胡志和 1，2，夏 磊 1，孙振刚 3，武文起 3，冯永强 3，薛 璐 1，2，刘蓄瑾 1，贾 莹 1
（1.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134；
2.天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134；3.天津海河乳业有限公司，天津 300402）
摘 要：以牛乳酪蛋白为底物，先经胃蛋白酶水解，再经胰蛋白酶水解，从水解物中分离获得血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽并确定其氨基酸序列。酪蛋白的双酶水解物经超滤和葡聚糖凝胶色谱分离，分离得到3 个组分，收集高ACE活性抑制效果组分Ⅱ和Ⅲ。采用离子色谱法分析水解片段的氨基酸组成，液相色谱-质谱法分析水解片段的氨基酸序列，采用固相合成法制备获得的短肽片段，用分光光度法检测ACE活性抑制效果。结果表明，组分Ⅱ包含缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸，共8 种氨基酸，组分Ⅲ包含痕量的丝氨酸和酪氨酸；将组分Ⅱ和Ⅲ经液相色谱-质谱分析，获得8 个片段，其中，α s2-f （56～57）∶YS、α s2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY和κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY具有ACE活性抑制作用，其IC 50值分别为11.89、11.75 μg/mL和421 μg/mL。
关键词：牛乳酪蛋白；胃蛋白酶；胰蛋白酶；血管紧张素转化酶；抑制肽
血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一种多功能酶，在体内的升压系统（肾素-血管紧张素系统）和降压系统（激肽-激肽释放酶系统）中起着重要的调节作用 ［1-3］。ACE抑制剂（ACE inhibitor，ACEI）也是心血管和高血压疾病治疗使用较多的药物 ［4］。然而，包括ACEI在内的合成的降压药物，对人体均有副作用 ［5-7］，因此，人们将研究的重点转移到天然抗高血压产物的开发。近年来，大量的科学研究发现，在食物蛋白中存在多种生物活性片段，可通过蛋白酶水解释放出来，其中包括ACE抑制肽。目前，研究人员分别从乳蛋白 ［8-15］、墨鱼蛋白 ［16］、蜥鱼蛋白 ［17］、虾蛋白 ［18］、蚕蛹蛋白 ［19］、鸡蛋清蛋白 ［20］、鯵蛋白 ［21］、鱼类蛋白 ［22］、花生蛋白 ［23］、大豆蛋白 ［24-25］、螺旋藻蛋白 ［26］等蛋白的酶解物中分离出ACE抑制肽，并确定了肽的氨基酸序列。
本研究以牛乳酪蛋白为原料，先经胃蛋白酶水解，再用胰蛋白酶水解，从水解产物中分离纯化具有ACE活性抑制作用的肽片段，并对其氨基酸序列进行分析。
1.1 材料与试剂
酪蛋白 天津海河乳业有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-hisleu hydrate，HHL）（H1635-25 mg）、ACE（A6778-0.25UN）、18 种氨基酸的标准品 美国Sigma公司；盐酸、氯化钠、NaAC（均为分析纯） 天津市化学试剂批发公司；磷酸二氢钠（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）、乙腈（色谱级） 天津市赢达稀贵化学试剂厂；四硼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钠、乙酸乙酯（均为分析纯） 天津市凯通化学试剂有限公司；甲醇（高效液相色谱级）、HAC（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；三氟乙酸（tallow fatty acid，TFA） 天津南开允公合成技术有限公司；Sephadex G-15固体粉末Pharmacia公司。
1.2 仪器与设备
L535-1低速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；1.0 cm×100 cm层析柱、CXG-1电脑恒温层析柜、HD-3紫外检测仪、DBS-100电脑全自动部份收集器、HD-A电脑采集器 上海沪西分析仪器厂有限公司；pH仪 德国赛得利斯北京有限公司；DH-101型电热恒温鼓风干燥箱 天津市中环实验电炉有限公司；KDC-160HR高速冷冻离心机 科大创新股份有限公司；UV-2100型分光光度计 美国Unico公司；Dionex ICS-3000型金电极电化学检测器、AminoPac PA-10型分析柱（2 mm×250 mm）、AminoPac PA-10型预柱（2 mm×50 mm）、Amino Acids电位波形（pH，Ag，AgCl Reference）、LTQ XL型色谱-质谱检测仪器、LCMC/MC sequent软件 美国赛默飞世尔科技公司。
1.3 方法
1.3.1 酪蛋白的双酶水解物的制备
采用杨铭等 ［27］的方法制备水解产物，并进行改良。配制质量分数7%酪蛋白的水溶液，用浓盐酸调节溶液的pH值至3.0，加热并保持温度37 ℃，按照酶与底物比为1∶100（g/g）加入胃蛋白酶水解3 h后用沸水浴灭酶10 min。水解液冷却至48 ℃，用5 mol/L NaOH溶液调pH 7.7，加入胰蛋白酶，酶与底物比为1∶500（g/g），水解3 h后，用沸水浴灭酶10 min。冷却至室温，调节pH值至7.0。在4 000 r/min条件下离心15 min。上清液用截留分子质量为6 kD的中空纤维膜组件在0.05～0.10 MPa压力范围内循环超滤，获得分子质量小于6 kD的溶液，经冷冻干燥后待用。
用洗脱缓冲溶液（浓度0.02 mol/L、pH 6.8的磷酸盐缓冲液）将冷冻干燥粉末配制成质量浓度为100 mg/mL溶液，通过Sephadex G-15进行分离。分离条件：上样量3 mL，紫外检测波长280 nm，洗脱速率0.4 mL/min，按7.5 min/管进行收集，获得3 个分离组分。采用分光光度法（HHL方法 ［28］）检测酪蛋白双酶水解物、水解物经截留分子质量6 kD超滤膜超滤的透出物和3 个组分的ACE抑制效果的IC 50值，双酶水解物IC 50值为560 μg/mL，超滤透出物IC 50值为250 μg/mL，组分Ⅰ为123.41 μg/mL，组分Ⅱ为66.67 μg/mL，组分Ⅲ为64.29 μg/mL ［27］。按公式（1）计算ACE抑制率。
式中：A为反应中ACE抑制剂与ACE同时存在的吸光度；B为反应中不加抑制剂的吸光度，即对照；C为ACE 和HHL空白反应的吸光度，即空白。
1.3.2 水解片段的氨基酸序列分析
将ACE活性抑制效果较好的组分Ⅱ和Ⅲ中的片段进行分析。
1.3.2.1 氨基酸组成的化学检测
1）样品处理：分别称取大约1 mg的组分Ⅱ和组分Ⅲ于水解管中，加入1 mL 6 mol/L盐酸溶液，充入高纯氮气，在充气状态下拧紧螺丝盖，放在（110±1） ℃的恒温干燥箱内，水解24 h之后取出并进行冷冻干燥，待使用时再复溶至1 mL。
从复溶的溶液中取出200 μL样品溶液，稀释至4 mL，用IC-C 18固相萃取小柱串联，并以0.22 μm的尼龙针筒过滤器过滤纯化，收集1 mL滤出液，待上样。其中，IC-C 18固相萃取小柱串联提前经过5 mL甲醇和10 mL纯水活化、洗涤。
2）标准品：5 μmol/L的18 种氨基酸标准品。
3）试剂配制：250 mmol/L NaOH溶液、1 mol/L NaAC溶液、0.1 mol/L HAC溶液。
4）检测条件：柱温30 ℃；流速0.25 mL/min；淋洗液A：纯水（＞18.2 MΩ），B：250 mmol/L NaOH溶液，C：1 mol/L NaAC溶液，D：0.1 mol/L HAC溶液。
5）洗脱时间及梯度，见表1。
表1 氨基酸化学检测的洗脱梯度
Taabbllee 11 EElluuttiioonn ggrraaddiieenntt ffoorr cchheemmiiccaall ddeetteeccttiioonn ooff aammiinnoo aacciiddss
时间/min 洗脱液体积分数/% A B C D 0.0 76 24 0 0 2.0 76 24 0 0 8.0 64 36 0 0 11.0 64 36 0 0 18.0 48 12 40 0 21.0 52 8 40 0 23.0 28 2 70 0 42.0 28 2 70 0 42.1 0 0 0 100 44.1 0 0 0 100 44.2 20 80 0 0 46.2 20 80 0 0 46.3 76 24 0 0 65.0 76 24 0 0
1.3.2.2 氨基酸序列分析 ［27］
采用LTQ XL型色谱-质谱检测仪器对组分Ⅱ和组分Ⅲ所含片段的氨基酸序列进行检测，用LC-MC/MC sequent软件进行分析。
仪器运行条件：离子源NSI；离子源温度260 ℃；毛细管电压3.5 kV；脱溶剂气温度260 ℃；脱溶剂气流量20 unit/min；检测器电压200 V。
液相色谱分析条件：流动相A：H 2O-0.1% TFA；流动相B：乙腈-0.1% TFA；流速200 μL/min（分流后调节为2 μL/min）；进样量10 μL（冷冻干燥后粉末以5% B液复溶）；进样方式：自动进样；洗脱时间和梯度：00～20 min时，B从5%～35%；20～40 min时，B从35%～95%。
1.3.3 氨基酸片段的ACE活性抑制效果检测
经方法1.3.2.2节分析检测，获得的短肽片段，采用固相合成法制备，纯度大于95%。合成产物由上海楚肽生物科技有限公司制备。
ACE活性抑制效果体外检测采用HHL方法 ［28］，确定水解物主要功效成分。
1.4 数据处理
氨基酸序列分析采用LC-MC/MC sequent软件，数据处理采用Excel软件。
2.1 组分Ⅱ和组分Ⅲ中氨基酸组成分析
按照方法1.3.2.1节对水解产物的分离组分Ⅱ和组分Ⅲ的氨基酸组成进行分析。由图1及表2～4可知，对比18 种氨基酸标准品的洗脱图谱和出峰时间，组分Ⅱ包含缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸，共8 种氨基酸；对比18 种氨基酸标准品的洗脱图谱和出峰时间，组分Ⅲ包含痕量的丝氨酸和酪氨酸。
图 1 氨基酸标准品（A）、组分Ⅱ（B）、组分Ⅲ（C）的洗脱图谱Fig.1 Elution profi les of mixed amino acid standards （A） and components Ⅱ （B） and Ⅲ （C）
表2 氨基酸标准品Table 2 Retention times of amino acid standards
序号 保留含量/ （mg/mL）1 1.67 H 2O 25.589 2.711 1.50 1.012 2 1.87 精氨酸 52.157 8.818 4.86 0.001 3 3.43 赖氨酸 31.509 4.975 2.74 0.001 4 4.45 谷氨酰胺 22.134 4.183 2.31 0.001 5 5.70 丙氨酸 26.149 5.355 2.95 0.000 6 6.03 苏氨酸 66.250 14.412 7.95 0.001 7 6.50 甘氨酸 20.725 4.625 2.55 0.000 8 7.55 缬氨酸 16.640 4.470 2.47 0.000 9 8.60 丝氨酸 48.623 13.918 7.68 0.001 10 9.20 脯氨酸 32.969 10.003 5.52 0.001 11 11.60 异亮氨酸 13.007 4.205 2.32 0.000 13 13.08 蛋氨酸 31.402 10.653 5.88 0.000 14 21.32 组氨酸 161.730 20.949 11.56 0.001 15 22.72 苯丙氨酸 94.088 11.951 6.59 0.001 16 23.72 谷氨酸 28.409 4.463 2.46 0.001 17 24.05 天冬氨酸 42.649 6.874 3.79 0.001 18 25.32 胱氨酸 156.773 29.784 16.41 0.002 19 27.55 酪氨酸 105.249 14.905 8.22 0.001合计 976.052 177.218 97.77 1.023时间/min 峰名称 峰高/nC 峰面积/（nC·min）相对峰面积/%
表3 组分Ⅱ中氨基酸
Taabbllee 33 RReetteennttiioonn ttiimmeess ooff aammiinnoo aacciiddss iinn ccoommppoonneenntt Ⅱ
序号 保留时间/min 峰名称 峰高/nC 峰面积/（nC·min）相对峰面积/%含量/ （mg/mL）2 2.75 缬氨酸 1.330 0.375 0.71 0.000 3 8.60 丝氨酸 2.247 0.517 0.98 0.000 4 9.20 脯氨酸 4.629 1.280 2.44 0.001 5 12.50 亮氨酸 2.223 0.634 1.21 0.002 6 22.73 苯丙氨酸 14.537 1.734 3.30 0.002 7 23.68 谷氨酸 2.971 0.407 0.77 0.001 8 24.03 天冬氨酸 2.799 0.411 0.78 0.001 10 27.55 酪氨酸 6.758 0.854 1.63 0.001合计 37.494 6.212 11.83 0.009
表 4 组分Ⅲ中氨基酸
Taabbllee 44 RReetteennttiioonn ttiimmeess ooff aammiinnoo aacciiddss iinn ccoommppoonneenntt Ⅲ
序号 保留时间/min 峰名称 峰高/nC 峰面积/（nC·min）相对峰面积/% 含量/（mg/mL）1 8.58 丝氨酸 0.562 0.117 54.75 0.000 2 27.53 酪氨酸 0.717 0.096 45.25 0.000合计 1.279 0.213 100 0.000
2.2 组分Ⅱ和组分Ⅲ中肽片段氨基酸序列分析
2.2.1 组分Ⅱ中片段的氨基酸序列 1
图 2 组分Ⅱ与α
1-酪蛋白（AA） 、α
ss22-酪蛋白（BB） 、β-酪蛋白（CC）、κ-酪蛋白（D）的氨基酸序列匹配图
Fig.2 Matching profi les of amino acid sequences between component Ⅱ and α
1-casein， α
s2-casein， β-casein or κ-casein
表 5 组分Ⅱ与α
1-酪蛋白的氨基酸序列匹配数据
TTaabbllee 55 MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd α-caasseeiinn
注：序列中相同字母的不同大小写为对应脱氨基，小写字母为氨基被修饰。下表同。
匹配度 序列 修饰 可能性 相关系数对比打分 价态 质荷比/D分子质量/D极可信 LGYLEQLLR 38.92 3.57 0.06 2 553.33 1 105.66极可信 LGYLEQLLR 48.45 3.49 0.04 2 553.17 1 105.33极可信 FVAPFPEVF 36.35 3.39 0.58 2 527.17 1 053.33极可信 LGYLEqLLR Q6（脱酰胺基） 26.29 3.35 2 553.33 1 105.66极可信 LGYLEqLLR Q6（脱酰胺基） 48.45 3.35 2 553.17 1 105.33极可信 YVPLGTQYTDAPSF 30.68 3.23 0.20 2 780.17 1 559.33极可信 FVAPFPEVFGK 70.02 2.91 0.58 2 619.67 1 238.33
表6 组分Ⅱ与α
ss22-酪蛋白的氨基酸序列匹配数据
TTaabbllee 66 MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd α
ss22-caasseeiinn
匹配度 序列 修饰 可能性 相关系数对比打分 价态 质荷比/D分子质量/D极可信 YqKFPqYLQY Q2（脱酰胺基）Q6（脱酰胺基） 14.51 3.65 0.01 2 691.166 7 1 381.326 1极可信 YqKFPQYLqY Q2（脱酰胺基）Q9（脱酰胺基） 14.51 3.65 0.01 2 691.166 7 1 381.326 1极可信 YqKFPqYLqY Q2（脱酰胺基）Q6（脱酰胺基）Q9（脱酰胺基） 14.51 3.61 2 691.166 7 1 381.326 1极可信 YQKFPqYLqY Q6（脱酰胺基）Q9（脱酰胺基） 14.51 3.50 2 691.166 7 1 381.326 1极可信 YQKFPqYLQY Q6（脱酰胺基） 17.39 3.37 0.03 2 689.583 3 1 378.159 4极可信 YQKFPQYLQY 27.83 3.28 2 689.583 3 1 378.159 4极可信 YqKFPQYLQY Q2（脱酰胺基） 8.95 3.17 2 689.583 3 1 378.159 4极可信 YQKFPQYLqY Q9（脱酰胺基） 8.95 3.16 2 689.583 3 1 378.159 4极可信 YqKFPQYLqY Q2（脱酰胺基）Q9（脱酰胺基） 2.92 3.09 2 689.583 3 1 378.159 4极可信 YqKFPqYLQY Q2（脱酰胺基）Q6（脱酰胺基） 8.95 3.04 2 689.583 3 1 378.159 4
表 7 组分Ⅱ与β-酪蛋白的氨基酸序列匹配数据
TTaabbllee 77 MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd β-caasseeiinn
匹配度 序列 修饰 可能性相关系数对比打分 价态 质荷比/D 分子质量/D极可信 PVVVPPFLQPEVm M13（氧化反应） 30.25 3.01 0.04 2 734.750 0 1 468.492 7极可信 PVVVPPFLqPEVm Q9（脱酰胺基）M13（氧化反应） 20.34 2.90 2 734.750 0 1 468.492 7
表 8 组分Ⅱ与κ-酪蛋白的氨基酸序列匹配数据
TTaabbllee 88 MMaattcchhiinngg ddaattaa ooff aammiinnoo aacciidd sseeqquueenncceess bbeettwweeeenn componneenntt Ⅱ aanndd κ-caasseeiinn
匹配度 序列 修饰 可能性 相关系数对比打分 价态 质荷比/D分子质量/D极可信 SRYPSYGLnYYqQKPV N9（脱酰胺基）Q12（脱酰胺基） 23.36 3.89 0.02 3 655.92 1 965.74极可信 SRYPSYGLnYYQQKPV N9（脱酰胺基） 14.76 3.83 3 655.92 1 965.74极可信 SRYPSYGLnYYQqKPV N9（脱酰胺基）Q13（脱酰胺基） 14.76 3.80 3 655.92 1 965.74极可信 INNQFLPYPY 15.50 3.06 0.05 2 635.42 1 269.83极可信 INNqFLPYPY Q4（脱酰胺基） 9.63 3.05 0.02 2 635.75 1 270.49极可信 INNQFLPYPY 28.95 3.00 2 635.75 1 270.49极可信 INnQFLPYPY N3（脱酰胺基） 9.63 2.99 2 635.75 1 270.49极可信 INnQFLPYPY N3（脱酰胺基） 7.69 2.92 2 635.42 1 269.83极可信 INnQFLPYPY N3（脱酰胺基） 20.97 2.92 0.00 2 635.67 1 270.33极可信 INNqFLPYPY Q4（脱酰胺基） 11.60 2.91 2 635.67 1 270.33极可信 INNqFLPYPY Q4（脱酰胺基） 7.69 2.90 2 635.42 1 269.83极可信 InNQFLPYPY N2（脱酰胺基） 7.69 2.89 2 635.42 1 269.83
组分Ⅱ在4 种酪蛋白（α 1、α 2、β、κ）中都有匹配的肽段，结果见图2。分析软件的导出数据见表5～8。图2A中标示的深色部分代表了氨基酸序列匹配度为“极可信”，所以在实验结果中，只选取深色部分的氨基酸序列。表5是软件检测导出的“极可信”部分的数据。其中，“Q6（脱酰胺基）”6号位置的Q（Gln，谷氨酰胺）有脱氨基现象；“相关系数”是搜库软件中打分相关系数，作为筛选条件参比；“对比打分”表示搜库对比打分；“价态”代表带H的个数，有1、2、3价；“质荷比”代表价态的分子质量；“分子质量”表示肽段的分子质量。筛选条件：当相关系数大于1.9时，价态为1；当相关系数大于2.2时，价态为2；当相关系数大于3.75时，价态为3；结果便有极高的可信度。因此，结合图2A和表5分析可知，组分Ⅱ在α 1-酪蛋白中的匹配的氨基酸序列有3 段，分别是：LGYLEQLLR、FVAPFPEVFGK和YVPLGTQYTDAPSF。综合分析图2B和表6可知，组分Ⅱ在α 2-酪蛋白中的极可信氨基酸序列是YQKFPQYLQY。综合分析图2C和表7，组分Ⅱ在β-酪蛋白中的极可信的氨基酸序列是PVVVPPFLQPEVM。根据图2D和表8分析可知，组分Ⅱ在κ-酪蛋白中的极可信匹配的氨基酸序列有2 段，分别为：SRYPSYGLNYYQQKPV 和INNQFLPYPY。
2.2.2 组分Ⅲ的氨基酸序列
根据2.1节的结果，可以很明显得知组分Ⅲ的氨基酸序列有2 种可能，即Ser-Tyr（SY）、Tyr-Ser（YS）。经过与4 种酪蛋白（α 1、α 2、β、κ）的氨基酸组成比对，最终确定为α s2-f（56～57）∶YS。
综合MS检测结果，与4 种酪蛋白（α 1、α 2、β、κ）的氨基酸组成比对，组分Ⅱ和组分Ⅲ的短肽片段共有8 个，分别为：从N端，α s1-f（25～35）∶FVAPFPEVFGK，α s 1-f（1 0 3～1 1 1）∶L G Y L E Q L L R，α s 1-f （1 7 8～1 9 0）∶Y V P L G T Q Y T D A P S F，α s 2-f （56～57）∶YS，α s2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY，β-f（9 0～1 0 2）∶P V V V P P F L Q P E V M，κ-f （3 4～4 9）∶S R Y P S Y G L N Y Y Q Q K P V，κ-f （52～61）∶INNQFLPYPY。
2.3 氨基酸片段的ACE活性抑制效果检测
将上述8 个片段采用固相合成法制备，纯度大于95%，合成产物由上海楚肽生物科技有限公司制备。ACE活性抑制效果检测采用分光光度方（HHL法）进行检测。根据研究结果，这些肽片段对ACE活性抑制主要是竞争性抑制，因此，可根据其对ACE活性抑制率的大小及其随片段质量浓度的变化关系判断其是否具有ACE活性抑制作用。检测结果见图3和表9～16。
图 3 αss22-f（566～ 5577） ∶YS的质量浓度（AA）、α
ss22-f（98～110077）∶YQKFPQYLQY质量浓度（BB）、κ-f（522～6611）∶INNQFLPYPY的质量浓度（C）与AACCEE活性抑制率的关系曲线
Fig.3 Correlation curves between concentrations of α
s2-f （56-57）:YS，α
s2-f （98-107）， κ-f （52-61） and percentage inhibition of ACE activity
表 99 片段α
ss11-f（255～ 3355）∶FVAPFPEVFGK的ACE活性抑制作用
Table 9 Inhibitory effect of α
ss11-ff （2255-35）:FVAPFPEVFGK on ACE activittyy
样品质量浓度/ （μg/mL） A 228 nmACE活性抑制率/% 结果判断A1/40 0.115 0 11.94 由5 个质量浓度样品的测试结果可以判断，其结果没有线性关系，因此，该片段的ACE活性抑制效果较差A2/80 0.118 3 8.73 A3/120 0.117 3 9.80 A4/160 0.102 5 25.67 A5/200 0.101 0 27.27 B 0.126 5 C 0.033 0
表 100 片段α
ss11-f（103～111111）∶LGYLEQLLR对ACE活性的抑制作用
Table 10 Inhibitory effect ofα
ss11-f （110033-111111）∶LGYLEQLLR on ACE activittyy
样品质量浓度/ （μg/mL） A 228 nmACE活性抑制率/% 结果判断A1/40 0.148 0 6.53 由5 个质量浓度样品的测试结果可以判断，其结果没有线性关系，因此，该片段的ACE活性抑制效果较差A2/80 0.132 7 19.88 A3/120 0.151 3 3.63 A4/160 0.141 3 12.34 A5/200 0.143 0 10.89 B 0.155 5 C 0.040 7
?
表 111 片段α
ss11-f（AC 17 E
8活～ 性11
99的00
）抑∶制Y
V作P用L
GTQYTDAAPPSSFF对
Table 11 Inhibitory effect of α
ss11-f （117788-119900）∶YVPLGTQYTDAPSFF oonn ACE activviittyy
样品质量浓度/ （μg/mL） A 228 nmACE活性抑制率/% 结果判断A1/40 0.132 0 4.46 由5 个质量浓度样品的测试结果可以判断，由于所测吸光度大于空白，且结果无规律性。因此，该片段的ACE活性抑制效果较差A2/80 0.137 5＞B A3/120 0.135 0 1.79 A4/160 0.142 67＞B A5/200 0.152 7＞B B 0.137 0 C 0.025 0
根据表12的检测结果，将样品α s2-f（56～57）∶YS质量浓度和ACE抑制率进行作图拟合，结果见图3A，根据图3A拟合的方程计算片段α s2-f（56～57）∶YS对ACE抑制的IC 50值为11.89 μg/mL。因此，该片段具有很强的ACE活性抑制作用。根据表13的检测结果，将样品α s2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY质量浓度和ACE抑制率进行作图拟合，结果见图3B，经拟合的方程计算片段α s2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY对ACE抑制的IC 50值为11.75 μg/mL。因此，该片段具有很强的ACE活性抑制作用。根据表16检测结果，将样品κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY质量浓度和ACE抑制率进行作图拟合，结果见图3C，经拟合的方程计算片段κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY对ACE抑制的IC 50值为421 μg/mL。与水解物的超滤透出物相比（IC 50= 250 μg/mL），该值较大，可能不是主要ACE抑制肽。
表 122 片段α
ss22-f（566～ 5577） ∶YS对ACE活性的抑制作用
Table 12 Inhibitory effect of α
ss22-ff （5566-5577）∶YS on ACE actiivityy
样品质量浓度/ （μg/mL） A 228 nmACE活性抑制率/% 结果判断A1/5 0.037 5 31.71 由检测结果可知，该片段有较好的ACE活性抑制作用，且随着质量浓度变化而变化。可判断该片段具有ACE活性抑制作用A2/10 0.035 3 42.28 A3/20 0.032 3 56.91 A4/40 0.030 7 65.04 A5/60 0.027 3 81.30 B 0.044 0 C 0.023 5
表 133 片段α
ss22-f（98～110077）∶YQKFPQYLQY对ACE活性抑制作用
Table 13 Inhibitory effect ofα
ss22-ff （9988-110077）∶YQKFPQYLQY on ACE activittyy
样品质量浓度/ （μg/mL） A 228 nmACE活性抑制率/% 结果判断A1/5 0.039 0 35.82 由检测结果可知，该片段有较好的ACE活性抑制作用，且随着质量浓度变化而变化。可判断该片段具有ACE活性抑制作用A2/10 0.036 5 47.01 A3/20 0.032 3 65.67 A4/40 0.030 3 74.63 A5/60 0.029 7 77.61 B 0.047 0 C 0.024 7
表 144 片段β-f（90～110022）∶PVVVPPFLQPEVM对ACE活性抑制作用
Table 14 Inhibitory effect ofβ-ff （9900-110022）∶PVVVPPFLQPEVMM oonn ACE a ctivviittyy
样品质量浓度/ （μg/mL） A 228 nmACE活性抑制率/% 结果判断A1/40 0.073 7 18.22 由5 个质量浓度样品的测试结果可以判断，由于所测吸光度大于空白，且结果无规律性。因此，该片段的ACE活性抑制效果较差A2/80 0.081 0 1.17 A3/120 0.111 0＞B －68.87 A4/160 0.077 0＞B 10.51 A5/200 0.096 7＞B －35.41 B 0.081 5 C 0.038 7
表 155 片段κ-f（344～4499）∶SRYPSYGLNYYQQQQKKPPVV
对ACE活性抑制作用
Table 15 Inhibitory effect of κ-ff （3344-4499）∶SRYPSYGLNYYQQKKPPVV，on ACE activiittyy
样品质量浓度/ （μg/mL） A 228 nmACE活性抑制率/% 结果判断A1/40 0.084 7 13.77 由5 个质量浓度样品的测试结果可以判断，结果无规律性。因此，该片段的ACE活性抑制效果较差A2/80 0.087 7 8.11 A3/120 0.089 3 5.09 A4/160 0.081 3 20.19 A5/200 0.078 0 26.42 B 0.092 0 C 0.039 0
表 166 片段κ-f（522～6611）∶INNQFLPYPY对ACE活性抑制作用
Table 16 Inhibitory effect of κ-ff （5522-6611）∶INNQFLPYPY on ACE activittyy
样品质量浓度/ （μg/mL） A 228 nmACE活性抑制率/% 结果判断A1/40 0.122 3 18.18 由检测结果可知，该片段有ACE活性抑制作用，且随着质量浓度变化而变化。可判断该片段具有ACE活性抑制作用A2/80 0.110 0 29.03 A3/120 0.109 0 29.91 A4/160 0.107 3 31.38 A5/200 0.104 7 33.72 B 0.143 0 C 0.029 3
因此，根据上述ACE活性抑制效果检测，在所获得的8 个片段中，有3 个具有ACE活性抑制作用，其中α s2-f （56～57）∶YS和α s2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY具有很强的ACE活性抑制效果。
酪蛋白是牛乳中含量最高，种类最多的蛋白质，在其母蛋白中，含有多种生物活性片段，目前，研究人员已从酪蛋白，经不同的蛋白酶或微生物的水解液中分离出多种活性片段，包括抗菌肽 ［29-31］、促钙吸收肽 ［32］、降血压肽等，其中，研究人员利用不同蛋白酶水解或微生物发酵，从牛乳酪蛋白中分离获得了多个降压肽片段（表17）。这些片段，由于所用酶或微生物的不同，其片段的氨基酸组成不同，其组成规律也不完全符合Ile-Lys-Pro （IKP）、Ile-Glu-Pro（IEP）和Ile-Lys-Tyr（IKY） ［41］的氨基酸结构组成。本研究模拟人体消化系统，先经胃蛋白酶水解，再经胰蛋白酶水解酪蛋白，获得的具有ACE活性抑制肽，α s2-f（56～57）∶YS、α s2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY 和κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY，在食用过程中，不会受胃肠系统蛋白酶的影响而发生结构变化，功能稳定。另外，其氨基酸组成，特别是α s2-f（56～57）∶YS，不符合文献［41］规律，但具有很好的ACE抑制活性。根据目前的研究，源于蛋白质水解物的肽片段与ACE之间的相互作用为竞争性抑制，肽与ACE嵌合的袋状部位可分为S1、S2和S1'，其中S1袋状部位由Ala 354、Glu 384和Tyr 523残基组成；S2袋状部位由Gln 281、His 353、Lys 511、His 513和Tyr 520残基组成；S1'含有Glu 162残基 ［42-43］。另外，不同来源的ACE抑制物与ACE嵌合作用的部位不同 ［44］。对于所获得的3 个片段，与ACE如何进行作用，还需要进一步研究。
表 17 源于牛乳酪蛋白的ACE抑制肽
TTaabbllee 1177 AACCEE iinnhhiibbiittiioonn ppeeppttiiddee ffrroomm bboovviinnee ccaasseeiinn
来源 肽段序列 酶/微生物 IC 50值 文献β-酪蛋白 f（187～189）∶Ile-Gln-Ala f（116～118）∶Val-Glu-Pro 曲霉菌胞内蛋白酶 （32.9±9.2） μmol/L （63.7±12.0） μmol/L［9-10］β-酪蛋白 f（192～196）∶LYQQP 嗜热菌蛋白酶 4～5 μmol/L ［33］酪蛋白 Met-Lys-Pro（MKP） 0.43 μmol/L ［34］酪蛋白 YPELF 嗜冷微生物（Arsukibacterium ikkense）分离的蛋白酶 3.5 μmol/L ［35］κ-酪蛋白 f（25～30）∶Arg-Tyr-Pro-Ser-Tyr-Gly f（15～18）∶Asp-Glu-Arg-Phe AS1.398 中性蛋白酶水解酪蛋白 （54±1.2）μg/mL （21±0.8）μg/mL ［36］κ-酪蛋白 f（96～102）∶ARHPHPH菌种（Lb. Acidophilus LAFTI ®L10）发酵的奶酪0.17 mg/mL ［37］α s1-酪蛋白f（1～9）∶RPKHPIKHQ f（1～7）∶RPKHPIK f（1～6）∶RPKHPI 0.22 mg/mL α s1-酪蛋白 f（24～32）∶FVAPFPEVF 0.19 mg/mL β-酪蛋白 f（193～209）∶YQEPVLGPVRGPFPIIV 0.20 mg/mL β-酪蛋白 f（133～138）∶LHLPLP f（58～76）∶LVYPFPGPIPNSLPQNIPP Enterococcus faecalis CECT 5727发酵牛乳 ≤5 μmol/L ［38］α S2-酪蛋白f（25～32）∶NMAINPSK f（81～89）∶ALNEINQFY f（81～91）∶ALNEINQFYQK f（92～98）∶FPQYLQY f（174～179）∶FALPQY f（174～181）∶FALPQYLK f（182～184）∶TVY胰蛋白酶60 μmol/L 219 μmol/L 264 μmol/L 14 μmol/L 4.3 μmol/L 4.3 μmol/L 15 μmol/L ［39］α s1-酪蛋白 f（90～94）∶RYLGY f（143～149）∶AYFYPEL 胃蛋白酶0.71 μmol/L 6.58 μmol/L ［40］α S2-酪蛋白 f（89～95）∶YQKFPQY 20.08 μmol/L
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Separation of ACE Inhibitory Peptides from Casein Hydrolysate and Analysis of Their Amino Acid Sequences
HU Zhihe
1，2， XIA Lei
1， SUN Zhengang
3， WU Wenqi
3， FENG Yongqiang
3， XUE Lu
1，2， LIU Xujin
1， JIA Ying
1
（1. College of Biotechnology and Food Science， Tianjin University of Commerce， Tianjin 300134， China；
2. Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology， Tianjin 300134， China；3. Tianjin Haihe Dairy Co. Ltd.， Tianjin 300402， China）
Abstract：The objectives of this study were to separate angiotensin converting enzyme （ACE） inhibitory peptides from casein hydrolysate produced by sequential hydrolysis of casein with pepsin followed by trypsin and to analyze their amino acid sequences. The hydrolysate was concentrated by ultrafiltration and separated by Sephadex G-15 column chromatography into three components. Components Ⅱ and Ⅲ， which had higher inhibitory effect on ACE activity， were collected. Ion chromatography was used to analyze amino acid composition of fragments from the two components. LCMS/MS was used to analyze amino acid sequence of fragments， solid-phase synthesis was used to synthetize short-chain peptides， and a spectrophotometric method was used to test the inhibitory effect of hydrolysate on ACE activity. Results showed that component Ⅱ contained eight amino acids including valine， serine， proline， leucine， phenylalanine， glutamatic acid， asparaginic acid， and tyrosine； while component Ⅲ contained trace amounts of serine and tyrosine. Eight fragments were obtained from both components by LC-MC/MC analysis， including three ACE inhibitory fragments α s2-f （56-57）:YS，α s2-f （98-107）:YQKFPQYLQY and κ-f （52-61）:INNQFLPYPY with half maximal inhibitory concentration （IC 50） of 11.89，11.75 and 421 μg/mL， respectively.
Key words：bovine casein； pepsin； trypsin； angiotensin converting enzyme （ACE）； inhibitory peptide
中图分类号：TS252.42
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）24-0156-08
doi：10. 7506/spkx1002-6630-201524028
收稿日期：2015-06-28
基金项目：天津市科技支撑项目（14ZCZDNC00017）；天津市高等学校创新团队项目（TD12-5049）；天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目（14JCZDJC34500）；天津市北辰区科技计划补助项目（2014-CXYH-KF-001）
作者简介：胡志和（1962—），男，教授，硕士，研究方向为专用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn