表1 液相色谱梯度洗脱程序表
Table 1 LC gradient elution program
时间/min 流量/（mL/min） 流动相体积分数/% A B 0 0.3 2 98 5 0.3 15 85 6 0.3 50 50 7 0.3 50 50 8 0.3 2 98
陈晓峰 1，周 围 2，*，解迎双 2
（1.西北师范大学地理与环境科学学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃出入境检验检疫局综合技术中心，甘肃 兰州 730010）
摘 要：采用超高效液相色谱串联质谱技术，以婴幼儿乳粉中的牛磺酸为研究对象，从样品处理方法，基质效应以及影响电喷雾离子源的电离因素3 个方面进行优化，建立了一个样品处理简单、快捷，基质效应低，灵敏度高的检测方法。结果表明，方法的回收率在72%～97%之间，相对标准偏差为2.16%～3.33%。该方法的仪器检出限为50 μg/L，方法检出限为1 mg/L，应用外标法定量，能够达到欧盟及我国婴幼儿乳粉中牛磺酸的检测要求。整个分析过程在8 min内完成，适合于大批量检测婴幼儿乳粉中牛磺酸的测定。
关键词：超高效液相色谱串联质谱；基质效应；婴幼儿乳粉；牛磺酸
牛磺酸又称α-氨基乙磺酸，最早由牛黄中分离出来，化学性质稳定，是一种含硫的非蛋白氨基酸，适量的牛磺酸促进机体的激素分泌，增强和改善机体的各种功能，牛磺酸是调节机体正常活动的活性物质，而缺乏牛磺酸会导致多种疾病的发生 ［1-3］。近年来，牛磺酸被添加在婴幼儿乳粉中，以期达到补充机体氨基酸的作用。我国在GB 10765—2010《婴儿配方食品》中明确规定牛磺酸的限量最高值不得超过0.130 mg/g ［4-7］，欧洲共同体委员会则建议婴幼儿乳粉中牛磺酸的含量不得超过12 mg/100 kcal（约400 mg/100 g） ［8］。因此测定乳粉中牛磺酸的含量具有重要意义。
目前，国内外测定婴幼儿乳粉中牛磺酸的方法主要有滴定法 ［9-10］、比色法 ［11］、薄层扫描法 ［12-13］、高效液相色谱法 ［14-17］和高效液相色谱串联质谱法 ［18-19］等。其中滴定法、比色法和薄层扫描法容易受氨基酸的干扰，误差相对较大；高效液相色谱法不能直接对牛磺酸进行测定，需要利用柱前或柱后衍生进行检测，操作较为繁琐，重复性差 ［20］。本研究采用超高效液相色谱串联质谱对乳粉中的牛磺酸直接进行检测，具有高选择性、样品处理简单快速、高灵敏度、抗干扰性强和自动化程度高等优点，实验结果达到满意效果。
1.1 材料与试剂
亚铁氰
化钾、硫酸锌、乙酸锌（均为分析纯） 天津市大茂化学试剂厂；乙腈（色谱纯） 德国Merck公司；乙酸胺（色谱纯） 天津市登峰化学试剂厂；牛磺酸标准品 农业部环境保护科研监测所。
1.2 仪器与设备
TE124S分析天平（感量：±0.1 mg） 德国Sartorius公司；BL310百分之一天平（感量：±0.01 g）北京赛多利斯仪器系统有限公司；MS3 Digital涡旋仪 德国Ikams公司；3K30离心机 美国Sigma公司；SK8200H超声清洗仪 上海科导超声仪器有限公司；ZWF334振荡仪 上海智城分析仪器制造有限公司；移液枪 德国Eppendorf公司；1290-6460超高效液相色谱-质谱联用仪（配有电喷雾离子源） 美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 液相色谱条件
ACQUITY BEH TMHILIC色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：A：50 mmol/L乙酸铵溶液，B：乙腈；进样量0.5 μL；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min梯度洗脱，见表1。
表1 液相色谱梯度洗脱程序表
Table 1 LC gradient elution program
时间/min 流量/（mL/min） 流动相体积分数/% A B 0 0.3 2 98 5 0.3 15 85 6 0.3 50 50 7 0.3 50 50 8 0.3 2 98
1.3.2 质谱条件
电喷雾离子源离，离子源参数：毛细管电压3 500 V；干燥气温度300 ℃；干燥气流量7 L/min；雾化气压力45 psi；鞘气温度350 ℃；鞘气流量11 L/min；电离方式：电喷雾离子源，负离子模式；采集方式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）。牛磺酸质谱检测参数设定见表2。
表2 牛磺酸质谱检测参数设定表
TTaabbllee 22 MMaassss ssppeeccttrraall ppaarraammeetteerrss ffoorr ttaauurriinnee ddeetteeccttiioonn
参数 定性离子（m/z）定量离子对（m/z）驻留时间/s锥孔电压/V碰撞池电压/V牛磺酸 124.0 79.9 200 120 10 107 10
1.3.3 样品处理
称取2.00 g（±0.05 g）乳粉样品于50 mL离心管中，加入35 mL纯净水，涡旋5 min；用移液枪准确加入2.50 mL 1.199 mol/L乙酸锌和2.50 mL 0.25 mol/L硫酸亚铁氰化钾溶液后定容至50 mL，涡旋5 min；于4 ℃，13 000 r/min离心5 min；取上清液1.0 mL过0.22 μm膜于进样瓶中，备超高效液相色谱串联质谱检测。
2.1 样品处理结果
图 1 牛磺酸标准（10 mg/L）谱图（A）、乳粉样品谱图（BB）Fig.1 Mass spectra of taurine standard （10 mg/L） （A） and milk powder sample （B）
乳粉样品中含有大量的蛋白质，给牛磺酸的检测带来了困难，所以在分析时首先要除去样品中的蛋白质。现有的除去蛋白质的方法主要有固相萃取法 ［21-22］和蛋白沉淀法 ［23-24］。固相萃取法原理是当样液经过固相色谱柱时，牛磺酸将会被固相萃取柱中的固定相保留，而蛋白质则随样液流出，以达到分离的目的。该方法具有样品净化效率高的优点，但固相萃取柱成本较高，净化步骤较为繁琐。蛋白沉淀法则是通过向提取液中加入沉淀剂使蛋白沉淀来达到净化目的，该方法操作简便、快捷，因此本实验使用蛋白沉淀法进行样品处理。
本实验分别选用了乙腈、硫酸锌、硫酸亚铁氰化钾和乙酸锌的混合溶液做为沉淀剂来去除样品中的蛋白质。采用乙腈作为蛋白沉淀剂，由于牛磺酸不溶于乙腈，因此部分牛磺酸会随蛋白一同沉淀，回收率较低，不能满足检测要求；采用硫酸锌去除蛋白效果较好，经硫酸锌去除蛋白后样液澄清，且硫酸锌溶液对牛磺酸的提取效率较高，但使用该方法对于含糖量较高的乳粉进行处理时，回收率较低，只有60%左右，因此乙酸锌作为沉淀剂不适用于含糖乳粉中牛磺酸的检测；而采用硫酸亚铁氰化钾和乙酸锌的混合液作为一种蛋白沉淀剂，利用乙酸锌与亚铁氰化钾发生反应生成的氰亚铁酸锌沉淀来挟走或吸附干扰物质，可用于乳粉样品的蛋白沉淀以及可溶性糖类的净化，因此本实验选择硫酸亚铁氰化钾和乙酸锌作为沉淀剂达到了满意的样品处理效果。如图1所示。
2.2 质谱分析中对样品的基质效应的去除
基质效应主要表现为使用同一条件进行分析时，相同质量浓度的目标物质在纯溶剂中和基质中的影响存在较大的差异。如图2所示，将500 μg/L的溶剂标准溶液和基质标准溶液在同一条件下，经C 18柱分析后，溶剂标准溶液峰形呈高斯分布，响应较高，而基质标准溶液峰形很差，不能达到检测要求。主要是因为经1.3.3节方法处理后的样品中含有大量的脂肪类物质并未去除，经C 18色谱柱进行分析时，牛磺酸保留较弱，与样液中的脂肪类物质同时被洗脱进入质谱检测，降低牛磺酸的离子化效率，基质效应比较明显。
图2 经CC1188色谱柱分析后牛磺酸基质标准与溶剂标准的对比谱图
Fig.2 Comparative mass spectra of taurine standard in solvent and matrix after separation on C
18column
目前常见的去除基质效应的方法一般有加入同位素标记的内标物、优化样品前处理方法、优化色谱和质谱条件、进样前稀释、基质匹配标准溶液进行校准等。本实验是通过优化色谱条件（即选择HILIC色谱柱）来去除乳粉中脂肪类物质对牛磺酸的基质效应的影响。HILIC色谱柱采用中性的酰胺键合基团，利用亲水作用色谱原理，对强极性、水溶性碱性有机化合物有较好的保留；因此采用HILIC色谱柱对婴幼儿乳粉中的牛磺酸进行测定时，脂肪类物质不被HILIC色谱柱所保留率先流出，因此与牛磺酸有较好的分离，从而有效地去除了基质效应的影响，能够达到乳粉中牛磺酸的检测要求，见图3。
图 3 经HILIC色谱柱分析后牛磺酸基质标准谱图（50000 μgg//LL）
Fig.3 Comparative mass spectra of taurine standard in solvent and matrix after separation on HILIC column （500 μgg/L）
2.3 质谱分析中影响电离因素的优化
电喷雾离子源电离技术的原理是在毛细管的出口处施加高压，使从毛细管流出的液体在高电场中雾化成细小的带电液滴，随着溶剂的蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后爆裂为大量的带一个或多个电荷的离子，使得被分析的目标物以单电荷或多电荷的形式进入质谱中 ［25］。
影响电喷雾离子源电离的因素有很多，比如流速、电压等离子源的设置，分析物本身的特性，质子化物质在电喷雾离子源中是低质量范围物质干扰的来源等等。本实验主要通过雾化器温度、干燥气流速以及流动相的pH值3 个方面对其进行优化，实验最终确定，最佳的雾化器温度为300 ℃；最佳的干燥气流速为7 L/min；流动相的缓冲溶液为50 mmol/L乙酸胺。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系
取牛磺酸标准储备液，按照逐级稀释的原则配制250、200、150、100、50 μg/L的标准溶液，超高效液相色谱串联质谱检测。以峰面积为纵坐标，牛磺酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果表明在50～250 μg/L质量浓度范围内呈线性，标准方程为y=661.2x－27 297，线性相关系数R 2为0.999 0。
2.4.2 回收率、精密度、相对标准偏差（relative standard devition，RSD）、检出限
为考察样品前处理对牛磺酸目标物的净化提取效率，本实验平行称取4 个乳粉样品各2 g，一个做空白，另外3 个添加1 mg/L牛磺酸溶液50、100、200 μL于50 mL的离心管，使用上述方法测得牛磺酸的加标回收率后每一个点平行做8 次，测得精密度，见表3。加标回收率在72%～97%范围，RSD在2.16%～3.33%范围内，说明本方法准确度高，精密度高。依据此方法，该仪器测定牛磺酸的仪器检出限为50 μg/L，该方法检出限为1 mg/L。
表3 回收率及精密度值
Taabbllee 33 RReeccoovveerriieess ooff ttaauurriinnee iinn ssppiikkeedd bbllaannkk ssaammppllee
%
添加量 回收率 RSD 12345678 500 ng/mL 77.0 73.0 72.5 74.2 75.3 74.8 74.2 76.8 2.16 1 μg/mL 75.2 77.3 80.4 78.5 74.8 78.5 80.6 82.2 3.33 2 μg/mL 90.2 94.3 89.1 90.5 88.8 92.7 93.4 96.2 2.89
2.5 样品分析
表 4 超高效液相色谱串联质谱测定婴幼儿乳粉中牛磺酸的结果
Taabbllee 44 TTaauurriinnee ccoonntteenntt ooff iinnffaanntt mmiillkk ppoowwddeerr ddeetteerrmmiinneedd bbyy UPLC-MMSS//MMSS
mg/100 g
样品编号 样品名称 样品标示含量样品检测含量1 燎原幼儿配方乳粉（12～36 个月） 35 37.1 2 古象婴儿配方乳粉（0～6 个月） 40 42.3 3 古象较大婴儿配方乳粉（6～12 个月） 38 39.5 4 古象幼儿配方乳粉（1～3 岁） 39 41.7 5 燎原婴儿配方乳粉（0～6 个月） 40 40.1 6 燎原较大婴儿配方乳粉（6～12 个月） 39 41.1 7 燎原婴儿配方乳粉（0～6 个月） 39 39.9 8 燎原幼儿配方乳粉（12～36 个月） 38 40.2
在市场上随机抽取婴幼儿乳粉8 批，按照实验所给的条件测定乳粉中牛磺酸的含量，测得的结果以及样品标示牛磺酸含量如表4所示。结果表明市场售卖的婴幼儿乳粉中牛磺酸的含量与样品标示基本一致，符合国家标准的限量要求。
在Massimo ［18］、Mario ［19］等对牛磺酸的研究中，采用超高效液相色谱串联质谱与超高效薄层色谱质谱方法检测能量饮料中牛磺酸的含量。Massimo等 ［18］对能量饮料中牛磺酸的检测方法简便；Mario等 ［19］采用柱后衍生法检测能量饮料中的牛磺酸，此方法操作较复杂。但能量饮料相对于婴幼儿乳粉，没有蛋白质和脂肪等大分子杂质，处理较方便，甚至可以直接测定；而婴幼儿乳粉中的蛋白质和脂肪影响样品的处理过程，需要一个适合的方法去除这些杂质，以免影响样品的检出和灵敏度。本实验在他们研究成果的基础上，很好地去除了乳粉中的蛋白质等杂质，建立了一套去除基质效应、优化影响电离因素，快速、高效的测定婴幼儿乳粉中牛磺酸的方法。
本实验利用超高效液相色谱串联质谱法测定婴幼儿乳粉中的牛磺酸，样品前处理用硫酸亚铁氰化钾和乙酸锌去除蛋白，并离心过膜去除杂质；方法对样品的净化效果好，操作简便，快速。采用HILIC色谱柱进行样品检测，可以有效地降低基质效应，整个检测在8.0 min内完成。色谱条件便于掌握，检出限低；结果准确度高，灵敏度高，对于同时进行大批量样婴幼儿乳粉中牛磺酸的检测有重要意义。
参考文献：
［1］ HAYES K C， STEPHAN Z F， STURMAN J A. Growth depression in taurine-depleted infant monkeys［J］. The Journal of Nutrition， 1980，110（10）: 2058-2064.
［2］ MOTOKI M， YASUHISA A. A simple assay of taurine concentrations in food and biological samples using taurine dioxygenase［J］. Analytical Biochemistry， 2012， 427: 121-123.
［3］ 白小琼， 孔德义. 牛磺酸的研究进展［J］. 中国食物与营养， 2011，17（5）: 78-80.
［4］ 邹晓莉， 黎源倩， 曾红燕， 等. 脉冲安培检测-高效阴离子色谱对药品和保健食品中牛磺酸的快速测定［J］. 分析测试学报， 2009， 28（4）: 470-473.
［5］ 王丽娟， 王勇. 牛磺酸药理作用的研究进展［J］. 天津药学， 2004，16（5）: 46-48.
［6］ 王俊萍， 冀建军， 黄仁录. 牛磺酸营养研究进展［J］. 中国畜牧杂志，2005， 41（12）: 57-59.
［7］ 李秀萍， 冯国良， 高励聪. 牛磺酸的治疗作用及机制研究进展［J］. 包头医学， 2007， 31（1）: 26-28.
［8］ 徐慕华. 生物素-牛磺酸与婴幼儿配方奶粉中牛磺酸标准物质研制及分析方法研究［D］. 北京: 中国计量科学研究院， 2013: 72-79.
［9］ 段文军， 万新祥. 反滴定法测定牛磺酸钙中的钙［J］. 分析实验室，2000（6）: 98.
［10］ 谢循策， 张崇生. 牛磺酸颗粒的自动电位滴定法测定［J］. 中国医药工业杂志， 2005， 36（3）: 174-175.
［11］ 周艳军， 戴寿昌， 童敏. 用比色法测定牛磺酸滴眼剂的含量［J］. 浙江药学， 1986（4）: 28-30.
［12］ 惠秋沙. 薄层扫描法测定保健饮料中牛磺酸的含量［J］. 食品与药品，2011， 13（7）: 276-278.
［13］ 杨菊辉. 薄层扫描法测定牛磺酸含量［J］. 黑龙江科技信息， 2011（9）: 69.
［14］ WANG Xifeng， CHI Defeng， SU Guanmin， et al. Determination of taurine in biological samples by high performance liquid chromatography using 4-fl uoro-7-nitrobenzofurazan as a derivatizing agent［J］. Biomedical and Environmental Science， 2011， 24（5）: 537-542.
［15］ MOHAMMADREZA G S， SIMINOZAR M， MAHBOUB N， et al. A Rapid determination of taurine in human plasma by LC［J］. Chromatographia， 2009， 69（11）: 1427-1430.
［16］ 史海良. 高效液相色谱法快速测定含乳饮料中的牛磺酸［J］. 食品工程， 2012（6）: 125-127.
［17］ HIRAI T， OHYAMA H， KIDO R. A direct determination of taurine in perchloric acid-deproteinized biological samples［J］. Analytical Biochemistry， 1987， 163（2）: 339-342.
［18］ MASSIMO R， GIOVANNI C， MANUELA C， et al. Simultaneous determination of taurine， glucuronolactone and glucuronic acid in energy drinks by ultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （triple quadrupole）［J］. Journal of Chromatography A， 2014， 1364: 303-307.
［19］ MARIO A， GERTRUD M. Simultaneous determination of ribofl avin，pyridoxine， nicotinamide， caffeine and taurine in energy drinks by planar chromatography-multiple detection with confirmation by electrospray ionization mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography A， 2006， 1131: 253-260.
［20］ 黄焘， 陶宝华， 陈启， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定人乳中的胆碱、L-肉碱、乙酰基-L-肉碱和牛磺酸［J］. 食品安全质量检测学报， 2014（7）: 2059-2064.
［21］ 邵金良， 杨东顺， 王丽， 等. 固相萃取-高效液相色谱法同时测定牛奶中13 种磺胺残留［J］. 分析实验室， 2014， 33（11）: 1322-1325.
［22］ 杨红梅， 王浩， 郭启雷. 固相萃取-高效液相色谱法测定牛奶及蛋白类饮料中10 种防腐剂［J］. 食品研究与开发， 2011， 32（5）: 123-126.
［23］ 张吟， 陈崇宏， 林玲. 蛋白沉淀-高效液相色谱法筛查血浆中61 种常见的中枢神经系统药物［J］. 色谱， 2009， 11（6）: 787-793.
［24］ 朱慧， 李克， 翟云霞. 血清蛋白质组学研究中乙腈沉淀法去除清蛋白的实验研究［J］. 临床检验杂志， 2011（1）: 16-18.
［25］ 肖颖. 液相色谱-串联质谱联用技术在食品安全中的应用［D］. 重庆:西南大学， 2013: 5.
Direct Determination of Taurine in Infant Milk Powder by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
CHEN Xiaofeng
1， ZHOU Wei
2，*， XIE Yingshuang
2
（1. College of Geography and Environmental Science， Northwest Normal University， Lanzhou 730070， China；
2. Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Lanzhou 730010， China）
Abstract：Ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was applied for the direct determination of taurine in infant milk powder. The sample pretreatment procedure was optimized， and the matrix effect and the factors influencing electrospray ionization （ESI） were evaluated to establish a simple， rapid， low-matrixeffect and sensitive method for determining taurine. The results showed that the recovery rate of this method was between 72% and 97%， with relative standard deviation ranging from 2.16% to 3.33%. The instrument detection limit was 50 μg/L，and the method detection limit was 1 mg/L. Quantifi cation using an external standard method could meet the requirements of the European Union and China for taurine detection in infant milk powder. The whole analysis can be accomplished in 8 minutes， and is suitable for the determination of taurine in mass detection of infant milk powder.
Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； matrix effects；baby milk powder； taurine
中图分类号：TS252.7
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）24-0280-06
doi：10.7506/spkx1002-6630-201524052
收稿日期：2015-04-01
作者简介：陈晓峰（1990—），男，硕士研究生，主要从事环境监测研究。E-mail：ghty0794@foxmail.com
*通信作者：周围（1953—），男，研究员，博士，主要从事食品营养及食品安全分析研究。E-mail：zhouwei845@163.com