谢跃杰 1，贺稚非 2，李洪军 1，*
（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715）
摘 要：为比较不同提取技术对兔肉挥发性风味物质的提取效果，明确兔肉特征风味物质。采用同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）、固相微萃取（solid phase micro extraction，SPME）和超临界二氧化碳流体萃取（supercritical carbon dioxide fl uid extraction，SFE）3 种常用方式，提取兔肉风味物质，定量加入2，4，6-三甲基吡啶，通过气相色谱-质谱法进行定性和定量研究，比较提取率差异，确定兔肉主体风味成分。结果显示：SDE法提取到包括烃、醇、醛、酸、酯、酮、醚和杂环共8 类75 种化合物；SPME法提取到烃、醛、酮和酯共4 类41 种化合物；SFE法提取到烃、醇、醛、酯和杂环共5 类38 种化合物。提取物质种类：SDE＞SFE＞SPME，提取物质量：SFE＞SDE＞SPME，提取量：SPME＞SFE＞SDE。通过气味活度值法，确定己酸、己醛、辛醛、壬醛、2，4-癸二烯醛和1-辛烯-3醇为兔肉主体风味物质。
关键词：兔肉；风味物质；同时蒸馏萃取；固相微萃取；超临界二氧化碳流体萃取；气相色谱-质谱法
兔肉，以其“四高”（高蛋白质、高赖氨酸、高磷脂、高消化率）和“三低”（低胆固醇、低脂肪、低能量）的特点 ［1］，被视为功能性肉制品，风靡亚非欧大陆，是地中海膳食结构中不可或缺的肉制品之一，也成为当代倡导绿色、健康和功能性肉制品消费者的首选 ［2］。在我国兔肉的消费人群主要集中在四川、重庆等西南地区，受兔肉特殊风味和饮食习惯影响，其他地区的消费者很少食用。因此，为了去除或者减弱兔肉的不愉悦风味，促进兔肉消费，亟需了解兔肉特殊风味物质的种类和含量。
同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）是一种简单、有效、同时提取浓缩的萃取方法 ［3］，有报道用于鸡胸肉风味物质的提取 ［4］。但是，SDE比较耗时，且萃取过程中的热降解和反应产物相互作用会产生新的物质，低沸点的物质也容易损失 ［5］。相对于SDE法提取兔肉挥发性风味成分，尽管固相微萃取（solid phase micro extraction，SPME）提取到的种类和含量较少，但更接近其真实挥发风味 ［6］。因此，SDE有其局限性。SPME以其无溶剂、高效、灵敏和易操作的特点 ［7］，已广泛用于各种畜禽肉类风味物质的提取，包括牛肉、山羊肉、鸡肉、鱼肉等 ［8-11］。它可以根据不同萃取物质的极性和挥发性，选择不同的包被材料和包被厚度，从而达到较好的提取效果。唯一缺点就是相对较贵。采用SPME法初步确定兔肉主体风味物质为醛类、酮类、醇类和烃类化合物质 ［12］。针对以上这些低分子质量、高沸点、低挥发性和易热解的小分子物质，考虑采用提取温度接近室温的超临界二氧化碳流体萃取（supercritical carbon dioxide fluid extraction，SFE）法提取兔肉挥发性风味成分。目前鲜见相关的研究报道。但此法曾用于牛肉和花生的风味物质定量分析研究 ［13-14］。
因此，本研究拟采用上述3 种实验室常用的提取技术，对兔肉特征性风味物质进行萃取，应用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析方法，比较3 种不同技术之间的提取量、提取率和提取效果，选出适合提取兔肉特殊风味物质的最好提取方式，为今后进一步研究兔肉特殊风味物质的种类、组成和来源及机理提供理论依据和技术参考。
1.1 材料与试剂
兔子品种：法国伊拉兔；产地：重庆阿兴记肉兔饲养场；75 日龄的兔肉胴体购于西南大学动物科学与技术学院实验兔场。所有兔肉混合绞碎后，用密封袋包装放置于－20 ℃冰柜中冻藏备用。
2，4，6-三甲基吡啶（2，4，6- trimethylpyridine，TMP）标准品 美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
QP2010 GC-MS联用仪 日本岛津公司；手动SPME进样器、75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）涂层萃取头 美国Supelco公司；N-EVAP系列24位氮吹仪 美国Organomation公司；萃取瓶 美国Perkinelmer公司；HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；JYL-C020厨房机械料理机 九阳股份有限公司；S25LAB振荡器德国IKA公司；HA121-50-01超临界萃取装置 江苏华安超临界萃取有限公司；SDE装置自行购置。
1.3 方法
1.3.1 SDE法提取挥发性物质 ［4］
将冷冻兔肉在室温条件下解冻，称取25 g样品（精确到0.01 g），加入75 mL饱和食盐水，加入100 μL TMP标准品，于250 mL平底烧瓶里充分混匀后，接于SDE装置一端，固定，用电炉加热保持溶液沸腾。量筒量取45 mL二氯甲烷溶液于250 mL圆底烧瓶，放入沸石2～3 粒，接于SDE装置另一端，用恒温55 ℃水浴加热提取2.5 h。待萃取液冷却后，加入无水硫酸钠，放置于－18 ℃冰箱过夜。将所得液体用氮吹仪浓缩至1 mL，用于GC-MS分析。
1.3.2 SPME法提取挥发性物质 ［12］
准确称取解冻的兔肉3 g（精确到0.001 g）于20 mL萃取瓶，加入9 mL饱和食盐水和12 μL TMP标准品，振荡混匀1 min。将萃取瓶放入90 ℃恒温水浴锅中平衡15 min，再插入活化好的SPME萃取头，推出纤维头，保持离萃取瓶顶部1～2 cm，90 ℃恒温萃取30 min。萃取完毕后，将纤维头插入GC进样口解吸5 min再拔出。
1.3.3 SFE法提取挥发性物质 ［15］
称取100 g解冻后的兔肉于容器中，加入400 μL TMP标准品，充分混匀后置于萃取容器。SFE萃取条件为：萃取温度40 ℃，萃取压力20 MPa，萃取时间3 h，二氧化碳流速16 kg/h。
1.3.4 GC条件
色谱柱：J&W DB-5 ms石英毛细柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；升温程序：40 ℃保持1 min，以8 ℃/min升至180 ℃，保持3 min；载气（He）流速1.1 mL/min；压力2.4 kPa；进样量1 μL；分流比10∶1。
1.3.5 MS条件
电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度250 ℃；检测器电压350 V；质量扫描范围m/z 35～400。
1.3.6 定性定量分析
定性分析：经计算机自带数据库（NIST）检索匹配，只认定相似度大于80%的化合物，并且参考各种化合物的保留时间。
定量分析：各挥发性化合物相对含量即峰面积占总峰面积百分比，各种挥发性风味化合物的绝对含量按下式计算：
式中：M C为化合物绝对含量/（μg/kg）；A s为总离子流图中化合物峰面积；A I为内标物质峰面积；C TMP为TMP质量浓度/（μg/mL）；V TMP为内标物加入的体积/μL；m s为肉样品质量/kg。
1.3.7 感官评定
由经培训的5 人评定小组，男性2 名，女性3 名，采用GC-嗅闻法，比较评定3 种不同提取方式兔肉腥味的强弱程度。以5 分制打分，1为无腥味，2为弱腥味，3为腥味，4为强腥味，5为非常腥。
2.1 不同提取方法挥发性风味物质总离子流色谱图
图 1 不同提取方式兔肉挥发性风味GC-MMSS图
Fig.1 GC-MS chromatograms of volatile fl avor compounds of rabbit meat by different extraction methods
由图1分析可知，采用SDE、SPME和SFE 3 种不同方式，分别提取到兔肉挥发性风味物质75、41 种和38 种。其中，包括烃类、醇类、醛类、酸类、酯类、醚类、酮类和杂环类。SDE法提取的化合物数量最多，达75 种。这些化合物既有美拉德反应产物 ［16］，如2-戊基呋喃，也有脂质氧化产物 ［3］，如己醛等。此外，还有提取过程中，挥发性物质之间发生相互作用而产生。SPME法提取到的物质种类最少，仅有4 类化合物，可能与其萃取头涂层的选择性吸附有关。SFE提取到的物质数量最少，仅有38 种化合物。因此，可以看出不同提取方式，提取到的兔肉挥发性风味物质数量和种类均不完全相同。
2.2 不同提取方法提取效果比较
图 2 不同提取方式提取化合物的种类数量
Fig.2 The number of chemical classes of volatile compounds from rabbit meat by different extraction methods
图 3 不同提取方式对挥发性风味物质提取量的影响
Fig.3 Effect of different extraction methods on the extraction rate of volatile compounds
由图2可以看出，3 种提取方式对兔肉挥发性风味物质的提取效果有差异。SDE法提取到包括烃、醇、醛、酸、酯、酮、醚和杂环共8 类75 种化合物；SPME法提取到烃、醛、酮和酯共4 类41 种化合物；SFE法提取到烃、醇、醛、酯和杂环共5 类38 种化合物。显然，从提取物质的种类看，SDE＞SFE＞SPME。可能是由于SDE法提取时间较长，并且提取时温度最高，容易得到更多低挥发性、高沸点的化合物，在蛋白质降解、脂肪氧化等过程中产生了更多的挥发性物质 ［6］。SFE法提取温度最低，提取物中多是一些对热不稳定、难挥发的烃类、非极性脂溶性化合物等小分子醇、醛、酸类物质 ［17］。从提取物质的质量看，SFE＞SDE＞SPME。说明SFE法提取兔肉挥发性风味物质的效果较好，SDE法其次，而SPME法提取的质量最低，可能是由于纤维萃取头的吸附面积有限，已经吸附的位点不能再吸附其他物质，导致提取质量较低 ［18］。如图3所示，3 种方法对挥发性风味物质的提取量分别为SDE法72 μg/kg，SPME法193 μg/kg，而SFE法159 μg/kg，因此SPME＞SFE＞SDE。SDE法提取量最低，此方法虽然能提取到更多的物质，但挥发性风味物
质的含量相对最低。而SPME法虽然提取物质的种类和质量不高，但挥发性风味物质的含量相对最高。SFE法与SPME法相比，提取量略低。说明SDE、SPME、SFE法对兔肉挥发性风味物质的提取效果各有优劣，可以根据实际条件进行选择。
2.3 兔肉主体风味物质的鉴定
表1 3 种提取方式腥味感官评分
Taabbllee 11 SSeennssoorryy ssccoorreess ooff ooffff--flavor for rabbit meat by three extraction methods
评定者编号 SDE SPME SFE 1 3 3 4 2 2 4 5 3 2 3 4 4 2 3 5 5 3 4 5平均分 2.4 3.4 4.6
通过感官分析和GC-MS定性定量分析，结合气味活度值（odor active value，OAV）法鉴定兔肉主体风味物质 ［19］。由表1可以看出，SFE法提取到的兔肉挥发性风味物质的腥味强度最大，其次是SPME法，SDE法得到的兔肉腥味强度最弱。SFE法提取到的挥发性风味物质除了己醛、辛醛等醛类物质以外，还有己酸，由于己酸的OAV大于1，说明己酸是兔肉挥发性风味主体成分之一，而己酸的味道主要是羊膻味，也是不愉悦气味。因此，本实验可以初步判定己酸为兔肉主体风味物质的一种。
表 2 主体风味物质OOAAVV TTaabbllee 22 OOddoorr aaccttiivviittyy vvaalluueess ooff mmaaiinn vvoollaattiillee ccoommppoouunnddss ooff rraabbbbiitt mmeeaatt
注：—.未检出。
OAV SDE SPME SFE SDE SPME SFE己醛 12.21 14.85 15.62 4.5 2.7 3.3 3.5己酸 — — 12.2 8 — — 1.5辛醛 0.94 1.68 1.54 0.7 1.3 2.4 2.2壬醛 5.4 9.1 7.4 1 5.4 9.1 7.4 2，4-癸二烯醛 1.24 1.71 1.52 0.07 17.7 24.3 21.7 1-辛烯-3-醇 1.7 2.2 1.8 1 1.7 2.2 1.8化合物 含量/（μg/kg） 阈值/ （μg/kg）
兔肉主体风味经不同提取方式得到不同含量，而化合物的阈值不变，当OAV大于1时，认为该物质对总体风味有显著贡献。因此，通过计算可以确定己醛、辛醛、壬醛、2，4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和己酸为兔肉主体挥发性风味物质，或许兔肉的特殊腥味就来源于此。由表2可以看出，己醛和己酸含量：SFE＞SPEM＞SDE，辛醛、壬醛、2，4-癸二烯醛和1-辛烯-3-醇的含量：SPME＞SFE＞SDE。由OAV得到，对整体风味的贡献：2，4-癸二烯醛＞壬醛＞己醛＞辛醛＞1-辛烯-3-醇＞己酸。己醛由亚油酸氧化生成，并一直被看成是兔肉腥味的重要成分，但肉制品挥发性风味物质中普遍存在，被描述为青草味 ［20］。辛醛被描述为溶剂味、柠檬味和苦味；壬醛被形容成青草味和油脂味；2，4-癸二烯醛表现为醛味和酸败味；1-辛烯-3-醇则是蘑菇味和金属味 ［21-22］。
由表2还可以看到，单纯某一种物质并非兔肉特殊腥味成分。可以推测，兔肉特殊腥味是由几种挥发性化合物组合的结果。其中，每一种化合物对整体风味物质的贡献大小，还可以采用遗漏实验，通过感官评定来验证说明，直至弄清楚哪一种兔肉主体风味物质对兔肉腥味起着关键性作用 ［23］。
通过采用SDE、SPME和SFE 3 种不同提取方式，经过感官嗅闻和GC-MS分析，结合OAV法，得到兔肉挥发性风味主体成分为己醛、己酸、辛醛、壬醛、2，4-癸二烯醛和1-辛烯-3-醇。同时，针对兔肉挥发性风味物质的提取方式，比较了SDE、SPME和SFE的提取效果，感官评分：SFE＞SPME＞SDE；提取物质种类：SDE＞
SFE＞SPME；提取物质量：SFE＞SDE＞SPME；提取量：SPME＞SFE＞SDE。通过SFE法初次发现己酸是兔肉挥发性风味物质的主体成分之一。确定影响兔肉腥味的关键性物质以及来源将是下一步研究重点。：
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Volatile Flavor Profi le of Rabbit Meat Extracted by Three Frequently Used Techniques
XIE Yuejie
1， HE Zhifei
2， LI Hongjun
1，*
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China；2. Chongqing Engineering Research Center of Regional Food， Chongqing 400715， China）
Abstract：In order to compare the extraction effi ciencies of volatile compounds by different methods and to ascertain the characteristic volatile compounds of rabbit meat， simultaneous distillation extraction （SDE）， solid phase micro extraction （SPME） and supercritical carbon dioxide fl uid extraction （SFE） were used to extract the fl avor compounds of rabbit meat. Gas chromatography tandem mass spectroscopy （GC-MS） was used to quantitatively and qualitatively analyze meat fl avor constituents and to compare the extraction efficiencies using 2，4，6-trimethylpyridine as an internal standard substance. The experimental results showed that the SDE method extracted 75 chemical compounds， including hydrocarbons，alcohols， aldehydes， acids， esters， ketones， ethers and heterocyclic； the SPME method extracted 41 chemical compounds，including hydrocarbons， aldehydes， ketones and esters； and the SFE method extracted 38 chemical compounds， including hydrocarbons， alcohols， aldehydes， esters and heterocyclic， suggesting that the order of the number of chemical classes of volatile compounds extracted from rabbit meat was SDE ＞ SFE ＞ SPME. In addition， the order of the weight of extracts was SFE ＞ SDE ＞ SPME， whereas that of the total content of volatile compounds in extracts was SPME ＞ SFE ＞ SDE. According to their odor active values， hexanoic acid， hexanal， octanal， nonanal， （E，E）-2，4-decadienal and 1-octen-3-ol were the key odor components of rabbit meat.
Key words：rabbit meat； fl avor substance； simultaneous distillation extraction （SDE）； solid phase micro extraction （SPME）；supercritical carbon dioxide fl uid extraction （SFE）； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）
中图分类号：TS251.5.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）24-0147-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201524026
收稿日期：2015-03-19
基金项目：国家现代农业（兔）产业技术体系建设专项（CARS-44-D-1）；教育部兔产业体系项目（100030-40305411）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAD36B03）；西南大学基本科研业务费专项（XDJK2014D042）
作者简介：谢跃杰（1985—），男，博士研究生，研究方向为食品风味化学。E-mail：yjxie@sina.com
*通信作者：李洪军（1961—），男，教授，博士，研究方向为肉类科学与酶工程。E-mail：983362225@qq.com