月桂叶油树脂的提取及呈香物质分析

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏南京 210023）

摘要：采用正交试验法优化月桂叶油树脂超临界CO 2萃取工艺条件，用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术和电子鼻技术分析鉴定超临界萃取、水蒸气蒸馏以及乙醇萃取所得油树脂差异。结果表明：超临界CO 2萃取的最佳条件为萃取压力22 MPa、萃取温度50 ℃、萃取时间2 h，此条件下月桂叶油树脂得率平均为2.12%。经GC-MS分析，超临界CO 2萃取所得油树脂鉴定出致香成分66 种，主要成分为乙酸松油脂（20.38%）、1,8-桉油醇（19.88%）、木香烃内酯（5.61%）、丁香酚甲醚（3.41%）、芳樟醇（2.57%）等；水蒸气蒸馏所得油树脂鉴定出的致香成分为42 种，其中主要成分为1,8-桉油醇（20.99%）、乙酸松油脂（19.34%）、丁香酚甲醚（2.56%）、去氢夙毛菊内酯（2.36%）、α-松油醇（2.17%）等；乙醇萃取所得油树脂鉴定出的致香成分为24 种，主要成分为1,8-桉油醇（15.33%）、4-蒈烯（10.75%）、乙酸松油脂（10.22%）、去氢夙毛菊内酯（10.09%）、木香烃内酯（2.62%）等。由电子鼻主成分分析与雷达图谱可以看出，不同的提取工艺所得到的月桂叶油树脂致香成分差异较大。

关键词：水蒸气蒸馏；超临界CO 2萃取；有机溶剂萃取；气相色谱-质谱法；电子鼻

月桂叶樟科常绿树甜月桂（Laurus nobilis）的叶，别名香叶、香桂叶、桂叶、天竺桂等，味芬芳，有肉桂的甜味，油含量约2%，是全球香料工业中最重要的精油之一 [1]。研究显示，月桂叶提取物对产酸克雷伯菌、肠炎沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌等有不同程度的抑制作用 [2-4]。除此之外在抗氧化作用、清除游离基、食品添加剂等方面也显示出了较好的应用前景 [5-6]。月桂的干叶及挥发油是重要的调味香辛料，主要用于食品调味品、肉制品、汤羹和鱼类的调味，且具有抗菌和杀虫活性，能够用作食品防腐剂，在化妆品行业月桂挥发油常用于制作面霜、香水和肥皂，应用研究受到广泛关注 [7-9]。目前，国内对月桂叶的研究主要集中在水蒸气蒸馏法提取后采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析其致香成分，而以调味油开发为目的，利用超临界CO 2萃取并结合电子鼻进行辨别分析的研究鲜有报道 [10-12]。相比大蒜油、花椒油相对成熟的工业化生产工艺，月桂叶调味油的开发还停留在初始阶段。

本实验采用正交试验法优化了月桂叶油树脂超临界萃取工艺条件，用GC-MS联用技术和电子鼻技术分析鉴定了超临界萃取、水蒸气蒸馏以及乙醇萃取所得油树脂差异，为月桂叶调味油的开发提供科学依据。

1 材料与方法

月桂叶市售；二氯甲烷（分析纯）上海润捷化学试剂有限公司；无水乙醇、无水硫酸钠（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司。

101-3AS型电热鼓风干燥箱上海苏进仪器设备厂；DFT-50A型粉碎机温岭市林大机械有限公司；CP213型OHAUS电子天平奥豪斯公司；KW-1000DC型数显恒温水浴锅国华电器有限公司；SHZ-D型循环水式真空泵巩义市予华仪器有限责任公司；OSB-2100型旋转蒸发仪上海爱朗仪器有限公司；WH-2微型旋涡混合仪上海沪西分析仪器厂有限公司；DZTW型电子调温电热套北京市永光明医疗仪器有限公司；6890N-5975 GC-MS联用仪安捷伦科技有限公司；Spe-ed SFE-4型超临界萃取仪美国应用分离公司；α-FOX3000型电子鼻传感器法国Alpha MOS仪器贸易有限公司。

采用水中蒸馏，取月桂叶粉末300 g放入2 L蒸馏烧瓶，以料液比1∶4（g/mL）加入蒸馏水1.2 L，为了促使油水混合物（乳浊液中油和水）的分离在水中加入适量NaCl，将电热套温度调至110 ℃，蒸馏时间2 h收集蒸馏液。将蒸馏液倒入分液漏斗，静止分离，取上层精油加入无水硫酸钠，24 h后过滤，得到干燥油树脂。

取月桂叶粉末，按料液比1∶5（g/mL）加入乙醇溶液。常温浸提20 h，真空抽滤，在40 ℃的条件下旋转蒸发回收溶剂得到月桂叶油树脂。

将月桂叶放入鼓风干燥箱（40 ℃）烘干，粉碎机粉碎，过20 目筛得月桂叶粉末。萃取过程中，压力、温度、时间、原料粒径和CO 2流量等参数对产品得率均有影响；而超临界CO 2萃取技术相关研究结果表明，萃取压力、萃取温度及萃取时间是3 个主要影响因素 [10-11]，故分别对这3 个工艺参数进行考察。参考史国安 [12]、樊红秀 [13]等的实验方法，将CO 2流速设定为20 L/h，限流阀（微量调节阀）温度设定为70 ℃。

称取80 g月桂叶，放入萃取釜并通入冷却后的CO 2气体，设定萃取温度、萃取压力和萃取时间。为优化萃取条件以提高油树脂得率，设计正交试验L 9（3 4），见表1，每次试验重复3 次。

表1 超临界CO 2萃取L 9（3 4）正交试验因素水平
Table1 Factor and levels used in L 9(3 4) orthogonal array design for spercritical CO 2extraction

从3 种不同制备方法得到的月桂叶油树脂中各取0.200 g，用二氯甲烷溶液溶解并定容至25 mL过滤，进行GC-MS分析。

GC条件：HP-5毛细管色谱柱（50 m×0.25 mm，0.50 μm）；载气：氦气；流量1 mL/min；进样量1 μL；进样口温度280 ℃；分流比20∶1；溶剂延迟时间5 min；升温程序：起始温度50 ℃，保持5 min，以3 ℃/min速率升温至170 ℃保持20 min，再以5 ℃/min速率升温至260 ℃保持10 min；质量扫描范围33～550 u。

各组分质谱经谱库（NIST 8.0）检索和资料分析鉴定，当匹配度超过90，则可以定性并采用峰面积归一化法对各种呈香物质定量 [14]。

电子鼻作为一项无损仿生嗅觉检测技术，它模仿人类的鼻子，对气味有较高的敏感性和客观性 [15]。如表2所示，本实验采用3 组金属氧化物传感阵列，共12 个传感器，检测对应不同敏感物质，以反映样品的整体风味信息 [16]。

表2 α-FOX3000电子鼻的12 根MOS传感器
Table2 Twelve MOS sensors used in α-FOX3000 electronic nose

量取每个月桂叶油树脂样2 000 μL装入3 支10 mL顶空瓶，加盖密封，放入电子鼻自动进样器用于顶空分析。

空气流速150 mL/min，顶空产生温度40 ℃，产生时间120 s，搅拌速率500 r/min，注射速率0.5 mL/s，顶空注射体积0.5 mL，收集时间360 s，延滞时间120 s。经软件分析得到传感器信号强度图并对获得的数据信息进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和雷达图谱分析。

2 结果与分析

图1 单因素试验结果图
Fig.1 Results of one-factor-at-a-time experiments

由图1A可知，当萃取温度为50 ℃，萃取时间为2 h时，得率会随压力的增大而增大且当压力到达22 MPa后，得率增加十分缓慢。因为随着压力升高超临界CO 2流体的溶解能力增强，可最大限度地溶解成分，但高压条件下超临界相密度随压力变化愈加缓慢导致当压力增加到一定程度后，溶解增加缓慢。由图1B可知，当萃取压力为22 MPa，萃取时间为2 h时，月桂叶油树脂得率会随温度的升高先上升后下降。在一定压力条件下，升高温度被萃取物的挥发性增强，分子的热运动加快，分子间缔和的机会增加，从而使溶解能力增大，得率会升高。另一方面，在一定压力条件下，由于升高温度作为萃取剂CO 2的分子间距增大，分子间作用力减小，密度降低，溶解能力相应下降得率会降低。如图1B所示，50 ℃之前升高温度使得被萃取物挥发性增强导致得率升高的因素占主导；50 ℃之后升高温度使得CO 2溶解能力降低导致得率降低的因素占主导。由图1C可知，当萃取温度为50 ℃，萃取压力为22 MPa时，得率随萃取时间延长而升高，但2 h后得率增长缓慢。

表3 超临界CO 2萃取L 9（3 4）正交试验结果
Table3 L 9(3 4) orthogonal array design with experimental results for supercritical CO 2extraction

表4 超临界CO 2萃取L 9（3 4）正交试验方差分析
Table4 Analysis of variance of L 9(3 4) orthogonal array design

注：F 0.01（2,2）=99，F 0.05（2,2）=19，F 0.1（2,2）=9；***.影响极为显著；**.影响显著；*.有一定影响。

以空列为误差项对上述试验结果进行方差分析，如表3、4所示。由A因素F=368.000＞F 0.01（2,2）可知，试验有99%的把握说明因素A（萃取压力）的水平改变对得率的影响极为显著；由F 0.01（2,2）＞B因素F=49.000＞F 0.05（2,2）可知，有95%的把握说明因素B（萃取温度）的水平改变对得率有显著的影响；由C因素F=17.000＞F 0.1（2,2）可知，有90%的把握说明因素C（萃取时间）的水平改变对得率有一定影响。通过比较各因素极差或显著性可以得出因素影响顺序为A＞B＞C。由正交试验表得出的最优组合为A 3B 2C 3。但由单因素试验可以看出，当萃取压力到达22 MPa，萃取时间超过2 h后，油树脂的得率增加十分缓慢，结合能耗考虑，最优组合选为A 2B 2C 2，即萃取压力22 MPa、萃取温度50 ℃、萃取时间2 h。用3 次重复实验验证最优条件，月桂叶油树脂得率分别为2.11%、2.13%、2.12%，取平均值为2.12%。

水蒸气蒸馏法月桂叶油树脂得率为1.29%；乙醇萃取得率为0.95%；在最优萃取条件下，超临界CO 2萃取月桂叶油树脂的得率为2.12%，与杨靖等 [14]2.16%的最优得率吻合，且相对其30 MPa的最优萃取压力，在22 MPa的萃取压力下所得油树脂颜色更透明，流动性也更好，对后续月桂叶调味油的开发更有利。

图2 不同提取方式所得月桂叶精油香气成分总离子流图
Fig.2 Total ion aroma components of laurel leaf oils extracted with different extraction methods

如图2所示，超临界CO 2萃取所得油树脂样出峰数为174；水蒸气蒸馏所得油树脂样出峰数为125；乙醇萃取所得油树脂样出峰数为45。故从3 个总离子流图的出峰数量和出峰丰度能看出超临界CO 2萃取所得油树脂样致香成分种类及相对含量均高于其他2 种方法。

表5 3 种月桂叶油树脂GC-MS致香成分分析
Table5 Aroma components identified in laurel leaf oleoresins by GC-MS

如表5所示，经过质谱经谱库（NIST 8.0）检索和资料分析鉴定，按匹配度不低于90进行筛选。水蒸气蒸馏所得油树脂样鉴定出物质42 种，占挥发性物质总量的70.04%；超临界CO 2萃取所得油树脂样鉴定出物66 种，占挥发性物质总量的89.49%；乙醇萃取所得油树脂样鉴定出物质24 种，占挥发性物质总量的60.97%。

表6 3 种月桂叶油树脂致香成分相对含量
Table6 Quantitative analysis of aroma components in laurel leaf oleoresins

由表6可以看出，相比水蒸气蒸馏和乙醇萃取，超临界CO 2萃取能够保留更多种月桂叶中的致香成分。油树脂鉴定出的致香成分主要有醇类、酯类、烯烃类、酚类、醚类、酮类、烷烃类、醛类、芳香烃类等 [17]。醇类、酯类物质相对含量较高，约占致香成分总量的50%～60%，是油树脂的基本香气物质。酯类对风味影响较大，其中乙酸松油酯相对含量最高，具有清香带甜，似香柠檬、薰衣草气息，留香时间较长，广泛用于薰衣草、辛香、柑橘香型等日用香精，也用于白柠檬、樱桃、辛香、肉香等食用香精，在调味油中起增强辛香的作用，对油树脂致香效果贡献较大。醇类通常具有芳香或酸败气味，植物挥发油中一般都含有多种萜醇和芳香醇。所提油树脂中相对含量最高的醇类为1,8-桉油醇，有樟脑气息和清凉的草药味道，用于止咳糖、人造薄荷中。两者对月桂叶油树脂气味的形起关键作用。其次，酮类和醛类属于挥发性羰基化合物，也会产生浓郁的香味。

图3 不同月桂叶油树脂的PCA图（A）和雷达图谱（B）
Fig.3 PCA and radar plots for laurel leaf oleoresins extracted by different extraction methods

PCA是一个包含PC1和PC2的二维平面图谱 [18]。由图3A可知，PC1和PC2的贡献率分别为97.4%和2.225%，二者累积方差贡献率为99.625%，大于85%的标准。说明PCA可以将样本传感器响应信号的大部分原始数据以PC1 和PC2得分矩阵的形式表示出来，包含了样品很大的信息量，能反映月桂叶油树脂的整体信息 [19]。3 种油树脂沿x轴方向的分离趋势明显，其中超临界CO 2萃取和水蒸气蒸馏所得油树脂沿y轴方向的分离效果较差。从整体分离效果来看，3 种油树脂均能完全区分开，说明各自气味特征明显，不同的提取方法对挥发性气味影响较显著。由图3B可以看出，电子鼻传感器对3 个不同样品挥发性气味产生的信号在LY2/G、LY2/GH、LY2/gCTL、LY2/gCT四根传感器上均显示出显著的差异性，也说明3 种样品的香气特征存在显著差异。

由图3B可知，LY2/G、LY2/GH、LY2/gCTL、LY2/gCT四根传感器对乙醇萃取所得油树脂挥发气体中的有机胺类、硫化物、烷烃、羰基化合物的响应值很低，较好的匹配了GC-MS分析结果中烷烃、醛类、酮类相对含量很低分别为0.12%、0.02%、0.11%的结果。GC-MS可对油树脂中挥发性物质的具体种类和相对含量进行检测，但不能分析这些物质作为一个整体时对样品风味特征的贡献。电子鼻与之相反，得到的不是被测样品中各挥发性物质的定性或定量结果，而是样品的整体风味信息。2 种技术配合使用有利于同时从表观和微观上研究样品风味，GC-MS的分析结果有利于对电子鼻分析结果进行解释 [21-23]。

3 结论

通过正交试验可知，超临界CO 2萃取的最佳条件为萃取压力22 MPa、萃取温度50 ℃、萃取时间2 h，此条件下月桂叶油树脂得率平均为2.12%。

由GC-MS分析可知，月桂叶油树脂中相对含量最多的为酯类和醇类，乙酸松油酯、1,8-桉油醇、木香烃内酯、丁香酚甲醚、芳樟醇等为主要致香成分。超临界CO 2萃取所得油树脂检测出66 种挥发性成分，而其他2 种提取方法所得油树脂分别鉴定出42 种和24 种挥发性成分。从得率和致香成分来看，超临界CO 2萃取技术具有优越性。

由图3可以看出，不同的提取工艺所得到的月桂叶油树脂致香成分差异较大。电子鼻技术检测不同油样整体香气物质的区分趋势和GC-MS分析的具体香气物质结果有较好的匹配度，采用电子鼻分析方法可以较好地区分不同方法提取出的月桂叶油树脂。

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QIAN Yuan, YAO Yijun, YIN Shi, YUAN Qiang, JU Xingrong, WANG Lifeng*
(Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China)

Abstract：An orthogonal array design was used to optimize the process conditions for supercritical CO 2extraction of laurel leaf oleoresin. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and electronic nose (E-nose) were used to identify the differences in aroma composition among laurel leaf oleoresins extracted with supercritical CO 2, steam distillation and ethanol. The optimal conditions for supercritical CO 2extraction were determined as follows: extraction pressure, 22 MPa; temperature, 50 ℃, and time, 2 h. Under these conditions, the average yield of laurel leaf oleoresin was 2.12%. GC-MS analysis revealed that a total of 66 aroma compounds were identifed from supercritical CO 2-extracted laurel leaf oleoresin, mainly including terpinyl acetate (20.38%), 1,8-cineole (19.88%), costunolide (5.61%), methyleugenol (3.41%), and linalool (2.57%), 42 volatile aroma compounds were identifed from laurel leaf oleoresin extracted by steam distillation, consisting mainly of 1,8-cineole (20.99%), terpinyl acetate (19.34%), methyleugenol (2.56%), dehydrosaussurealactone (2.36%), and α-terpineol (2.17%), and ethanol-laurel leaf oleoresin were found to contain 24 aroma components, mainly 1,8-cineole (15.33%), 4-carene (10.75%), terpinyl acetate (10.22%), dehydrosaussurealactone (10.09%), and costunolide (2.62%). The principal component analysis (PCA) and radar plots of E-nose data revealed that laurel leaf oleoresins extracted by demonstrated considerable differences in aroma composition.

Key words：steam distillation; supercritical CO 2extraction; organic solvent extraction; gas chromatography-mass spectrometry; electronic nose

钱源, 姚轶俊, 殷实, 等. 月桂叶油树脂的提取及呈香物质分析[J]. 食品科学, 2016, 37(22): 119-125. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201622017. http://www.spkx.net.cn

QIAN Yuan, YAO Yijun, YIN Shi, et al. Extraction and aroma composition of laurel leaf oleoresin[J]. Food Science, 2016, 37(22): 119-125. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622017. http://www.spkx.net.cn

基金项目：国家重点研发计划项目（2016YFD0400201；2016YFD0401401）；国家自然科学基金面上项目（31571766）；

江苏省自然科学基金项目（BK20141485）；江苏省高校自然科学重大项目（15KJA550002）

作者简介：钱源（1991—），男，硕士研究生，主要从事食品加工研究。E-mail：443165901@qq.com

*通信作者：王立峰（1977—），男，教授，博士，主要从事食品加工、活性蛋白肽及植物多酚研究。E-mail：wanglifeng_8@163.com

月桂叶油树脂的提取及呈香物质分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论