以聚苯乙烯-二乙烯苯为载体的多目标免疫亲和柱的制备及应用

张家宁,丁 轲 *,韩 涛,陈湘宁

(北京农学院食品科学与工程学院,食品质量与安全北京实验室,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室,北京 102206)

摘 要:选取3 种不同聚苯乙烯-二乙烯苯基材,通过硝基化、氨基化、活化、偶联抗体等步骤制备免疫亲和柱,用于4 种镰刀菌毒素(玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素)的同时纯化,并将3 种基材制备的免疫亲和柱进行比较。以Cleanert PS型聚苯乙烯-二乙烯苯为基材制备的免疫亲和柱与抗体偶联的偶联率为97.64%,且其空白柱对样品的吸附作用最小,3 个加标水平下的回收率为66.16%~112.80%,相对标准偏差为3.09%~12.25%,可应用于实际样品的纯化。

关键词:聚苯乙烯-二乙烯苯;免疫亲和柱;镰刀菌毒素

镰刀菌毒素是由真菌毒素产生的次级代谢产物 [1],广泛存在于各种粮食作物(如小麦、玉米等)和加工产品(如麦芽、啤酒和面包等),多见于潮湿环境贮藏的发霉粮食中 [2-5]。经常从受污染的粮食和饲料中被检出的有 [6-11]:T-2毒素 [12]、HT-2毒素 [13]、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON) [14]及玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA) [15-16]4 种。对于镰刀菌毒素中DON、ZEA、T-2及HT-2这4 种毒素同时纯化的前处理方法亟待选择。

免疫亲和柱是利用抗原和抗体特异性结合的特殊固相萃取小柱,能够有效去除基质干扰,选择性较高 [17-19]。在我国,虽然免疫亲和固相萃取技术在许多实验室已经广泛使用,但固相萃取材料还是主要依靠进口。目前市场上存在的免疫亲和柱,其填料大多以Sepharose 4B凝胶多糖基质为主,供应厂商单一,使用成本高昂 [20-22]。选择其他基质作为填料,成为今后免疫亲和柱的研究方向。早在20世纪60年代,就报道了采用有机聚合固相萃取材料,但有机聚合固相萃取材料的迅速发展并广为使用是在高交联聚苯乙烯-二乙烯苯(polystyrenedivinylbenzene,PS-DVB)材料用于固相萃取之后 [23],对PS-DVB进行各种改性,引入一些特殊的官能团,例如磺酸基等 [24],使得有机聚合固相萃取材料的应用范围可以与硅胶为基质的固相萃取材料媲美。有机聚合固相萃取材料不受pH值的限制,因此可以在全pH值范围内使用。

本实验旨在将T-2、HT-2、DON和ZEA 4 种常见的镰刀菌毒素的单克隆抗体同时偶联到树脂类多聚物载体上研究制备一种新型的免疫亲和柱,克服多糖类载体机械强度差、pH值应用范围窄和成本高的缺陷,又能实现4 种真菌毒素的同时纯化和同时检测,拟为解决食品中多种镰刀菌毒素同时纯化问题提供方法借鉴,也为新型基质材料免疫亲和柱有关研究的进一步开展提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DON、ZEA、T-2、HT-2抗体 北京点石科创科技有限公司;Cleanert PS型PS-DVB 博纳艾杰尔科技有限公司;XAD1180 N型PS-DVB 美国罗门哈斯公司;S-TR型PS-DVB 杭州争光树脂有限公司;甲醇、乙腈(均为色谱纯) 美国Fisher公司;体积分数25%戊二醛溶液(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1200高效液相色谱-6410三重四极杆质谱联用仪 美国安捷伦公司;Super Series超纯水系统 艾科普公司;DSHZ-300A水浴恒温振荡器 苏州培英实验设备有限公司;UV-2300紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;Nicolet iS10傅里叶红外光谱仪 美国赛默飞世尔公司;S-4300冷场发射扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM) 日本日立高新技术公司。

1.3 方法

1.3.1 PS-DVB微球的氨基化

1.3.1.1 硝基PS-DVB微球的制备

烧瓶中加入10.0 g PS-DVB微球,加入100 mL去离子水,配制10 g/100 mL的PS-DVB微球乳液。在50 ℃水浴中高速搅拌条件下,加入硫酸与硝酸体积比3∶2(以浓酸为基准)的混合液,反应2 h。将反应混合物注入去离子水中,过滤,并用去离子水洗涤至滤除产物的pH值呈中性,将洗涤后的微球37 ℃真空干燥24 h,得到淡黄色粉末。

1.3.1.2 氨基PS-DVB微球的制备

取3.0 g硝基PS-DVB微球于烧瓶中,在75 ℃水浴中高速搅拌条件下,加入2 mol/L KOH溶液180 mL,加入12 g还原剂Na 2S 2O 4,反应4 h。将反应混合物过滤,并用去离子水洗涤至滤除产物的pH值呈中性,将洗涤后的微球37 ℃真空干燥24 h,得到黄色粉末。

1.3.1.3 产物的鉴定表征

用冷场发射高分辨SEM观察微球形貌;红外光谱仪测定微球表面官能团性质:称取样品300 mg,加入300 mg溴化钾粉末研磨,压片法测定其红外光谱。

1.3.2 氨基PS-DVB免疫亲和柱的制备

1.3.2.1 氨基PS-DVB微球的活化

取3.0 g氨基化PS-DVB微球,用8 mL pH 7.0的0.1 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)分散,超声30 min得到分散性很好的溶液。加入32 mL体积分数25%戊二醛溶液,在29 ℃水浴锅中振荡反应(200 r/min)3 h,停止活化。然后用pH 5.0的0.2 mol/L PBS溶液清洗3 遍,最终将活化后的树脂材料溶解在5 mL pH 5.0的PBS溶液中,得到0.3 g/mL的树脂微球分散液。

1.3.2.2 氨基PS-DVB微球偶联抗体的制备

取DON抗体1.25 mg,T-2、HT-2抗体0.2 mg,ZEA抗体0.3 mg,将上述抗体加入体积分数50% PBS-甘油溶液(pH 7.0 0.1 mol/L PBS、甘油各250 μL),再取1.3.2.1节活化过的树脂微球分散液1 mL(约0.3 g),将两者混合,25 ℃水浴锅中振荡反应12 h。离心取上清液用考马斯亮蓝法,按下式计算偶联率。将混合溶液装入2.5 mL的固相萃取空柱管,制成免疫亲和柱。

1.3.3 不同PS-DVB微球制备免疫亲和柱的比较

分别选取3 种不同PS-DVB微球,其结构和参数见表1。按1.3.1节和1.3.2节方法制备免疫亲和柱,比较其4 种镰刀菌毒素抗体的偶联率及加标回收率。

表1 3种PS-DVB材料参数
Table1 Working parameters of the three kinds of PS-DVB microspheres

孔径/nm粒径/μm比表面积/(m 2/g)Cleanert PS球形、孔型740~60600 XAD1180 N球形、孔型40350~600500 S-TR球型、凝胶、无孔0300~355400型号类型平均

1.3.4 高效液相色谱-串联质谱联用检测

为了获得样品中提取4 种镰刀菌毒素准确的定量结果,建立高效液相色谱-串联质谱法。高效液相色谱系统由泵、脱气机、恒温柱箱和自动采样器组成。电喷雾离子(electrospray ionization,ESI)源,离子源温度为300 ℃,雾化气压力为15 psi。

色谱条件:Agilent ZORBAX Bonus-RP色谱柱(50 mm×2.1 mm,3.5 μm);柱温20 ℃;进样量20 μL。流动相采用乙酸铵溶液(A)-乙腈(B)溶液体系,流速为0.3 mL/min;梯度洗脱条件:0~0.1 min,B为10%;0.1~2 min,B由10%升到50%;2~10 min,B由50%升到80%;10~15 min,B为80%;15~16 min,B由80%降至10%;16~20 min,B保持10%。

质谱记录与分析采用MassHunter工作站采集分析软件。电离模式、监测离子对(m/z)和其他参数见表2。

表2 4种镰刀菌毒素的质谱参数
Table2 Instrumental parameter settings for analysis of the four Fusarium toxins

注:*.定量离子。

碰撞能量/eV DON4.0ESI +319/69*13516 319/28313524 HT-24.0ESI +442.1/263.1*13517 442.1/21513519 T-24.0ESI +484.2/245.2*13520 484.2/305.113521 ZEA2.5ESI -317.3/131.1*13540 317.3/175.213534抗体种类电压/kV电离模式母离子/子离子毛细管碎裂电压/V

1.3.5 实际样品的纯化应用

称取面粉样品25.0 g(精确至0.1 g)于500 mL具塞锥形瓶中,加入100 mL体积分数70%甲醇溶液,浸泡15 min,超声振荡40 min,过滤,取16 mL滤液,以2 mL/min的速率过免疫亲和柱,再用16 mL H 2O以5 mL/min的速率洗涤柱子;用1 mL 体积分数100%甲醇溶液以1 滴/s的速率洗脱柱子,将洗脱液收集于2 mL的样液瓶中,再用1 mL H 2O以5 mL/min的速率洗涤免疫亲和柱,同样收集于上述样液瓶中。待检测,进样量为50 μL。

2 结果与分析

2.1 微球的表征

2.1.1 SEM表征

如图1a所示,PS-DVB微球具有良好的球形度并且单分散性好,这为其进一步硝基化和氨基化提供了可靠的保证。如图1b、c所示,Cleanert PS型PS-DVB微球在经过氧化性和腐蚀性极强的混合酸硝化及还原剂Na 2S 2O 4处理后,虽然保持了较好的球形度,分散性仍较好,但表面形貌遭到破坏,微球表面从光滑变粗糙。再经活化处理后,表面形貌遭到严重破坏,但微球的球形度和分散性较好,有利于反应的进行。

图1 Cleanert PS型PAS-DVB的SEM表征图
Fig.1 SEM characterization of Cleanert PS PAS-DVB

2.1.2 红外光谱表征

图2 氨基Cleanert PS型PAS-DVB微球的红外光谱图
Fig.2 Infrared spectrum of Cleanert PS PAS-DVB microspheres

采用KBr制样法,设定分辨率4 cm -1,扫描次数32 次。从图2可以看出,1 455 cm -1和1 494 cm -1处为苯环C—C的伸缩振动峰,699 cm -1和759 cm -1为苯环上C—H键的同位相面外弯曲振动吸收峰,3 020 cm -1尖锐峰为烯烃上C—H伸缩振动峰,1 540 cm -1附近C=C伸缩振动吸收。1 029 cm -1和909 cm -1为乙烯基上C—H弯曲振动的重要特征。1 676 cm -1处为C=O伸缩振动峰。3 436 cm -1为—NH 2的反对称伸缩振动峰。红外光谱结果说明PS-DVB微球的氨基化是成功的。

2.2 3种PS-DVB微球制备免疫亲和柱的比较

2.2.1 偶联率及抗体结合情况比较

以上3 种不同PS-DVB树脂材料,经过相同的处理及制备流程,根据1.3.2.2节方法和公式,计算其偶联率,Cleanert PS、XAD1180 N、S-TR 3 种不同型号材料制备出的免疫亲和柱的偶联率分别为97.64%、89.73%、83.02%。根据3 种树脂材料的平均粒径计算平均体积,再根据每根柱子所填充树脂材料的总体积,得出每根柱子包含树脂的颗粒数,推出全部树脂颗粒总表面积的大小;结合总表面积和偶联率,反映出每种树脂结合抗体的情况。结果显示,一根固相萃取空柱管内装填的Cleanert PS、XAD1180 N、S-TR 3 种不同型号材料的总表面积分别为360、50.53、36.64 cm 2,总表面积和偶联率成正相关。XAD1180 N和S-TR树脂的粒径均较大,Cleanert PS树脂的粒径远小于前两者,其与抗体偶联情况较优,但基质选择对免疫亲和柱制备及偶联情况的影响仍需进一步探索。

2.2.2 空白柱吸附情况及回收率的比较

表3 3种免疫亲和柱空白柱吸附及回收率情况
Table3 Adsorption capacities of IAC and blank columns

%种类指标Cleanert PS型PS-DVBXAD1180 N型PS-DVBS-TR型PS-DVB空白柱免疫亲和柱空白柱免疫亲和柱空白柱免疫亲和柱抗体DON回收率7.7796.7214.1520.258.529.15 RSD4.604.248.514.287.453.03 HT-2回收率7.1888.0418.8825.2118.1420.20 RSD3.2512.315.026.354.339.27 T-2回收率0.6987.343.4516.801.113.33 RSD3.456.454.905.793.236.98 ZEA回收率7.3886.0119.4825.7212.4218.31 RSD3.897.024.3313.066.155.21

将20 mL 4 种镰刀菌毒素的混合标样(DON 40 ng/mL,HT-2、T-2 20 ng/mL,ZEA 10 ng/mL)分别过上述3 种树脂免疫亲和柱,洗涤、洗脱,并收集洗脱液分析,做3 次平行。由于此3 种树脂材料具有孔型或粒径较大的特点,制备成免疫亲和柱,其孔隙和树脂间缝隙可能会对样品有吸附作用,影响纯化结果。因此,选择3 种树脂做成未连接抗体的空白柱,按上述步骤上样,测定回收率及相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。如表3所示,其空白柱均对样品有一定量的吸附,Cleanert PS树脂为基质材料的空白柱对样品的吸附作用最小,且回收率最大,对4 种镰刀菌毒素的回收率均能达到80%以上,XAD1180 N和S-TR为基质材料的免疫亲和柱不仅空白吸附作用大,回收率均较低。

综合考虑偶联率、空白吸附、回收率等条件,Cleanert PS型PS-DVB微球为基质材料的免疫亲和柱能较好地结合4 种真菌毒素的抗体,且吸附作用小,回收率较高,可作为制备树脂免疫亲和柱的备选材料,为以后的研究提供借鉴和参考。

2.3 实际样品的纯化应用

表4 Cleanert PS型PS-DVB免疫亲和柱纯化后4 种镰刀菌毒素的添加回收率
Table4 Recoveries of the 4 Fusarium toxins purified by Cleanert PS PS-DVB IAC column

抗体种类添加水平/(µg/kg)平行个数平均回收率/%RSD/% 25 DON 88.807.45 5084.695.52 10089.563.42 3 84.9212.25 5070.0510.21 10068.935.87 25 HT-23 10 T-2 82.654.21 2595.647.54 5088.763.09 3 10 ZEA 112.809.87 2582.403.44 5066.165.13 3

根据1.3.5节方法将Cleanert PS型PS-DVB基质材料的免疫亲和柱应用于实际面粉样品,做添加回收率实验。如表4所示,3 个加标水平下的回收率为66.16%~112.80%,RSD为3.09%~12.25%,符合痕量分析的要求,此Cleanert PS型PS-DVB基质材料制备的免疫亲和柱能用于实际样品的纯化。

3 结 论

本实验结合近年来国内外镰刀菌毒素多目标分析的相关研究成果,以PS-DVB微球为材料,通过硝基化、氨基化制备成氨基化PS-DVB,以之为基材结合镰刀菌毒素抗体,制备成能同时净化DON、HT-2、T-2、ZEA 4 种镰刀菌毒素的免疫亲和柱,并选择3 种不同型号的PS-DVB微球作为材料制备免疫亲和柱并进行比较。其中,以Cleanert PS型PS-DVB为基质材料制备的免疫亲和柱与抗体偶联的偶联率为97.64%,且其空白柱对样品的吸附作用最小,3 个加标水平下的回收率为66.16%~112.80%,RSD为3.09%~12.25%,符合痕量分析的要求,此Cleanert PS型PS-DVB基质材料制备的免疫亲和柱能用于实际样品的纯化。

参考文献:

[1] BENNET J W, KLICH M. Mycotoxins[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2003, 16(3): 497-516. DOI:10.1128/CMR.16.3.497-516.2003.

[2] VISCONTI A, LATTANZIO V M T, PASCALE M, et al. Analysis of T-2 and HT-2 toxins in cereal grains by immunoaffinity clean-up and liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1075(1/2): 151-158. DOI:10.1016/ j.chroma.2005.04.009.

[3] 陈慧, 包成龙. 受污染小麦呕吐毒素分布研究[J]. 粮食与油脂, 2016, 29(1): 67-68. DOI:10.3969/j.issn.1008-9578.2016.01.018.

[4] 朱群英, 索莉莉, 胡美华, 等. 液质联用同位素内标法同时测定小麦粉中7 种真菌毒素[J]. 现代预防医学, 2014, 42(23): 4362-4377.

[5] 辛媛媛, 张艳, 王松雪, 等. UPLC-MS/MS法测定玉米中13 种真菌毒素[J]. 中国粮油学报, 2015, 30(12): 126-130.

[6] 葛文霞, 柳旭伟, 张文举, 等. 饲料中玉米赤霉烯酮检测及脱毒技术的研究进展[J]. 安徽农业科学, 2016, 44(1): 95-97; 124. DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.01.032.

[7] 梁颖. 配合饲料中三种镰刀菌毒素检测方法的研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2006.

[8] WILD C P, GONG Y Y. Mycotoxins and human disease: alargely ignored global health issue[J]. Carcinogenesis, 2010, 31(1): 71-82. DOI:10.1093/carcin/bgp264.

[9] BOOTH C. The genus fusarium[J]. International Association for Plant Taxonomy, 1971, 21(1): 180-181. DOI:10.2307/1219251.

[10] CHANEMOUGASOUNDHARAM A, FIONA M D. Trichothecene toxicity in eukaryotes: cellular and molecular mechanisms in plants and animals[J]. Toxicology Letters, 2013, 217(2): 149-158.

[11] PESTKA J J, ROTTER B A, PRELUSKY D B, et al. Toxicology of deoxynivalenol (vomitoxin)[J]. Journal of Toxicology Environmental Health, 1996, 48(1): 1-34.

[12] 邱妹, 陈海燕, 孙力军, 等. 低剂量T-2/HT-2毒素生物转化产物的遗传毒性研究[J]. 现代食品科技, 2015, 31(8): 42-46. DOI:10.13982/ j.mfst.1673-9078.2015.8.008.

[13] 李丽霞, 尚书凤. T-2毒素的毒性及其作用机制与代谢研究进展[J]. 湖南农业科学, 2015, 54(21): 5207-5210. DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.002.

[14] 徐飞, 杨共强, 宋玉立, 等. 不同小麦品种(系)对赤霉病的抗性和麦穗组织中DON毒素积累分析[J]. 植物病理学报, 2014, 44(6): 651-657. DOI:10.13926/j.cnki.apps.2014.06.012.

[15] 高爽, 邓又天, 张超, 等. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮及其联合染毒对小鼠肝脏功能及肝细胞凋亡的影响[J]. 中国兽医学报, 2015, 35(12): 2021-2026. DOI:10.16303/j.cnki.1005-4545.2015.12.25.

[16] 董曼佳, 杨其亚, 孙伟, 等. 拮抗酵母菌控制玉米赤霉烯酮的研究进展[J]. 食品科学, 2016, 37(1): 230-234. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601040.

[17] van GINKEL L A, STEPHANY R W, van ROSSUM H J, et al. Development and validation of a multiresidue method for β-agonists in biological samples and animal feed[J]. Journal of AOAC International, 1992, 75(3): 554-560.

[18] ZHANG H Y, WANG M M, WANG Y, et al. Preparation and application of animmunoaffinity column based on an antibody with strong affinity and packing material with good stability[J]. Food Additives and Contaminants, 2013, 30(5): 853-860.

[19] LI Y, WANG Y, YAGN H, et al. Establishment of an immunoaffi nity chromatography for simultaneously selective extraction of Sudan Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ from food samples[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(50): 7840-7847.

[20] ROMAGNOLI B, FERRARI M, BERGAMINI C. Simultaneous determination of deoxynivalenol, zearalenone, T-2 and HT-2 toxins in breakfast cereals and baby food by high-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry[J]. Journal of Mass Spectrometry, 2010, 45(9): 1075-1080. DOI:10.1002/jms.1802.

[21] MEI L Y, CAO B Y, YANG H, et al. Development of an immunoaffinity chromatography column forselective extraction of a new agonist phenylethylamine a from feed, meat and liver samples[J]. Journal of Chromatography B, 2014, 945/946C(2): 178-184.

[22] WANG Y, XU Y, ZHANG X, et al. Development and characterization of a chitosan-supported immunoaffi nity chromatography column for the selective extraction of methandrostenolone from food and feed samples[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 49(3): 428-432. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2011.05.027.

[23] FUJIMOTO J M, WANG R I H. A method of idemifying narcotic analysis in human urine after theraoeutic doses[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 1970, 16(1): 93-186.

[24] 贺锐, 曹光群, 杨吉. 表面带磺酸基团的聚苯乙烯微球的制备及其对蛋白质的吸附[J]. 化工进展, 2007, 26(7): 991-994. DOI:10.16085/ j.issn.1000-6613.2007.07.015.

Preparation and Application of Multi-Target Immunoaffinity Columns with Polystyrene-Divinylbenzene(PS-DVB) as Carrier

ZHANG Jianing, DING Ke*, HAN Tao, CHEN Xiangning
(Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide, Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Food Science and Engineering College, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

Abstract:Three kinds of polystyrene-divinylbenzene (PS-DVB) resins were selected to prepare immunoaffinity columns(IAC) through nitration, amination, activation, and antibody coupling for the simultaneous purification of four Fusarium toxins, zearalenone, deoxynivalenol, T-2 and HT-2 toxins. Among these, the coupling ratio of Cleanert PS-type PS-DVB IAC was 97.64% and the absorption of its blank column for samples was the lowest. The recovery of this IAC column at three spiked concentration levels was in the range of 66.16%-112.80%, and the relative standard deviation was between 3.09% and 12.25%. It can be applied to purify actual samples.

Key words:polystyrene-divinylbenzene (PS-DVB); immunoaffinity columns (IAC); Fusarium toxins

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201620029

中图分类号:TS201.6

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)20-0172-05

引文格式:

张家宁, 丁轲, 韩涛, 等. 以聚苯乙烯-二乙烯苯为载体的多目标免疫亲和柱的制备及应用[J]. 食品科学, 2016, 37(20):172-176. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201620029. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Jianing, DING Ke, HAN Tao, et al. Preparation and application of multi-target immunoaffinity columns with polystyrene-divinylbenzene (PS-DVB) as carrier[J]. Food Science, 2016, 37(20): 172-176. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201620029. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-03-09

基金项目:北京市自然科学基金项目(14L00184);北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目(CIT&TCD20154045);2016年北京农学院学位与研究生教育改革与发展项目(2016YJS051)

作者简介:张家宁(1990—),女,硕士研究生,研究方向为食品安全检测技术。E-mail:s631852@163.com

*通信作者:丁轲(1978—),男,副教授,博士,研究方向为食品营养与安全。E-mail:dingk@tom.com