185 536 0.059 058 0.811 5 X 2X 3 0.072 1 0.097 56 －0.136 86 0.281 63 0.550 497 0.470 4 X 2X 4 －0.12 1 0.097 56 －0.329 44 0.089 054 1.517 748 0.238 3 X 3X 4 －0.082 1 0.097 56 －0.290 91 0.127 584 0.700 62 0.416 6 X1 2 －0.35 1 0.076 612 －0.513 94 －0.185 31 20.826 76 0.000 4 X2 2 0.025 1 0.076 612 －0.139 0.189 637 0.109 235 0.745 9 X3 2 －0.29 1 0.076 612 －0.456 24 －0.127 61 14.519 13 0.001 9 X4 2 －0.23 1 0.076 612 －0.392 55 －0.063 92 8.875 344 0.010 0
表3 回归方程各项的方差分析
TTable 3 Analysis of variance of regression equation
方差来源 平方和 自由度 均方和 F值 P值 显著性模型 3.097 166 14 0.221 226 5.810 782 0.001 1 * X 1加酶量 0.098 646 1 0.098 646 2.591 073 0.129 8 X 2料液比 1.047 493 1 1.047 493 27.513 71 0.000 1 ** X 3酶解时间 0.137 459 1 0.137 459 3.610 534 0.078 2 X 4酶解温度 0.011 579 1 0.011 579 0.304 131 0.590 0 X 1X 2 0.301 043 1 0.301 043 7.907 268 0.013 8 * X 1X 3 0.000 279 1 0.000 279 0.007 319 0.933 0 X 1X 4 0.002 248 1 0.002 248 0.059 058 0.811 5 X 2X 3 0.020 958 1 0.020 958 0.550 497 0.470 4 X 2X 4 0.057 783 1 0.057 783 1.517 748 0.238 3 X 3X 4 0.026 674 1 0.026 674 0.700 62 0.416 6 X1 2 0.792 909 1 0.792 909 20.826 76 0.000 4 ** X2 2 0.004 159 1 0.004 159 0.109 235 0.745 9 X3 2 0.552 768 1 0.552 768 14.519 13 0.001 9 ** X4 2 0.337 899 1 0.337 899 8.875 344 0.010 0 *残差 0.533 003 14 0.038 072失拟项 0.432 233 10 0.043 223 1.715 713 0.317 8 不显著纯误差 0.100 77 4 0.025 193总和 3.630 169 28 R 2=0.853 2 R 2 Adj=0.706 3
表3 回归方程各项的方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression equation
方差来源 平方和 自由度 均方和 F值 P值 显著性模型 3.097 166 14 0.221 226 5.810 782 0.001 1 * X 1加酶量 0.098 646 1 0.098 646 2.591 073 0.129 8 X 2料液比 1.047 493 1 1.047 493 27.513 71 0.000 1 ** X 3酶解时间 0.137 459 1 0.137 459 3.610 534 0.078 2 X 4酶解温度 0.011 579 1 0.011 579 0.304 131 0.590 0 X 1X 2 0.301 043 1 0.301 043 7.907 268 0.013 8 * X 1X 3 0.000 279 1 0.000 279 0.007 319 0.933 0 X 1X 4 0.002 248 1 0.002 248 0.059 058 0.811 5 X 2X 3 0.020 958 1 0.020 958 0.550 497 0.470 4 X 2X 4 0.057 783 1 0.057 783 1.517 748 0.238 3 X 3X 4 0.026 674 1 0.026 674 0.700 62 0.416 6 X1 2 0.792 909 1 0.792 909 20.826 76 0.000 4 ** X2 2 0.004 159 1 0.004 159 0.109 235 0.745 9 X3 2 0.552 768 1 0.552 768 14.519 13 0.001 9 ** X4 2 0.337 899 1 0.337 899 8.875 344 0.010 0 *残差 0.533 003 14 0.038 072失拟项 0.432 233 10 0.043 223 1.715 713 0.317 8 不显著纯误差 0.100 77 4 0.025 193总和 3.630 169 28 R 2=0.853 2 R 2 Adj=0.706 3
由表3可知，回归模型是显著的（P=0.001 1＜0.05），模型R 2=0.853 2，说明该模型拟合程度良好，能够反映数据85.32%的有效性，失拟项F值为1.715 713（P= 0.317 8＞0.05），表明失拟项不显著，试验误差较小，用该模型进行酶解工艺参数优化的预测是可行的。通过用软件Design-Expert 8.0.6对表3中数据进行二次多元回归拟合，得以下回归方程：
编码回归方程：
Y=4.39+0.091X 1－0.30X 2－0.11X 3－0.031X 4－0.27X 1X 2－8.346×10 －3X 1X 3－0.024X 1X 4+0.072X 2X 3－0.12X 2X 4－0.082X 3X 4－0.35X 1 2+0.025X 2
2－0.29X 3
2－0.23X 4
2
实际值回归方程：
Y=－17.200 86+25.185 55X 1+0.919 08X 2+ 1.513 48X 3+0.838 41X 4－2.743 37X 1X 2－0.083 463X 1X 3－0.047 418X 1X 4+0.072 385X 2X 3－0.024 038X 2X 4－0.016 332X 3X 4－34.962 87X 1 2+0.025 321X 2
2－0.291 92X 3
2－9.129 54×10 －3X 4
2
响应面分析充分反映两个因素交互作用对响应值的影响，等高线图能直观反映各因素交互 作用的强弱，圆形表示交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著，响应面三维图则反应各酶解条件的交互作用 ［20］。用软件Design-Expert 8.0.6分析并绘制得出加酶量、料液比、酶解时间及酶解温度对响应值羟脯氨酸含量的交互影响的曲面图，各因素固定值为0水平值，结果如图5所示。
图 5 各因素对羟脯氨酸含量交互影响的响应面图
Fig.5 Response surface graphs showing the interactive effects of
hydrolysis conditions on hydroxyproline content
由图5可知，随着加酶量增加、酶解时间延长及酶解温度的升高，羟脯氨酸含量呈先增大后减小的趋势；随着溶剂用量的增大，羟脯氨酸含量下降。用软件Design-Expert 8.0.6分析得出最佳工艺条件为：加酶量0.25%、料液比1∶2、酶解时间1.65 h、酶解温度41.15 ℃。按此条件所制备的猪皮胶冻的羟脯氨酸含量为4.849 5%。考虑到实验设备和实际操作的可行性，将上述最佳工艺条件改为：加酶量0.25%、料液比1∶2、酶解时间1.5 h、酶解温度40 ℃。在此条件下进行3 次验证性实验，测得猪皮胶冻的羟脯氨酸平均含量为4.832 5%。与理论预测值4.849 5%较为接近，说明模型的拟合程度较好，所拟合的回归方程对最佳工艺条件进行分析和预测非常可靠。
2.3 猪皮胶原蛋白酶解液的抗氧化活性
2.3.1 对O 2 －·的清除作用
图6 猪皮胶对OO
－
2·的清除作用
Fig.6 Superoxide anion free radical scavenging activity of porcine skin col lagen
在发光体系中，邻苯三酚首先在碱性条件下自动氧化，产生O 2 －·，向鲁米诺发起进攻。鲁米诺受到刺激后处于激发态，当其从激发态回到基态时伴有能量的释放，产生化学发光。抗氧化剂的加入可清除O 2 －·从而抑制化学发光。如图6所示，空白是未加样品产生的发光曲线，在2 s时达最大值，随后迅速下降。猪皮胶的加入使发光曲线发生变化，发光值降低。
图 7 猪皮胶对OO
－
2·的清除率拟合曲线
Fig.7 Concentration dependence of the superoxide anion radical scavenging effect of porcine skin collagen
如图7所示，随着样品质量浓度的升高，清除率上升，对该曲线进行拟合可得到清除率与质量浓度的曲线方程为：y=－0.029 7x 2+3.122 3x－0.937 （R 2=0.995 4）。当质量浓度为25 mg/mL时，抑制率为57.72%，通过方程可得到其对O 2 －·清除作用IC 50值为20.19 mg/mL。
2.3.2 ·OH的清除作用
图 8 猪皮胶对·OH的清除作用
Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activity of porcine skin collagen
在本体系中，Cu 2+被VC还原成Cu +，Cu +与H 2O 2在Fenton反应中产生·OH，·OH氧化Phen使Phen激发，Phen退激时产生化学发光。如图8所示，发光动力学曲线在24 s左右内迅速增加到最大发光强度，之后发光值开始较缓慢的下降，在200 s左右时，各发光曲线开始趋近于平行。
图 9 猪皮胶对·OH的清除率拟合曲线
Fig.9 Concentration dependence of the hydroxyl radical scavenging effect of porcine skin collagen
如图9所示，在质量浓度0～20 mg/mL范围内，清除率随质量浓度增加而升高，当质量浓度为50 mg/mL时，其清除率达到98.86%，对该曲线进行拟合可得到清除率与质量浓度的曲线方程为：y=23.187lnx+7.095 8 （R 2=0.993 8），通过方程可得到其对·OH清除作用IC 50值为6.36 mg/mL。
2.3.3 对H 2O 2的清除作用
图 10 猪皮胶对HH
2O
2的清除作用
Fig.10 Hydrogen peroxide scavenging activity of porcine skin collagen
在有氧和碱性条件下，H 2O 2可以氧化鲁米诺产生化学发光。由图10可知，相对发光强度在2 s左右可迅速达到最大值，然后急剧下降。在40 s的时候处于平缓状态。
图 11 猪皮胶对HH
2O
2的清除率拟合曲线
Fig.11 Concentration dependence of the hydrogen peroxide scavenging effect of porcine skin collagen
如图11所示，在质量浓度0～10 mg/mL范围内，清除率随质量浓度增加而升高，当质量浓度为50 mg/mL时，其清除率达到93.94%，对该曲线进行拟合可得到清除率与质量浓度的曲线方程为：y = 9.771 9lnx+54.134 （R 2=0.988 3），通过方程可得到其对H 2O 2清除作用的C 50值为0.65 mg/mL。
2.3.4 DNA损伤的保护作用
图 12 猪皮胶对DNA损伤保护的清除作用
Fig.12 DNA damage protection activity of porcine skin collagen
由图12可知，CuSO 4-Phen-VC-H 2O 2-DNA化学发光体系的动力学曲线出现两个峰，其中，第一个峰是由Fenton反应产生的·OH攻击Phen而出现的化学发光现象，第二个峰则是由·OH引起DNA损伤而产生的一个延迟化学发光峰。第二个峰出现不同程度的漂移，可能是启动微弱发光仪的时间快慢不一致。DNA的损伤可引发癌基因活化，抑癌基因失活，导致恶性肿瘤细胞增殖。
图 13 猪皮胶对DNA损伤的清除率拟合曲线
Fig.13 Concentration dependence of the protective effect of porcine skin collagen against DNA damage
如图13所示，在质量浓度0～10 mg/mL范围内，猪皮胶对DNA损伤的清除率随质量浓度增加而升高，当质量浓度为50 mg/mL时，其清除率达到96.52%，对该曲线进行拟合可得到清除率与质量浓度的曲线方程为：
y=14.573lnx+40.961（R 2=0.978 9），通过方程可得到其对DNA损伤保护作用的IC 50值为1.86 mg/mL。
本研究对最佳工艺参数条件下制备的猪皮胶的功能特性进行分析，基于凝胶特性以羟脯氨酸含量为指标，通过单因素、响应面试验优化胃蛋白酶酶解猪皮制备酶解液的最佳工艺参数为：加酶量0.25%、料液比1∶2、酶解时间1.65 h、酶解温度41.15 ℃。在此条件下，猪皮胶的羟脯氨酸平均含量4.832 5%，清除O 2 －·的IC 50值20.19 mg/mL，清除·OH的IC 50值6.36 mg/mL，清除H 2O 2的IC 50值0.65 mg/mL，DNA损伤保护作用的IC 50值1.86 mg/mL。
可以看出，本研究所采用的加酶高速搅拌低温制备猪皮胶具有较强的抗氧化能力。这是因为高速搅拌使原料质地较松散，酶解时有利于酶在底物间的充分分散，从而提高了酶解效率；另外本实验所使用的胃蛋白酶在酶解过程中保持了具有抗氧化活性的胶原蛋白肽结构的完整性，一些研究结果显示多肽的抗氧化活性取决于肽链中暴露的氨基酸侧链的性质和肽的氨基酸序列 ［21］，这与李诚 ［22］、张君慧 ［23］等的研究结果一致。猪皮胶在此工艺优化条件下具有较好的自由基清除能力，这为猪皮在天然抗氧化剂方面的研究提供了相关的理论依据。
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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Porcine Skin Based on Collagen Characteristics and Antioxidant Activity of the Resulting Hydrolysate
SU Wei， YANG Xuhui， WANG Yu， MU Yingchun， QIU Shuyi
（School of Liquor and Food Engineering， Guizhou University， Guiy ang 550025， China）
Abstract：In this study， the pepsin-catalyzed hydrolysis of fresh pig skin was optimized by response surface methodology （RSM） based on Box-Behnken design. The antioxidant activity of the resulting hydrolysates was studied by scavenging capacities against superoxide anion radical， hydroxyl radical and hydrogen peroxide and DNA damage protection activity. The optimal conditions for the enzymatic hydrolysis of porcine skin were determined to be hydrolysis at 41.15 ℃ for 1.65 h with an enzyme amount of 0.25% and solid/liquid ratio of 1:2. Under these conditions， the IC 50of the hydrolysate for scavenging of superoxide anion， hydroxyl radicals and hydrogen peroxide and for DNA damage protection were 20.19， 6.36，0.65， and 1.86 mg/mL， respectively.
Key words：pig skin； collagen； pepsin； antioxidant activity； DNA damage
中图分类号：TS202.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）24-0070-07
doi：10.7506/spkx1002-6630-201524012
收稿日期：2015-05-15
基金项目：黔西南州种草养羊产业发展省州科技合作专项（黔西南科号（2012）4）；毕节实验区科技项目（毕循专合字（2010）2K010）作者简介：苏伟（1974—），男，副教授，博士研究生，研究方向为食品加工与安全、畜产品品质安全控制。
E-mail：suwei1886@163.com