表1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution parameterss
时间/min 流速/ （mL/min）流动相体积分数/%乙腈 水0.0 0.3 30 70 2.0 0.3 70 30 3.0 0.3 70 30 3.2 0.3 30 70 5.0 0.3 30 70
张 月，韩丙军，赵方方
（中国热带农业科学院分析测试中心，海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室，海南 海口 5711 01）
摘 要：建立木瓜中联苯肼酯及其代谢产物联苯肼酯烯的超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱分析方法。样品用乙腈和0.25%乙酸溶液匀浆提取，盐析，分取上清液，同时加入0.25%抗坏血酸溶液于离心管中，衍生60 min后待测。目标化合物经Waters ACQUITY UPLC BEH C 18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，采用三重四极杆串联质谱多反应监测模式进行定性定量分析。结果表明，在1.0～10.0 ng/kg添加量时，联苯肼酯及联苯肼酯烯的回收率分别为86.2%～109.8%和78.3%～97.3%，相对标准偏差分别为4.0%～7.0%和4.5%～8.8%（n=5）。方法的 线性范围为0.25～2.0 ng/m L，相 关系数（r）为0.99 9 8。该方法对联苯肼酯的定量限均为1×10 －6mg/kg，能满足木瓜中联苯肼酯的残留检测要求。
关键词：超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱；木瓜；联苯肼酯；联苯肼酯烯；残留
联苯肼酯是联苯肼类杀螨剂，是一种新型选 择性杀螨剂。其纯品外观为白色固体结晶。美国科聚亚公司2008年在我国获得登记。其作用机理为对螨类的中枢神经传导系统的γ-氨基丁酸受体的独特作用，也有研究表明联苯肼酯作用于螨类线粒体，抑制细胞色素bQo位点复合物Ⅲ的合成，具有杀卵活性和对成螨的击倒活性，且持效期长 ［1-8］。主要用于果树、棉花、蔬菜和茶叶上害螨的防治 ［9］，很多国家和地区在不同作物上均制定了不同的残留限量标准，其中美国 ［10］为0.05～15 mg/kg，加拿大 ［10］为0.01～1.5 mg/kg，澳大利亚 ［10］为0.01～2 mg/kg，欧盟 ［11］为0.01～2 mg/kg，日本 ［12］为0.01～10 mg/kg。根据2006年联合国粮农组织及世界卫生组织农药残留联合专家会议报告 ［13］中 的残留定义为联苯肼酯及其代谢产物联苯肼酯烯之和，联苯肼酯烯以联苯肼酯计，因此检测联苯肼酯及其代谢产物具有重要的意义。
近年来有关联苯肼酯的文献报道大多是关于牛奶、葡萄酒、干花、浓缩果蔬汁、草莓、柑橘等中联苯肼酯的残留分析研究 ［14-20］。曹巍等 ［21］采用高效液相色谱分析联苯肼酯原药，肖峥 ［22］、张燕 ［23］等采用高效液相色谱法对联苯肼酯悬浮剂含量的测定，未见其在木瓜中残留检测的报道。本实验采用超高效液相色谱-串联质谱电喷雾正离子模式检测，建立了木瓜中 联苯肼酯及其代谢产物联苯肼酯烯的残留检测，结果满足农药残留检测的要求 ［24］。
1.1 材料、试剂与仪器
木瓜鲜果，采于海南省临高县国营红华农场，样品采集时间为2014年7月，样品分装后在－20 ℃冷冻贮藏。
联苯肼酯及联苯肼酯烯标准品（纯度≥99%） 农业部环境质量监督检验测试中心（天津）；乙腈（色谱极） 美国Fisher公司；抗坏血酸、乙酸（分析纯）广州化学试剂厂。
超高效液相色谱仪 美国Waters公司；API4000+三重四极杆质谱仪 美国AB公司；IKAT25匀浆机上海万捷科技有限公司；HH-6恒温水浴锅 常州赛普实验仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液的配制
标准溶液：分别准确称取0.050 g（精确至0.001 g）联苯肼酯及联苯肼酯烯标准品于2 个50 mL容量瓶中，乙腈溶解并定容，得到1 000 μg/mL标准储备液，于－18 ℃保存。
基质标准溶液：按样品前处理方法将空白样品（未有目标农药检出的样品）制成联苯肼酯基质溶液，用基质溶液稀释标准储备液制备成所需的定量标准溶液，临用现配。
1.2.2 样品前处理
供试木瓜采自海南岛（经测定不含目标化合物）。取全果样品采用四分法缩分，用食品料理机搅碎，混匀，留250 g样品。分别准确称取样品5.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，分别加入5.0 mL 0.25 %乙酸溶液和10.0 mL乙腈，提取过程依据NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》 ［25］标准方法进行。分取5 mL上层清液于15 mL离心管中，分别加入5 mL 0.25 %抗坏血酸于离心管中，充分混匀，于50 ℃水浴中衍生60 min，冷却，充分混匀，于40 ℃旋转蒸发器浓缩，用乙腈定容至5 mL，上机待测。
1.2.3 色谱条件
Waters ACQUITY UPLC BEH C 18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.30 mL/min；流动相乙腈-水，洗脱梯度见表1；进样量2 μL。
表1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution parameterss
时间/min 流速/ （mL/min）流动相体积分数/%乙腈 水0.0 0.3 30 70 2.0 0.3 70 30 3.0 0.3 70 30 3.2 0.3 30 70 5.0 0.3 30 70
1.2.4 质谱条件
电喷雾正离子扫描，多反应监测模式进行检测。碰撞气（氮气）压力：6mtorr；气帘气压力：137.9 kPa；雾化气压力：344.75 kPa；喷雾电压：4 500 V；离子源温度：600.0 ℃。选择性离子监测见表2。
表2 多反应监测模式下的保留时间、定性、定量离子、去簇电压及碰撞能量
TTaabbllee 22 RReetteennttiioonn ttiimmee， qquuaalliittaattiivvee aanndd qquuaannttiittaattiivvee iioonnss， ddeecclluusstteerriinngg ppootteennttiiaall， aanndd ccoolllliissiioonn eenneerrggyy iinn mmuullttiippllee rreeaaccttiioonn mmoonniittoorriinngg （MMRRMM） mmooddee
注：*.定量离子。
?
2.1 样品前处理条件的优化
提取剂的选择：比较了2 种提取剂乙腈和乙腈中加入乙酸混合提取剂的回收率，结果表明：乙腈提取剂的提取率偏低，致使回收率低于70%，而使用乙腈中加入乙酸混合提取剂的回收率能达到农药残留检测的要求，并最终确定采用乙腈中加入0.25%的乙酸提取。
2.2 质谱条件的优化
采用0.05 mg/L的联苯肼酯标准溶液，以10 μL/min的流速进行Q1扫描，确定母离子，在电喷雾正负离子模式下分别进行全扫描。结果发现：在电喷雾正离子模式下，响应较好，故选择在电喷雾正离子扫描模式下进行检测，可满足灵敏度要求。用蠕动泵仪10 μL/min的流速连续注射，对联苯肼酯进行一极质谱分析（Q1扫描），得到准确分子离子峰；对准确分子离子峰进行二极质谱分析（子离子扫描）得到碎片离子信息，优化碰撞能量（图1）。
图 1 多反应监测模式下联苯肼酯标准品（a）、木瓜空白样品（bb）、联苯肼酯加标样品（2.0 ng/kg）（c）、联苯肼酯烯加标样品（dd）总离子及定量离子流（ee）图
Fig.1 Total and quantitative ion current chromatograms of b ifenazate standard （a）， blank papaya sample （b）， sample spiked with bifenazate （c），and sample spiked with bifenazate-diazene （d）， under multiple reaction monitoring mode （e）
2.3 方法的线性方程、精密度和回收率
2.3.1 线性方程
将一定质量浓度的基质标准工作溶液按1.2.3节所述条件测定，以联苯肼酯的定量离子峰面积（y）为纵坐标，以其质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程及相关系数（表3）。结果表明：在0.25～2.0 ng/mL范围内，方程的线性关系良好。在此条件下，联苯肼酯的保留时间为2.35 min。
表3 联苯肼酯的线性方程及其相关系数
TTaabbllee 33 LLiinneeaarr eeqquuaattiioonn wwiitthh ccoorrrreellaattiioonn ccooeeffffi i cciieenntt ffoorr bbiiffeennaazzaattee
线性范围/（ng/mL） 线性方程 相关系数r 0.25～2.0 y = 2.46×10 6x+1.41×10 4 0.999 8
2.3.2 检出限和定量限
根据3 倍信噪比计算，木瓜中联苯肼酯的检出限为5.89×10 －6mg/kg，通过实际添加回收实验确定木瓜中联苯肼酯的定量限为1.0×10 －6mg/kg。
2.3.3 精密度和回收率
在1.0、2.0 ng/kg和10.0 ng/kg 3 个添加量下进行回收率实验，平均回收率在78.3%～109.8%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在4.0%～8.8%之间，均满足定量分析要求，结果见表4。
表 4 联苯肼酯及联苯肼酯烯添加平均回收率及相对标准偏差（n==55）
Taabbllee 44 AAvveerraaggee rreeccoovveerriieess aanndd rreellaattiivvee ssttaannddaarrdd ddeevviiaattiioonnss （RRSSDD） ffoorr bifenazate and bifenazate-diazenee （n = 55）%
农药添加量/（ng/kg）1.0 2.0 10.0平均回收率 RSD 平均回收率 RSD 平均回收率 RSD联苯肼酯 109.8 4.0 86.2 7.0 91.3 5.0联苯肼酯烯 81.5 8.6 97.3 8.8 78.3 4.5
本研究采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱技术，以电喷雾正离子扫描和多反应监测模式，建立了木瓜中联苯肼酯及联苯肼酯烯的残留检测方法。对其前处理条件进行了考察，并优化了质谱条件，采用基质匹配保准曲线外标法定量，保证了定量的准确性。该方法对供试农药的定量限为1.0×10 －6mg/kg，出峰时间为2.35 min，整个检测时间为5 min，与传统液相色谱相比，节省了检测时间，提高了检出限。串联质谱的检测方法能够避免杂质的干扰，能很好地排除基质干扰，提高分析的选择性和检测灵敏度，该方法的线性、灵敏度、准确度和精密度均能满足残留分析的要求。
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Determining of Bifenazate and Its Metabolite Residues in Papaya by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
ZHANG Yue， HAN Bingjun， ZHAO Fangfang
（Hainan Provinc ial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Analysis and Testing Center，Chinese Academy of Tropical Agriculture Science， Haikou 571101， China）
Abstract：An ultra performance liquid chromatography-tan dem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the determination of residues of bifenazate and its metabolite bifenazate-diazene in papaya was established. The sample was extracted with acetonitrile and acetic a cid （0.25%） after being homogenized. The organic phase was then separated fro m water phase b y adding sodium chloride and derivatized for 60 min after the addition of 0.25%. Finally， the target analytes were separated by a Waters ACQUITY UPLC BEH C 18column （50 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）. A tandem quadrupole mass spectrometer operated in MS/MS mode for multiple-reaction monitoring （MRM） was used for the qualitative and quantitative analyses of the const itue nts. The results showed that the av erage recoveries of bifenazate and bifenazate-diazene ranged from 78.3% to 109.8% with relative standard deviation （ RSDs） of 4.0%-8.8% at spiked levels from 1.0 to 10.0 ng/kg （n = 5）. The calibration curves showed good li nearity in the range of 0.25-2.0 ng/mL， with correlation coeffi cient over 0.999 8. The limit of quantifi cation （LOQ） was 1×10 -6mg/kg for both bifenazate and its metabolite. The method is applicable for the determination of bifenazate pesticide residues in papaya.
Key words：ultra per formance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； papaya； bifenazate；bifenazate-diazene； residue
中图分类号：O657.72；S482.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）24-0270-04
doi：10.7506/spkx1002-6630-201524050
收稿日期：2015-02-04
作者简介：张月（1981—），女，助理研究员，硕士，主要从事农药残留登记研究。E-mail：ghzy_0708@163.com