图 1 游离甾醇化学结构示意图
Fig.1 Chemical structures of free phytosterols
项雷文 1，陈国泰 1，翁佳敏 1，陈文韬 1，汪少芸 2，*
（1.福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院，福建 福清 350300；
2.福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108）
摘 要：为快速测定荔枝果肉中游离植物甾醇含量，建立高效液相色谱-二极管阵列检测器结 合基于交替三线 性分解算法的二阶校正方法。基本色谱条件：岛津ODS-SP柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相体积分数95%乙腈溶液，检测波长范围为190～340 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量20.0 μL。结果表明，‘兰竹’和‘乌叶’荔枝样品中菜油甾醇含量分别为24.1 μg/g和27.4 μg/g，两种荔枝样品豆甾醇含量分别为25.8 μg/g和26.7 μg/g，菜油甾醇和豆甾醇加标回收率分别为（95.25±0.78）%和（96.83±1.01）%。所建立的方法简单、准确、灵敏度高且可靠，可用于检测荔枝果肉中游离植物甾醇含量。
关键词：高效液相色谱；二极管阵列检测器；交替三线性分解；二阶校正；植物甾醇
植物甾醇是果蔬中的生物活性物质，进入人体后可降低体内胆固醇含量 ［1］。文献报道有多种检测植物甾醇的方法，如洋地黄皂苷沉淀法 ［2］，植物甾醇经酶催化氧化后的比色法 ［3］、薄层色谱法 ［4］、分光光度法 ［5］、红外光谱法 ［6］等，还有使用不同检测器的气相色谱法 ［7-8］和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法 ［9-13］。但是沉淀法和比色法只能定量总植物甾醇，气相色谱法在检测植物甾醇前需要衍生化处理，质谱定量中植物甾醇信号较弱。因此植物甾醇定量分析首选HPLC法。
按常规HPLC法，配合相应的提取技术及前处理方法 ［14-17］，虽能得到比较满意的结果。但植物甾醇常作为细胞膜的重要结构成分和脂质存在于植物细胞，有的以游离态存在，有的与糖类、脂肪酸等结合以结合态存在，如甾醇酯、甾苷和乙酰基甾苷等 ［18］，已发现的植物甾醇超过250 种 ［19］。最具代表性的和含量较高的植物甾醇有菜油甾醇、胆甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，而麦角甾醇则常存在于发霉的植物中 ［19］。植物甾醇是分子结构带有四环环戊二烯［α］的菲环和在第17个碳原子上有一条柔性长链的类固醇化合物及其衍生物 ［20］，不同植物甾醇结构相似（图1），因而常规色谱分析中要达到基线分离需要足够长的洗脱时间；并且果蔬为复杂体系，检测前需要对样品进行预处理，尽量去除干扰，以求响应信号的简单化。因此，需要对常规LC方法进行改进。
图 1 游离甾醇化学结构示意图
Fig.1 Chemical structures of free phytosterols
交替三线性分解（a l t e r n a t i n g t r i-l i n e a r decomposition，ATLD）算法利用基于切尾奇异值分解的Moore-Penrose广义逆计算和交替迭代来进行三线性数据分解，使损失函数即残差阵元素的平方和达到极小值，详见参考文献［21］。二阶校正方法以“数学分离”来部分代替或强化“理化分离”，在有未知干扰物和背景条件下实现复杂体系中目标分析组分的快速有效分离定量，定量条件不要求达到基线分离，洗脱时间缩短。
本实验以荔枝果肉为检测对象，利用HPLC-二极管阵列检测器（HPLC-diode array detector，HPLC-DAD）结合基于ATLD算法的二阶校正方法，使预处理简单快速，并允许部分色谱峰重叠，简化测量步骤并节省检测时间，从而建立起一种快速、稳定的植物甾醇分析方法。结果显示，其预处理简单，单次样本测试所耗时间较短，可作为快速定量植物甾醇的可选择方法。
1.1 材料与试剂
荔枝市购，经本校植物学教师鉴定为‘兰竹’、‘乌叶’2 个品种。
菜油甾醇、胆固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、麦角甾醇 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 百灵威科技有限公司；硫酸、乙醇、正己烷、特丁基对苯二酚、氢氧化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；实验用水为实验室自制去离子水。
1.2 仪器与设备
FW100高能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；101-A型数显式电热恒温干燥箱 上海阳光实验仪器有限公司；英展ALH-3天平 上海英展机电企业有限公司；BLST-500Q球形脂肪抽出器 上海比朗仪器有限公司；UGC-12C旋转式水浴氮吹仪 北京优晟联合科技有限公司；RE52A型旋转蒸发器 巩义市予华仪器有限责任公司；HH-4型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；超声波清洗机 广州邦洁超声波设备有限公司；1100 HPLC仪（配有G1311A四元泵、G1313A自动进样器、G1322A在线脱气机、G1316柱温箱、G1315A二极管阵列检测器） 安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准品配制
菜油甾醇（0.5 mg/mL）、胆固醇（1.0 mg/mL）、豆甾醇（0.5 mg/mL）、β-谷甾醇（1.0 mg/mL）和麦角甾醇（1.0 mg/mL）溶于甲醇中配成标准物质储备液，置于冰箱－20 ℃保存。在使用之前取出放至室温，而后稀释成系列质量浓度的溶液。
1.3.2 荔枝果肉样品中植物甾醇提取
荔枝果肉样品中植物甾醇提取及预处理程序参考文献［22］。荔枝去壳去核后，称质量，将果肉洗净用滤纸擦干，将其切成片状。在105 ℃条件下烘至恒质量，将荔枝果肉放入粉碎机内搅碎成颗粒状，得到荔枝果肉干品，放入干燥器中保存。用天平准确称量10.00 g荔枝果肉粉，折好滤纸套后放入，再安装索氏提取器，加入提取溶剂正己烷至圆底烧瓶，将荔枝果肉粉中的粗脂肪提取出来。用旋转蒸发器减压挥尽得到的粗脂肪中的溶剂后，于圆底烧瓶中加入10 mL盐酸的乙醇溶液，安装回流装置于80 ℃水浴中加热1 h，每隔10 min振荡圆底烧瓶一次至回流结束，结束后冷却至室温，再加入氢氧化钾的乙醇溶液20 mL，再安装回流装置于70 ℃水浴中加热1 h，每隔10 min振荡圆底烧瓶一次至回流结束，结束后冷却至室温。
冷却至室温后加入100 mL水和正己烷，搅拌均匀后转移至分液漏斗中萃取3～4 次，合并萃取液，将多次实验（共100.00 g荔枝果肉粉）所得的萃取液集中，用旋转蒸发仪蒸除正己烷后浓缩得甾醇粗品，用甲醇溶解定容至10 mL，得到检测样品。
1.3.3 校正样品配制
该方法的组内精密度（可重复性）通过测定单点质量浓度（160 μg/mL）来获得，检测6 次取其平均值，并获得相对标准偏差，即可确认色谱条件的系统精密度。所配校正样的质量浓度范围见表1。
表1 校正样质量浓度
Taabbllee 11 PPhhyyttoosstteerrooll ccoonntteennttss ooff ccaalliibbrraattiioonn ssaammpplleess
μg/mL
校正样 菜油甾醇 豆甾醇C 1 120.0 0.0 C 2 100.0 20.0 C 3 80.0 40.0 C 4 60.0 60.0 C 5 50.0 70.0 C 6 40.0 80.0 C 7 20.0 100.0 C 8 0.0 120.0
1.3.4 加标实际样品配制
样品加入标准品后，其后样品提取及预处理程序同1.3.2节。方法的准确度通过计算样品的加标回收率来确定。
1.3.5 色谱条件
色谱柱：岛津ODS-SP柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（95∶5，V/V）溶液；检测波长190～340 nm；进样量20 μL；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min。
2.1 色谱分离条件的优化
图2 混合植物甾醇标准物质HPLC色谱图
Fig.2 HPLC profi les of mixed phytosterol standard materials
植物甾醇是极性非常弱的小分子化合物，在反相色谱柱上有很强的保留性。因此植物甾醇需要高浓度的有机溶剂来降低其在色谱柱上的保留性来实现分离。为了得到较好的分离效果，选择波长210 nm作为检测波长，对分析柱和流动相进行了优化，5 种植物甾醇标准品的HPLC色谱结果如图2所示。在所采用的HPLC色谱条件下，麦角甾醇、胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的保留时间分别为10.30、13.10、14.79、15.16、17.13 min，分析时间适中。由于不同植物甾醇分子结构极其相似，菜油甾醇和豆甾醇色谱峰出现重叠，未能实现基线分离。如用常规LC法来定量，会因为谱峰重叠及未知干扰的影响使得各组分的保留时间及含量出现偏差。因此需要对色谱峰进行分段解析。
分段解析主要针对菜油甾醇和豆甾醇重叠部分进行，利用基于三线性分解的二阶校正方法所得到的纯光谱数据及纯色谱数据分别绘图，再与标 准品在相同条件下测得的光谱和色谱图形进行对比，并以相应谱图的重合程度作为定性依据，得到更直观的定性结果。再根据标样质量浓度进行定量分析，得到预测样含量，并以加标回收率及算法品质因子来验证和评价本实验所采用的方法。
实际样、加标实际样及校正样的保留时间在14.4～15.8 min之间的色谱对照图如图3所示。
图 3 实际样、加标实际样及校正样的色谱对照图
Fig.3 Comparative chromatographic profi les of spiked real sample，real sample and calibration sample
2.2 定性分析
图 4 解析出的谱图与真实谱图对比Fig.4 Comparison between resolved profi les and actual profi les
前段数据包含2 个目标分析组分，各贡献一个因子，其余信号包括背景、噪声干扰等提供一个因子，即选取的解析组分数为3；后段数据包含一个目标分析组分，其余信号提供一个因子，即选取的解析组分数为2。ATLD算法在相应组分数条件下，解析HPLC-DAD得到的矩阵数据所构成的三维数阵，解析出的图谱与由校正样解析出的标准品图谱的对照图如图4所示。算法解析出的色谱、光谱图的轮廓与对照品的色谱、光谱图分别重合较好，说明从色谱、光谱2 个角度上都证明了实际样中菜油甾醇和豆甾醇的存在。
2.3 定量分析
由ATLD算法分解所得到的相对浓度矩阵对照标样含量进行后续回归处理就能够实现定量预测。本方法得出的实际样中菜油甾醇和豆甾醇的预测含量如表2所示。
表2 ATLD算法分辨获得的实际样品中菜油甾醇和豆甾醇的含量
TTaabbllee 22 RReessoollvveedd ccoonntteennttss ooff ccaammppeesstteerrooll aanndd ssttiiggmmaasstteerrooll iinn real samples using ATLLDD
荔枝样品 质量/g ‘兰竹’含量/（μg/g） ‘乌叶’含量/（μg/g）菜油甾醇 豆甾醇 菜油甾醇 豆甾醇1 20 23.61 26.34 26.12 26.17 2 20 24.33 24.95 27.38 25.54 3 60 24.84 25.79 26.70 26.48 4 60 23.23 25.32 28.18 27.58 5 100 24.68 26.42 28.46 26.35 6 100 23.87 25.98 27.63 27.86平均值 24.09±0.64 25.80±0.58 27.41±0.88 26.67±0.88
对算法的评价用到的品质因子计算和纯分析物信号密切相关，包括：灵敏度、选择性、检测限及与预测精密度相关的预测均方差等 ［21］。计算的各品质因子见表3。加标回收率的计算结果见表4。
表 3 ATLD算法品质因子
Taabbllee 33 FFiigguurreess ooff mmeerriitt ooff tthhee pprrooppoosseedd mmeetthhoodd uussiinngg AATTLLDD
品质因子 菜油甾醇 豆甾醇灵敏度/（mL/μg） 0.28 0.20选择性 3.85 2.76检测限/（μg/mL） 0.43 0.31定量检测限/（μg/mL） 1.42 1.02
表 4 加标回收率实验结果TTaabbllee 44 RReeccoovveerriieess ooff pphhyyttoosstteerroollss ffrroomm ssppiikkeedd lliittcchhii ppuullpp
荔枝样品 加标量/ （μg/mL）加标回收率/%菜油甾醇 豆甾醇1 25 95.18 97.20 2 25 94.29 97.01 3 50 95.34 95.26 4 50 96.08 98.17 5 100 94.45 96.21 6 100 96.17 97.33平均值 95.25±0.78 96.83±1.01
由表4可知，菜油甾醇和豆甾醇的加标回收率平均值分别为：（95.25±0.78）%和（96.83±1.01）%，加标回收率小于100%。提取植物甾醇过程中，受热会使植物甾醇分子双键断裂，而导致损失。通过查表可得到t-检验的t值，t （6，0.10）=1.940。由t-检验公式计算得到的t值分别为0.784、0.946，它们均小于t （6，0.10）值。以上结果表明二阶校正方法得到的结果是可靠的。
2.4 分析方法的应用
表5 荔枝果肉样品中植物甾醇含量
TTaabbllee 55 TThhee ccoonntteennttss ooff pphhyyttoosstteerrooll iinn lliittcchhii ppuullpp
μg/g
注：ND.低于检测限。
样品 麦角甾醇 胆甾醇 菜油甾醇 豆甾醇 β-谷甾醇 总植物甾醇‘兰竹’ ND 37.2 24.1 25.8 15.3 102.4‘乌叶’ ND 43.1 27.4 26.7 16.0 113.2
为验证所建立的植物甾醇定量分析方法，从荔枝样品中提取、分离并检测植物甾醇。样品处理如上所述，每个样品5 次平行。分析在最优条件下进行。所测得的胆固醇、麦角甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇的含量列于表5。总植物甾醇含量随荔枝品种不同有所区别，含量在102.4～113.2 μg/g之间。各种植 物甾醇中，‘兰竹’和‘乌叶’荔枝果肉中胆甾醇含 量最高，分别为37.2 μg/g和43.1 μg/ g。β-谷甾醇含量最少，分别为15.3 μg/g和16.0 μg/g。菜油甾醇和豆甾醇含量差不多，分别为24.1 μg/g和27.4 μg/g，25.8 μg/g和26.7 μg/g。该检测结果和气相色谱分析荔枝中植物甾醇含量结果 ［23］相近。
本实验所建立的用HPLC-DAD结合基于ATLD算法的二阶校正方法，能够快速、可靠地对荔枝果肉中麦角甾醇、胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇定量分析。与传统的LC法相比，该方法的优势在于使预处理简单化，色谱条件相对简单并允许部分色谱峰重叠及存在未知干 扰，测试所耗时间较短，试剂消耗量相对较少。
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Determination of Free Phytosterols in Litchi Pulp by HPLC-DAD Coupled with Second-Order Calibration Based on Alternating Trilinear Decomposition
XIANG Leiwen
1， CHEN Guotai
1， WENG Jiamin
1， CHEN Wentao
1， WANG Shaoyun
2，*
（1. School of Ocean Science and Biochemistry Engineering， Fuqing Branch of Fujian Normal University， Fuqing 350300， China；2. College of Biological Science and Engineering， Fuzhou University， Fuzhou 350108， China）
Abstract：A rapid method to quantify free phytosterols in litchi pulp was established with high performance liquid chromatography with diode array detection （HPLC-DAD） coupled with second-order calibration method based on alternating trilinear decomposition （ATLD） algorithm. The chromatographic conditions were simplifi ed by applying secondorder calibration method. The mobile phase was 95% aqueous acetonitrile （V/V） at a fl ow rate of 1.0 mL/min. The injection volume was 20.0 μL. The temperature of inertsil ODS-SP （150 mm × 4.6 mm， 5 μm） column was set at 30 ℃. The detection wavelengths were 190-340 nm. The average spiked recoveries of campesterol and stigmasterol in litchi pulp were （95.25 ± 0.78）% and （96.83 ± 1.01）%， respectively. The pulp of “Lanzhu” and “Wuye” litchi was detected to contain 24.1 and 27.4 μg/g campesterol， and 25.8 and 26.7 μg/g stigmasterol， respectively. The newly established method is simple， accurate， highly sensitive and reliable， and can be used to determine free phytosterols in litchi pulp.
Key words：high performance liquid chromatography （HPLC）； diode array detector （DAD）； alternating trilinear decomposition （ATLD）； second-order calibration； phytosterols
中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）24-0172-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201524031
收稿日期：2015-06-12
基金项目：福建省省级重点学科“食品科学与工程”建设项目（闽教高［2012］48号）；福建省区域科技重大项目（ 2014N3005）
作者简介：项雷文（1975—），男，副教授，博士，主要从事天然产物综合利用，生物大分子分离与表征，食品中美拉德反应研究。E-mail：xiangleiwen@163.com
*通信作者：汪少芸（1972—），女，教授，博士，主要从事食品化学、生物活性蛋白质、酶和多肽及食品生物技术研究。E-mail：shywang@fzu.edu.cn