图 1 流动注射测定抗坏血酸实验装置示意图
Fig.1 Schematic diagram of the fl ow injection system for the determination of AA
石文兵，贺 薇
*，万帮江
（无机特种功能材料重庆市重点实验室，长江师范学院化学化工学院，重庆 408100）
摘 要：基于抗坏血酸抑制纳米二氧化铈-过氧化氢-鲁米诺体系的发光强度，建立流动注射化学发光法检测抗坏血酸含量的新方法。考察过氧化氢浓度、鲁米诺浓度、纳米二氧化铈质量浓度及pH值对发光强度的影响。在优化条件下，该方法对抗坏血酸检测的线性范围为0.001～1.0 μg/mL（r = 0.983 1），检出限（3 σ）为0.2 ng/mL，对质量浓度为1.0 μg/mL的抗坏血酸进行11 次平行测定，相对标准偏差为2.9%。该法已成功用于水果、果汁和蔬菜中抗坏血酸含量的测定，方法简单、灵敏、快速。
关键词：纳米二氧化铈；化学发光；抗坏血酸
抗坏血酸又称VC，是一种水溶性好的抗氧化剂，在氧化还原代谢反应中起调节作用，缺乏抗坏血酸可引起坏血病。然而，抗坏血酸不能在体内合成，人体的摄入主要来源于蔬菜、水果等天然食物中。其主要作用是提高免疫力，预防癌症、心脏病、中风，保护牙齿和牙龈等。另外，坚持按时服用抗坏血酸还可以使皮肤黑色素沉着减少，从而减少黑斑和雀斑，使皮肤白皙。鉴于其独特的营养和临床价值，准确测定食物中抗坏血酸的含量，对饮食健康、医疗保健都具有十分重要意义。
抗坏血酸常见的分析方法有高锰酸钾滴定法 ［1］、分光光度法 ［2-3］、比色法 ［4］、高效液相色谱法 ［5-8］、电化学法 ［9-14］、磷光法 ［15］、荧光法 ［16-17］、表面增强共振拉曼散射法 ［18］等。化学发光具有线性范围宽、灵敏度高、仪器设备简单的优点，已被用于抗坏血酸的分析。如基于抗坏血酸抑制鲁米诺-高碘酸-过氧化氢体系的化学发光构建了其化学发光分析法，该法具有较高的灵敏度（60 nmol/L） ［19］；Chen Hui等 ［20］利用抗坏血酸抑制过氧化氢-碳酸氢钠-CdSe/CdS量子点发光体系，建立了分析抗坏血酸的分析方法（灵敏度为67 nmol/L）。本实验合成了一种水溶性好的纳米二氧化铈，将其催化鲁米诺-过氧化氢发光体系，基于抗坏血酸抑制该发光体系的发光强度，构建了一种化学发光分析法。与其他化学发光分析法相比，该法具有更高的灵敏度，已成功应用于水果、果汁和蔬菜中抗坏血酸含量的测定。
1.1 材料与试剂
市购枣子、猕猴桃、芒果、青椒、苦瓜、土豆、水溶C100、农夫果园和统一鲜橙多，以上水果和蔬菜洗净晾干备用。
过氧化氢 重庆东方试剂厂；浓氨水（30%）重庆川东化工集团有限公司试剂厂；六水硝酸铈、抗坏血酸 国药集团化学试剂有限公司；聚丙烯酸 上海晶纯试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，实验用水为去离子超纯水。
鲁米诺储备液：准确称取1.772 g鲁米诺，用1.0 mmol/L NaOH溶液溶解并定容至1 000 mL即得0.01 mol/L储备液，需用时取适量用0.8 mol/L碳酸钠溶液稀释至所需质量浓度；纳米二氧化铈：其合成和表征参照前期工作 ［21］，需用时用水稀释2.633 g/L纳米二氧化铈储备液至所需质量浓度。
1.2 仪器与设备
RFL-1型超微弱化学发光/生物发光检测仪 西安瑞迈电子科技有限公司；TPS-7000型ICP单道扫描光谱仪北京普析通用仪器有限责任公司；Tensor27型红外光谱仪 德国Bruker公司；85-2型恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；800型离心沉淀器 上海手术机械厂；蠕动泵（15 r/min，30 r/min） 上海仪表电机厂；流动注射系统各部件利用聚四氟乙烯管（内径0.8 mm）连接；ICP单道扫描光谱仪；红外光谱仪。
1.3 方法
1.3.1 流路
图 1 流动注射测定抗坏血酸实验装置示意图
Fig.1 Schematic diagram of the fl ow injection system for the determination of AA
按图1所示流路，在蠕动泵的推动下，载流（超纯水）将样品（抗坏血酸）带到T（三通）点与鲁米诺-过氧化氢-纳米二氧化铈溶液汇合，混合后进入反应盘管F抑制鲁米诺-过氧化氢-纳米二氧化铈发光体系的化学发光强度，实验参数由RFL-1型超微弱化学发光/生物发光检测仪设定。
1.3.2 标准曲线的绘制
准确移取一定量的抗坏血酸标准储备液100 μg/mL于一系列5 mL比色管中，用去离子水稀释至刻度配制成0.001～1.0 μg/mL的系列抗坏血酸标准溶液。按图1装好流路，开启蠕动，待基线稳定后测定，以峰高定量。
图 2 纳米二氧化铈对鲁米诺-过氧化氢发光体系的影响
Fig.2 Effect of nano-ceria on the chemiluminescence intensity of luminol-H
2O
2system
2.1 纳米二氧化铈对过氧化氢-鲁米诺发光体系的增敏作用考察加入纳米二氧化铈前后过氧化氢-鲁米诺发光体系的发光强度变化，结果如图2所示，加入纳米二氧化铈之后，鲁米诺-过氧化氢体系的发光强度得到极大增强（图2中线1）。为验证此增敏效果非游离的Ce 3+
所致，用0.5 mol/L的盐酸使纳米二氧化铈沉淀下来，于
15 000 r/min高速离心后，离心液用Na 2CO 3调至中性，将其作为催化剂，在相同的实验条件（与未处理的纳米二氧化铈溶液相同）下测定其催化性能。结果表明（图2中线2），该滤液的催化效果与纳米二氧化铈相比可以忽略不记，说明催化效果来源于纳米二氧化铈。
2.2 抗坏血酸对纳米二氧化铈-过氧化氢-鲁米诺发光体系的抑制作用
图 3 抗坏血酸对纳米二氧化铈-过氧化氢-鲁米诺发光体系的影响Fig.3 Effect of AA concentration on the chemiluminescence intensity of nano-ceria-luminol-H 2O 2system
为考察抗坏血酸对该发光体系的影响，选择3 个抗坏血酸质量浓度0.01、0.1 μg/mL和1.0 μg/mL，实验结果（图3）表明，抗坏血酸能够有效地抑制该发光体系，而且随着抗坏血酸质量浓度的增高，化学发光强度降低越强，当抗坏血酸质量浓度降低到0.01 μg/mL仍有显著的抑制效果，这使得该法在检测抗坏血酸时可获得极高的灵敏度。
2.3 其他发光条件对发光强度的影响
鲁米诺浓度、过氧化氢浓度和纳米二氧化铈质量浓度对该体系的影响尤为显著，详细考察了以上条件对发光强度的影响。在鲁米诺1.0×10 －6～5. 0×10 －4mol/L范围内，发光强度随着鲁米诺浓度的增加而增强，当鲁米诺浓度达到1.0×10 －5mol/L时，发光强度增加趋势缓慢，为节省试剂，在实验选择鲁米诺的浓度为1.0×10 －5mol/L。当过氧化氢浓度小于1.0×10 －4mol/L时，发光强度随过氧化氢浓度的升高而升高，然而当过氧化氢浓度超过该浓度时化学发光信号反而降低，故本实验选择过氧化氢最佳浓度为1.0×10 －4mol/L。纳米二氧化铈为本实验的催化剂，其质量浓度的大小直接影响着发光强度的影响。考察了5.3～1 316.5 μg/mL质量浓度范围内纳米二氧化铈对发光强度的影响，实验发现，当其质量浓度为132 μg/mL时发光信号达最大值，故选择为最佳质量浓度。
2.4 线性范围与检出限
在上述优化试验条件下，在0.001～1.0 μg/mL （0.005 7～5.7 μmol/L）范围内抗坏血酸质量浓度与化学发光强度呈良好的线性关系，lgΔI = 0.516lgc+4.029 1 （r = 0.983 1）（n=9）（ΔI为化学发光强度；c为抗坏血酸质量浓度/（μg/mL）；r为相关系数）。根据IUPAC的建议算出的检出限（3σ）为0.2 ng/mL（1.4 nmol/L），对质量浓度为1.0 μg/mL的抗坏血酸平行测定11次，相对标准偏差为2.9%。与其他化学发光方法相比（表1），本方法具有更宽的线性范围和更高的灵敏度。
表1 本法与其他化学发光法对抗坏血酸的响应特性比较
TTable 1 Comparison of response to AA between the developed methodand other chemiluminescence methods
测定抗坏血酸（发光体系） 线性范围/（μmol/L） 检出限/（nmol/L） 文献过氧化氢-碳酸氢钠-CdSe/CdS量子点-抗坏血酸 0.1～100 6.7 ［20］鲁米诺-K 3［Fe（CN） 3-抗坏血酸 3.0～600 1 300 ［22］可溶性锰（IV）甲醛-抗坏血酸 0.06～20 20 ［23］高锰酸钾-抗坏血酸 0.28～57 28 ［24］铈（VI）-过氧化氢-鲁米诺-抗坏血酸 0.008～160 8.0 ［25］过氧化氢-鲁米诺-KIO 4-抗坏血酸 0.1～10 60 ［26］鲁米诺-铁氰化钾-抗坏血酸 0.057～4.56 31 ［27］本法 0.005 7～5.7 1.4
2.5 干扰实验结果
在选定的最佳实验条件下，对1.0 μg/mL抗坏血酸进行干扰实验，相对误差在5.0%以内，从表2可以看出，常见的无机离子和有机物不干扰其测定，本法对检测抗坏血酸具有良好的选择性。2.6 实际样品检测结果
表2 干扰实验结果
Table 2 Results of interference experiments
干扰物 倍数 干扰度/% 干扰物 倍数 干扰度/% 干扰物 倍数 干扰度/%柠檬酸 1 000 4.36 H 2PO 4 － 1 000 1.98 Zn 2+ 1 000 0.46乳糖 1 000 －2.22 NO 3 － 1 000 －0.52 Mg 2+ 1 000 1.56葡萄糖 1 000 －1.28 SO 4 2－ 1 000 0.46 Ni 2+ 100 0.88草酸 1 000 －1.46 CO 3 2－ 1 000 －3.29 Pb 2+ 50 －1.24乳酸 100 －2.91 PO 4 3－ 50 －0.68 Cd 2+ 100 －3.03淀粉 800 －5.72 Ca 2+ 50 －1.41 Cr 3+ 10 3.12水杨酸 80 －4.05 Na + 1 000 0.78 EDTA 500 －2.44 Cl － 1 000 0.76 K + 1 000 －0.56 NH 4 + 500 0.07 HPO 4 2－ 1 000 0.16 Al 3+ 1 000 －0.52
果汁样品的分析：选取3 种不同品牌的果汁，准确移取一定体积的原果汁，将其稀释10 倍后用截留分子质量为500 D的超滤管于4 000 r/min条件下超滤，取滤液再稀释1 000 倍后按标准曲线方法测定，同时与碘滴定法作比较，结果见表3，两种测定方法的结果相当吻合。
表3 样品测定结果（
±s，n == 33）
Table 3 Results of sample analysis
± ss， n == 33）
蔬菜和水果样品的分析：分别选取3 种不同蔬菜和水果，将果蔬样品洗净，用纱布拭干其外部所附着的水分。对于水果，先纵切为4～8等分，取其20～30 g为一份，除去不能食用部分，切碎。对于叶菜，沿中脉切分为二分，取其一分切碎。称取20 g作分析用。将称取的样品放研钵中，加5～10 mL去离子水，研磨至呈浆状。小心无损地移研钵中样品于100 mL容量瓶中，研钵用去离子水洗净后，亦倒入量瓶中，并加去离子水至100 mL，充分混合。用清洁干燥二层纱布过滤入干燥的烧杯中，再用截留分子质量为500 D的超滤管于4 000 r/min转速下超滤，取滤液稀释1 000 倍后按标准曲线方法测定，同时与碘滴定法作比较，结果见表3，两种测定方法的结果相当吻合。
本实验基于抗坏血酸抑制纳米二氧化铈-鲁米诺-过氧化氢发光体系的原理构建了抗坏血酸的化学发光分析法。该法线性范围宽、灵敏度高、仪器设备简单及操作简便，可成功用于测定水果、果汁和蔬菜中抗坏血酸，其结果与标准方法相当吻合。
3
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SHI Wenbing， HE Wei *， WANG Bangjiang
（Chongqing Key Laboratory of Inorganic Special Functional Materials， College of Chemistry and Chemical Engineering，Yangtze Normal University， Chongqing 408100， China）
Abstract：A new fl ow injection chemiluminescence （CL） method based on the inhibition of ascorbic acid on nano-ceria-H 2O 2-luminol CL system has been developed for the determination of ascorbic acid （AA）. The effects of concentrations of H 2O 2， luminol and nano-ceria， and pH on CL intensity were investigated respectively. Under the optimum conditions， the linear range of the method was 0.001-1.0 μg/mL （r = 0.983 1）， and the detection limit （3σ） was 0.2 ng/mL. The relative standard deviation （RSD） for 11 repetitive determinations of 1.0 μg/mL AA was 2.9%. The method is simple， sensitive and fast and has been successfully applied to determine ascorbic acid in fruits， juices and vegetables.
Key words：nano-ceria； chemiluminescence； ascorbic acid
中图分类号：O657.39
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）24-0112-04
doi：10.7506/spkx1002-6630-201524019
收稿日期：2015-01-11
基金项目：国家自然科学基金面上项目（21275021）；重庆市教委科学研究项目（KJ1401201；KJ1401220）；长江师范学院青年科研人才成长支持计划项目
作者简介：石文兵（1976—），男，副教授，博士，主要从事化学发光分析研究。E-mail：swb02182001@126.com
*通信作者：贺薇（1983—），女，讲师，硕士，主要从事化学发光及光散射分析研究。E-mail：heweiyznu@163.com