RP-HPLC法测定东北地区6 种红树莓果实中有机酸组成

旷 慧 1,李亮亮 1,吕长山 2,王金玲 1,*

(1.东北林业大学林学院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.东北农业大学应用技术学院,黑龙江 哈尔滨 150030)

摘 要:建立一种反相高效液相色谱法分离和测定6 种红树莓果实中草酸、酒石酸、柠檬酸、DL-苹果酸和乳酸5 种有机酸的方法。色谱条件为:采用SinoChrom DS-BP C 18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-0.01 mol/L KH 2PO 4溶液(pH 2.60,97∶3,V/V),流速0.6 mL/min,柱温30 ℃,检测波长210 nm。结果表明:在此条件下5 种有机酸都被有效地分离,各种有机酸的质量浓度与峰面积在测定范围内呈良好的线性关系,标准曲线相关系数在0.999 3~0.999 9之间;精密度实验相对标准偏差在0.20%~1.53%(n=5)范围内;回收率为98.83%~105.42%,相对标准偏差为0.06%~1.00%。测得6 种红树莓果实中有机酸以柠檬酸为主,含量为1 058.41~1 825.45 mg/100 g,草酸、乳酸、DL-苹果酸含量较低,未检测到酒石酸。该方法简单、高效、准确、重复性好,可用于红树莓果实中有机酸的分离测定。

关键词:红树莓;有机酸;反相高效液相色谱法

树莓(Rubus ideaus L.)为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus spp.)植物。红树莓果实酸甜可口,富含有机酸 [1]。有机酸是存在于果蔬中的一类天然化合物,是影响果蔬风味的一种主要物质,有机酸种类及含量决定其口感与品质 [2]。有机酸还能刺激体内消化液的分泌,促进食物的消化,是维持人体酸碱平衡的重要物质 [3]。目前国内外对红树莓有机酸分析的报道很少,研究不同品种红树莓果实中有机酸种类及含量,对红树莓品种的筛选、品质的改善和产品开发具有重要意义。

有机酸的测定方法有分光光度法、色谱法(气相色谱法、高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法、离子色谱法、薄层色谱法)、电泳法、酶法等 [4-9]。HPLC法因其简单、快速、准确的特点成为测定有机酸常用的方法,已经广泛用于苹果、梨、葡萄、沙棘、番茄等果蔬中有机酸种类分析和含量测定 [10-14],这为红树莓果实中有机酸的分析测定提供了参考。本实验建立一种反相-HPLC(reversed phase-HPLC,RP-HPLC)法对6 种红树莓果实中有机酸进行分离测定,分析了红树莓果实中有机酸的种类和含量及种间差异,并与蓝莓中有机酸的种类和含量进行对比,为红树莓有机酸的定性定量分析提供一种有效方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红树莓品种:‘野生’(Wild red raspberry)、‘宝石红’(U.S. Raspberry)、‘哈瑞太兹’(Heritage)、‘欧洲红’(European red raspberry)、‘菲尔杜德’(Fertod Zamatos)、‘秋福’(Autumn Bliss),均为栽培品种。蓝莓品种:‘北陆’(Hokuriku)。6 种红树莓和蓝莓均采自黑龙江省尚志市,成熟度一致,速冻处理后运回东北林业大学食品科学与工程实验室冻藏。

草酸、酒石酸、柠檬酸、DL-苹果酸、乳酸标准品(均为分析纯) 天津市致远化学试剂有限公司;磷酸二氢钾(分析纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司;磷酸(分析纯) 天津市化学试剂三厂;甲醇(色谱纯) 赛默飞世尔(中国)有限公司;纯净水 杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 仪器与设备

1260 HPLC仪 美国安捷伦公司;0.45 μm微孔滤膜天津市奥特赛恩斯仪器有限公司;FA-2004型电子天平上海天平仪器厂;超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;PHS-3C型pH酸度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

SinoChrom DS-BPC 18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相为甲醇-0.01 mol/L KH 2PO 4溶液(pH 2.60,97∶3,V/V);流速0.6 mL/min;柱温30 ℃;检测波长210 nm。

1.3.2 样品处理

红树莓解冻后研磨成匀浆,称取10.000 g匀浆液加入50 mL蒸馏水超声(温度25 ℃,功率300 W)提取30 min,冷却后离心(4 000 r/min,15 min),收集上清液,残渣重复超声提取15 min后离心,合并上清液,用纯净水定容于100 mL容量瓶中 [15]。提取液经0.45 μm微孔滤膜过滤后,用于RP-HPLC分析。

1.3.3 标准曲线绘制

分别精密称取0.100 0 g草酸、0.200 0 g酒石酸、0.200 0 g乳酸、0.400 0 g苹果酸、0.400 0 g柠檬酸,用纯净水溶解并定容至100 mL容量瓶中,摇匀,得到混合有机酸标准母液。分别吸取混合标准溶液,进行梯度稀释,经0.45 μm的微孔滤膜过滤后用于RP-HPLC分析。进样量10 μL,以峰面积(X)对各种有机酸质量浓度(Y)求回归方程和相关系数。

1.4 数据处理

数据采用Word、Excel、SPSS 11.5软件进行处理与分析。结果以x±s表示。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

2.1.1 流动相配比

选择以甲醇和0.01 mol/L KH 2PO 4溶液为流动相。固定流速为0.6 mL/min,流动相pH 2.60,柱温30 ℃,分别以甲醇-0.01mol/L KH 2PO 4溶液配比为99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5(V/V)对有机酸混合标准溶液和红树莓样品溶液进行测定。结果表明,当甲醇-0.01mol/L KH 2PO 4溶液比例在99∶1~95∶5范围内时,5 种有机酸分离度越来越好,但出峰时间不断延长;当甲醇-0.01mol/L KH 2PO 4溶液比例大于97∶3时,虽然5 种有机酸能有效地被分离,但出峰时间较长,同时KH 2PO 4溶液比例增大容易对色谱柱造成损害。故综合考虑,确定甲醇-0.01mol/L KH 2PO 4溶液配比为97∶3(V/V),此时样品和混合标准溶液中各种有机酸能够有效分离,峰形也较好。

2.1.2 流动相pH值

固定流动相甲醇-0.01 mol/L KH 2PO 4溶液配比为97∶3 (V/V),流速0.6 mL/min,柱温30 ℃,考察流动相不同pH值(2.50、2.60、2.70、2.80、2.90)对有机酸混合标准品和红树莓样品中有机酸分离效果的影响。结果表明:随着pH值增大,出峰时间提前,分离度降低;当pH值小于2.6时,出峰时间较长;当pH值大于2.6时,草酸和酒石酸未能完全分开;在pH 2.6时,样品和混合标准溶液

中各种有机酸都能达到基线分离,峰形更好。故确定流动相pH值为2.6。

2.2 流速的选择

固定流动相甲醇-0.01 mol/L KH 2PO 4溶液配比为97∶3 (V/V),pH 2.60,柱温30 ℃,考察流速分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL/min时对有机酸混合标准品和红树莓样品中有机酸分离效果的影响。结果表明:随着流速增大,出峰时间提前,但分离效果越差,当流速大于0.6 mL/min时,草酸和酒石酸分离效果差。同时随着流速增大,柱压升高,较高的柱压会损害仪器和色谱柱 [4]。因此综合考虑出峰时间、分离效果和柱压,选择流速为0.6 mL/min。

2.3 标准曲线

以一定质量浓度梯度的有机酸混合标准溶液进样分析,以峰面积(X)对5 种有机酸质量浓度(Y)求回归方程和相关系数,结果如表1所示。

表1 有机酸测定的回归方程
Table1 Regression equations for determination of organic acids

2.4 精密度实验结果

以‘秋福’品种果实样品溶液进行精密度实验,连续进样5 次,根据所得峰面积计算各有机酸精密度,如表2所示。草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、DL-苹果酸的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)在0.20%~1.53%范围内,表明该方法具有良好的精密度。

表2 精密度实验结果(n=5)
Table2 Results of precision test (n= 5)

注:—.未检出,下同。

2.5 回收率实验结果

精确量取‘哈瑞太兹’红树莓样品溶液5.00 mL,加入5.00 mL有机酸混合标样(草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、DL-苹果酸质量浓度分别为1.00、2.00、2.00、4.00、4.00 mg/mL)。连续进样5 次,计算平均加标回收率。如表3所示,草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、DL-苹果酸的平均加标回收率为98.83%~105.42%,RSD 为0.06%~1.00%,均符合分析方法的要求。

表3 回收率实验结果
Table3 Results of recovery test

2.6 样品分析

在优化的条件下对6 种红树莓样品及蓝莓进行RPHPLC分析,如图1所示。

图1 有机酸混合标样(A)、‘野生’红树莓果实样品(B)和蓝莓果实样品(C)RP-HPLC图
Fig.1 RP-HPLC chromatograms of organic acid standards (A), organic acids extracted from wild red raspberry fruit (B) and organic acids extracted from blueberry fruit (C)

2.7 样品的测定

从表4可知,6 种红树莓中各种有机酸平均含量表现为:柠檬酸>乳酸>DL-苹果酸>草酸,未检测到酒石酸。柠檬酸含量最高,为1 058.41~1 825.45 mg/100 g,平均含量是菠萝中柠檬酸含量的2.33 倍 [16]。5 种红树莓中乳酸含量为78.80~306.79 mg/100 g,但在‘哈瑞太兹’中未检测到乳酸。DL-苹果酸和草酸在红树莓果实中含量较低,含量分别为17.47~135.28 mg/100 g和

39.27~103.84 mg/100 g。国内外也有类似的报道。韩加等 [17]发现新疆树莓果实中有机酸主要以柠檬酸为主(15.62%),也含有乙酸(1.16%)、苹果酸(0.29%)和酒酸(0.14%)。Cekic等 [18]发现土耳其北部地区的10 种红树莓中主要有机酸为柠檬酸,平均含量为1 310 mg/100 g,苹果酸含量较少(数据未给出)。蓝莓中有机酸以柠檬酸为主(1 062.29 mg/100 g),草酸、DL-苹果酸和酒石酸含量都很低,未检测到乳酸,且蓝莓中有机酸含量显著低于红树莓。

表4 6 种红树莓果实中各种有机酸含量
Table4 The contents of organic acids in 6 varieties of red raspberry fruits

注:同列不同小写字母肩标表示在0.05水平上差异显著。

6 种红树莓中柠檬酸、乳酸、DL-苹果酸和草酸含量均存在显著差异,其中‘宝石红’和‘哈瑞太兹’中柠檬酸含量较高,‘欧洲红’中乳酸和草酸含量比其他品种含量高,‘菲尔杜德’和‘野生’红树莓中DL-苹果酸含量比其他品种含量要高,‘野生’红树莓中乳酸和草酸含量比其他品种低,表明6 种红树莓果实中有机酸种类和含量有一定差异,其主要与红树莓品种的内在遗传特性有关 [19-20]

3 讨 论

有机酸易溶于水,为提高提取效率,本实验采用超声提取法,考察了超声提取时间对有机酸提取效率的影响。设定提取时间分别为15、30、45 min,结果发现随提取时间延长,有机酸含量增加,但提取时间超过30 min后,有机酸含量没有显著增加,因此选择最佳的提取时间为30 min。

柠檬酸酸味大,酸味突出,DL-苹果酸与柠檬酸相比,具有酸度强、味道柔和、滞留时间长等特点,是新一代的食品酸味剂,被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂” [21-22]。‘菲尔杜德’和‘野生’红树莓中DL-苹果酸占总酸的比例分别为7.23%、6.50%,其较高含量的DL-苹果酸可能使这2 种红树莓果实的酸味呈现更加柔和的特点。草酸易与肠道中的Ca 2+结合形成不溶性的草酸钙,干扰人体对Ca 2+的吸收,因此草酸含量的高低与果实的品质密切相关 [23];‘欧洲红’中草酸含量最高,为(103.84±0.54) mg/100 g,较高含量的草酸可能会降低‘欧洲红’红树莓的营养价值和果实品质。

‘菲尔杜德’和‘宝石红’红树莓中柠檬酸占总酸的比例较大,分别为47.63%、40.66%,同时实验表明这2 种红树莓中可滴定酸含量也较高,分别为(1.87±0.01)%、(1.75±0.01)%。对实验结果采用Pearson法进行相关性分析发现红树莓中柠檬酸含量与可滴定酸含量在0.05水平上具有相关性(r=0.533)。研究发现‘哈瑞太兹’和‘宝石红’红树莓中总固形物含量/可滴定酸、总糖/可滴定酸显著高于其他品种(分别为8.30、5.54和8.14、5.18),同时柠檬酸占总酸的比例也较低,分别为21.24%、13.00%,表明这2 种红树莓口感更好,更适合鲜食 [21]

本实验中,‘哈瑞太兹’红树莓中未检测到乳酸,而其他5 个红树莓品种中都含有乳酸,可能原因是‘哈瑞太兹’红树莓中乳酸含量很低,低于该线性范围(0.10~2.00 mg/mL);也可能是该红树莓品种中乳酸与其他物质如蛋白质、多糖、金属离子等结合形成络合物,干扰了机器对乳酸分子的识别;或者该红树莓品种中乳酸分子在本实验的提取条件下未能充分游离出来 [24-25]。在本实验的分离条件下,混合有机酸标准溶液中草酸和酒石酸尚未完全分离,这可能是在红树莓中尚未检测到酒石酸的原因之一。

4 结 论

本实验建立了一种RP-HPLC法测定6 种红树莓果实中有机酸含量,该方法准确、灵敏、高效。结果表明,红树莓果实中有机酸以柠檬酸为主,含有少量的DL-苹果酸、乳酸、草酸,不含酒石酸。红树莓果实中其他有机酸(如奎宁酸、琥珀酸、乙酸等)含量有待进一步分析。

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Determination of Organic Acids in Six Varieties of Red Raspberry Fruits Grown in Northeast China by RP-HPLC Method

KUANG Hui 1, LI Liangliang 1, LÜ Changshan 2, WANG Jinling 1,*
(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2. School of Applied Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:A reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method was established to determine the contents of organic acids including oxalic acid, tartaric acid, citric acid, DL-malic acid and lactic acid in six varieties of red raspberry fruits from Northeast China. The optimized chromatographic conditions were determined as follows: a SinoChrom DS-BP C 18column (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) was chosen to separate organic acids, and the mobile phase was composed of methanol-0.01 mol/L KH 2PO 4aqueous solution (pH 2.60, 97:3, V/V) at a fow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃ and the eluate was monitored at 210 nm. The results indicated that the fve organic acids were separated successfully and a strong linear relationship appeared between the concentrations of organic acids and the peak areas under the above optimized conditions with correlation coeffcients between 0.999 3 and 0.999 9. The relative standard deviations (RSDs) of precision ranged from 0.20% to 1.53% and the average recovery rates were between 98.83% and 105.42% with RSD ranging from 0.06% to 1.00%. Citric acid was the predominant organic acid in red raspberry fruits, ranging from 1 058.41 to 1 825.45 mg/100 g. Trace amounts of oxalic acid, lactic acid and DL-malic acid were also detected but tartaric acid was not detected in red raspberry fruits. Overall, the presented method could be applied for separating and detecting different organic acids in red raspberry fruits effectively, accurately and repeatedly.

Key words:red raspberry; organic acids; reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622018

中图分类号:S663.2;TS201.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)22-0126-05

引文格式:

旷慧, 李亮亮, 吕长山, 等. RP-HPLC法测定东北地区6 种红树莓果实中有机酸组成[J]. 食品科学, 2016, 37(22): 126-130. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622018. http://www.spkx.net.cn

KUANG Hui, LI Liangliang, LÜ Changshan, et al. Determination of organic acids in six varieties of red raspberry fruits grown in Northeast China by RP-HPLC method[J]. Food Science, 2016, 37(22): 126-130. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622018. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-05-14

基金项目:中央高校基本科研业务费专项(2572014CA14)

作者简介:旷慧(1992—),女,硕士研究生,研究方向为植物源活性物质。E-mail:belonghui2008@163.com

*通信作者:王金玲(1975—),女,副教授,博士,研究方向为植物源活性物质。E-mail:wangjinling08@163.com