赵东瑞 1，张丽末 1，张锋国 3，孙金沅 1,2,*，孙啸涛 1,2，黄明泉 1,2，郑福平 1,2，孙宝国 1,2
（1.北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048；2.北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048；3.山东国井集团技术中心，山东 高青 256300）
摘 要：应用固相微萃取法、液液萃取法结合气相色谱-质谱联用分析手段对芝麻香型白酒中含硫化合物进行定性分析。通过配制模拟酒样对固相微萃取法、液液萃取法的前处理条件进行优化。在最优条件下对36 个芝麻香型白酒酒样中的微量成分提取分析，固相微萃取法共检出178 种挥发性成分，液液萃取法共检出239 种挥发性成分。两种方法共检出14 种含硫化合物，均采用标准品比对进行准确定性。首次在中国白酒中检测出硫代丁酸甲酯、糠基甲基硫醚、硫代呋喃甲酸甲酯、4-甲基二苯并噻吩、3-甲硫基丁醛、甲基硫代磺酸甲酯6 种含硫化合物；此外，首次在芝麻香型白酒中检出苯并噻唑和苯并噻吩。
关键词：固相微萃取法；液液萃取法；气相色谱-质谱；芝麻香型白酒；含硫化合物
作为我国传统的蒸馏酒，中国白酒经过几十年的创新发展，现已初步形成12 种白酒香型 [1]。其中，芝麻香型白酒是借鉴清香型白酒和浓香型白酒生产工艺，将酱香型白酒生产工艺进一步升华、提炼、科技创新发展而来的 [2]。因此，芝麻香型白酒既具有清香型白酒的清净典雅，又具有浓香型白酒的绵柔丰满，还具有酱香型白酒的幽雅细腻，而且综合感官具有焙烤芝麻的特殊香气 [3]。21世纪以来，芝麻香型白酒发展迅速，生产工艺日趋成熟，产品质量不断提升 [4]。因其独特的口感，芝麻香型白酒日益受到人们的广泛关注与喜爱。
白酒香气主要决定于其中所含的微量成分。进入21世纪后，尤其是近10 年来，随着前处理方法的丰富以及精密分析仪器的普及，人们对白酒中微量成分的研究逐步深入 [5-8]。其中，含硫化合物是白酒中一类重要的微量成分，一般是由含硫氨基酸转化而来，其含量一般较少，但由于它们的香气阈值较低，能赋予白酒特有的香气，使得不同香型的白酒之间有明显的差别 [9]。目前已报道的酒样中微量成分的前处理方法主要有直接进样 [10]、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME） [11-20]、液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE） [21-25]、固相萃取 [26]、搅拌棒吸附萃取 [27-28]等方法。SPME法和LLE法是应用较广泛的提取酒中微量成分的方法。2012—2014年，张媛媛等 [3,29]曾采用浸入式SPME法、LLE法结合多种检测手段对国井芝麻香型白酒中含硫风味组分进行分析，共鉴定出11 种含硫化合物。其中，首次在中国白酒中检测出甲硫基乙酸乙酯、糠硫醇、二糠基二硫醚、二异丙基二硫醚和二甲基硫代亚磺酸酯。首次在芝麻香型白酒中检测出二甲基四硫醚。且其中糠硫醇、二糠基二硫醚等含硫化合物的香气特征与芝麻香型白酒香气特征相契合。但尚有一些疑似含硫化合物未能准确定性。
GB/T 20824—2007《芝麻香型白酒》中规定芝麻香型白酒特征成分为含硫化合物3-甲硫基丙醇。本实验室通过前期研究发现将其作为特征成分有不合理之处 [30]，认为应该是其他一些含硫和含氮化合物的共同作用形成了芝麻香型白酒的特征风味 [31-32]。因此有关芝麻香型白酒中含硫化合物的分析研究还有待进一步深入。
本研究采用SPME法、LLE法结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对芝麻香型白酒中含硫化合物进行定性分析，为探究含硫化合物对芝麻香型白酒风味的贡献，科学解释芝麻香型白酒风味的形成以及优化芝麻香型白酒酿造工艺提供理论依据。
1.1 材料与试剂
36 个不同的芝麻香型白酒原酒和商品酒酒样，分别来自6 家最主要的芝麻香型白酒生产企业，分别为山东扳倒井股份有限公司、泰山酒业集团股份有限公司、江苏今世缘酒业股份有限公司、山东景芝酒业股份有限公司、济南趵突泉酿酒有限责任公司和山东兰陵企业（集团）总公司。
无水乙醇（色谱纯），氯化钠、乙醚、正戊烷、二氯甲烷、氢氧化钠、浓盐酸、无水硫酸钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；3-甲硫基丙醇、二甲基三硫醚、甲硫基乙酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、硫代丁酸甲酯、4-甲基二苯并噻吩、苯并噻唑、2-丙硫醇、二异丙基二硫醚、糠硫醇、二糠基二硫醚、苯并噻吩、硫代呋喃甲酸甲酯、4-甲基-5-羟乙基噻唑 百灵威科技有限公司；二甲基二硫醚、二乙基三硫醚、3-巯基-2-丁酮 自制；噻唑、糠基甲基硫醚、2,3-丁二硫醇、3-甲硫基丙醛 滕州瑞元香料厂；甲基硫代磺酸甲酯、3-甲硫基丁醛 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；氢气、氮气、合成空气、氦气 北京氦普北分气体工业有限公司。
1.2 仪器与设备
BL-2200H电子分析天平 岛津国际贸易（上海）有限公司；DF-101S恒温加热磁力搅拌器 河南省巩义市予华仪器有限公司；PSHJ-5雷磁酸度计 上海精密科学仪器有限公司；102-1红外线干燥箱 北京市兴争仪器设备厂；OSB-2000旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；N-EVAPTM氮吹仪 美国Organomation Associates公司；移液枪（100、200、1 000 μL） 艾本德中国有限公司；容量瓶（10、50、100 mL） 国药集团化学试剂有限公司；进样瓶（2 mL）、7890A气相色谱-火焰光度检测器（gas chromatography-flame photometric detector，GC-FPD）、7890B-5977A GC-MS联用仪、7890A-5975C GC-MS联用仪 美国Agilent公司；顶空进样瓶（40 mL） 中国安普公司；萃取纤维头（65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/ divinylbenzene，PDMS/DVB）、75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（carbon/PDMS，CAR/PDMS）、100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 mm聚丙烯酸酯） 美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 模拟酒样配制
选择13 种含硫化合物（2-丙硫醇、二甲基二硫醚、噻唑、二异丙基二硫醚、3-巯基-2-丁酮、2,3-丁二硫醇、二甲基三硫醚、糠硫醇、二乙基三硫醚、3-甲硫基丙
醇、4-甲基-5-羟乙基噻唑、二糠基二硫醚、4-甲基二苯并噻吩）作为建立SPME法、LLE法的目标化合物。其中，LLE法重点关注二糠基二硫醚、糠硫醇、4-甲基-5-羟乙基噻唑。
1.3.1.1 SPME法模拟酒样的配制
以无水乙醇为溶剂配制1.3.1节所述13 种目标化合物混合标准溶液，质量浓度均为10.0 mg/L。以体积分数为60%的乙醇溶液为溶剂将上述混合标准溶液稀释20 倍，作为模拟酒样。模拟酒样中上述目标化合物质量浓度均为0.5 mg/L。
1.3.1.2 LLE法模拟酒样的配制
以无水乙醇为溶剂配制二糠基二硫醚、糠硫醇、4-甲基-5-羟乙基噻唑3 种目标化合物混合标准溶液，质量浓度均为10.0 mg/L。以体积分数为60%的无水乙醇溶液为溶剂将上述混合标准溶液稀释60 倍，作为模拟酒样。
1.3.2 样品前处理
1.3.2.1 SPME法的建立
采用单因素试验法依次优化萃取纤维、萃取温度、萃取时间、酒样酒精度、酒样加入NaCl质量浓度5 个影响因素。萃取纤维的选择：分别采用5 种萃取纤维提取1.3.1节所述目标含硫化合物。用移液枪准确移取5 mL 1.3.1.1节所述模拟酒样于40 mL顶空进样瓶中，加入搅拌子，将顶空进样瓶密封好，置于50 ℃水浴锅中平衡15 min，转速600 r/min，后在同样温度、转速条件下萃取40 min，萃取完毕后取出纤维头，插入GC进样口，解吸时间5 min、解吸温度250 ℃，用于GC-FPD分析。其他4 个影响因素依次优化。萃取纤维在萃取前均经过高温净化。上述均进行3 次平行实验。
1.3.2.2 LLE法的建立
采用单因素法依次优化萃取溶剂、萃取pH值、酒样酒精度、酒样加入NaCl质量浓度、平衡时间5 个影响因素。萃取溶剂的选择：量取30 mL 1.3.1.2节所述模拟酒样，分别采用3 种溶剂提取1.3.1节所述目标含硫化合物。萃取3 次，每次用量为酒样经处理后体积的1/3，静置分层后收集萃取液，加入无水硫酸钠，冰箱冷冻室（-18 ℃）内静置10 h除水，除水后的萃取液经过滤、浓缩至0.5 mL，用于GC-MS分析。其他4 个影响因素依次优化。上述均进行3 次平行实验。
1.3.2.3 酒样前处理
SPME法：用移液枪准确移取5 mL 1.1节所述酒样于40 mL顶空进样瓶中，用煮沸后冷却至室温的去离子水将酒样酒精度稀释至15°，加NaCl至过饱和（酒样中NaCl有析出）；加入搅拌子，将顶空进样瓶密封好，置于20 ℃水浴锅中平衡15 min，转速为600 r/min；选取涂层为75 mm CAR/PDMS（黑色）的萃取纤维在同样温度、转速条件下萃取70 min；萃取完毕后取出纤维头，插入GC进样口，解吸时间5 min，解吸温度250 ℃，用于GC-MS分析。
LLE法：量取30 mL 1.1节所述酒样，用煮沸后冷却至室温的去离子水将酒样酒精度稀释至15°，用配制好的氢氧化钠（1 mol/L）、盐酸溶液（4 mol/L）将酒样pH值调为7；平衡静置24 h后，选取二氯甲烷作为萃取溶剂，萃取3 次，每次用量为酒样稀释后体积的1/3；静置分层后收集下层萃取液，加入无水硫酸钠，冰箱冷冻室（-18 ℃）内静置10 h除水；除水后的萃取液经过滤、浓缩至0.5 mL，用于GC-MS分析。
1.3.3 分析条件
色谱柱：DB-FFAP毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气：GC-FPD采用高纯N 2（99.999%），GC-MS采用He（99.999%）；恒流：柱流速1.0 mL/min；不分流模式，进样量：1 μL，进样口温度：250 ℃；升温程序：初温35 ℃，以10 ℃/min升至50 ℃，保持20 min；以1 ℃/min升至70 ℃，保持10 min，再以3 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。
FPD条件：检测器温度：200 ℃；传输线温度：200 ℃；氢气流速：50.0 mL/min；空气流速：60.0 mL/min。
MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源250 ℃；四极杆温度150 ℃；传输管线温度280 ℃；定性采用全扫描模式；扫描质量范围45～350 u，扫描时间0.2 s。上述均进行3 次平行实验。
1.3.4 定性分析
芝麻香型白酒中微量成分的定性分析采用NIST 11谱库检索、人工解谱，并结合保留指数比对以及标准品比对。C 7～C 33正构烷烃与1.1节所述酒样、标准品在1.3.3节所述GC-MS分析条件下进样分析。保留指数计算公式：
式中：RI为保留指数；n和n+1分别为未知物流出前后正构烷烃碳原子数；t n和t n+1分别为相应正构烷烃的保留时间；t为未知物在GC中的保留时间（t n＜t＜t n+1）。
2.1 SPME法的建立
SPME法选取的目标化合物包含硫醚类、硫醇类、噻唑类、噻吩类等白酒中已报道 [5,33]或常见含硫化合物。
分别为2-丙硫醇、二甲基二硫醚、噻唑、二异丙基二硫醚、3-巯基-2-丁酮、2,3-丁二硫醇、二甲基三硫醚、糠硫醇、二乙基三硫醚、3-甲硫基丙醇、4-甲基-5-羟乙基噻唑、二糠基二硫醚、4-甲基二苯并噻吩。
实验考察了5 个因素（萃取纤维、萃取温度、萃取时间、酒样酒精度、酒样加入NaCl质量浓度）对SPME萃取1.3.1节所述目标含硫化合物的结果影响。GC-FPD分析结果如图1所示。
图1 萃取纤维（A）、萃取温度（B）、萃取时间（C）、酒样酒精度（D）、酒样加入NaCl质量浓度（E）对SPME结果的影响
Fig.1 Effect of SPME parameters: (A) extraction fiber; (B) temperature; (C) time; (D) alcohol content of liquor; and (E) NaCl conentration added to liquor on the extraction efficiency of volatile compounds
2.1.1 萃取纤维的选择
实验考察了5 种萃取纤维100 mm PDMS（红色）、65 mm PDMS/DVB（蓝色）、75 mm CAR/PDMS（黑色）、85 mm polyacrylate（白色）、50/30 mm DVB/ CAR/PDMS（灰色）对SPME萃取1.3.1节所述目标含硫化合物的结果影响。由图1A可知，75 mm CAR/PDMS（黑色）与50/30 mm DVB/CAR/PDMS（灰色）萃取纤维效果相当，但灰色萃取纤维无法萃取得到4-甲基二苯并噻吩。此外，当选用黑色萃取纤维进行萃取时，目标含硫化合物峰面积较为稳定，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均小于5%。因此，选用75 mm CAR/ PDMS（黑色）萃取纤维作为最优水平进行萃取。
2.1.2 萃取温度的选择
实验考察了6 个萃取温度水平20、30、40、50、60、
70 ℃对SPME萃取1.3.1节所述目标含硫化合物的结果影响。萃取条件如下： 75 μm CAR/PDMS（黑色）萃取头、萃取时间40 min，模拟酒样不经稀释、不加NaCl，其他操作同1.3.2.1节所述。由图1B可知，多数目标含硫化合物峰面积随萃取温度的升高呈下降趋势。因此，选用20 ℃作为最优萃取温度进行萃取，试验RSD值均小于5%。
2.1.3 萃取时间的选择
5 个萃取时间水平40、50、60、70、80 min对SPME萃取1.3.1节所述目标含硫化合物的结果影响，如图1所示。萃取条件如下：75 mm CAR/PDMS（黑色）萃取头、萃取温度20 ℃、模拟酒样不经稀释、不加NaCl，其他操作同1.3.2.1节所述。由图1C可知，多数目标含硫化合物峰面积随萃取时间的延长呈先增后减趋势，在萃取时间为70 min时达到最大。因此，选用70 min作为最优萃取时间进行萃取，实验RSD值均小于5%。
2.1.4 酒样酒精度的选择
实验考察了5 个酒精度水平60°、30°、20°、15°、10°对SPME萃取1.3.1节所述目标含硫化合物的结果影响。萃取条件如下：75 mm CAR/PDMS（黑色）萃取头、萃取温度20 ℃，萃取时间70 min、模拟酒样不加NaCl，其他操作同1.3.2.1节所述。由图1D可知，多数目标含硫化合物峰面积随酒样稀释呈先增后减趋势，在酒样酒精度稀释为15°时达到最大。因此，选用15°作为最优酒样稀释酒精度进行萃取，实验RSD值均小于5%。
2.1.5 酒样加入NaCl质量浓度的选择
4 个酒样加入NaCl质量浓度水平不加NaCl、0.12、0.24 g/mL、加入NaCl至过饱和对SPME萃取1.3.1节所述目标含硫化合物的结果影响如图1E所示。萃取条件如下：萃取纤维为75 μm CAR/PDMS（黑色），萃取温度为20 ℃，萃取时间为70 min，模拟酒样酒精度稀释至15°，其他操作同1.3.2.1节所述。由图1可知，多数目标含硫化合物峰面积随酒样加入NaCl质量浓度的增加呈增大趋势，在酒样加入NaCl质量浓度为过饱和时达到最大。因此，选用加入NaCl至过饱和作为最优酒样加盐质量浓度进行萃取，实验RSD值均小于5%。
2.1.6 SPME最优条件
综上所述，顶空SPME最优萃取条件为75 μm CAR/ PDMS（黑色）萃取头、萃取温度20 ℃、萃取时间70 min、酒样酒精度稀释至15°、加入NaCl至过饱和。
2.2 LLE法的建立
LLE法重点关注二糠基二硫醚、糠硫醇、4-甲基-5-羟乙基噻唑。上述3 种含硫化合物均已在芝麻香型白酒中检测到，分别属于硫醚、硫醇、噻唑类含硫化合物，是白酒中较常见的3 类含硫化合物 [5]，且风味特征为焦香、焙烤香，与芝麻香型白酒风味特征相契合。因此，以这3 种含硫化合物作为重点关注对象进行含硫化合物分析方法的优化。
实验考察了5 个因素（萃取溶剂、萃取pH值、酒样酒精度、酒样加入NaCl质量浓度、平衡时间）对LLE萃取1.3.1.2节所述目标含硫化合物的结果影响。GC-MS分析结果如图2所示，回收率为经LLE后，糠硫醇、二糠基二硫醚、4-甲基-5-羟乙基噻唑在GC-MS上的出峰面积与相同质量浓度标准品直接进样在GC-MS上的出峰面积之比。
图2 萃取溶剂（A）、萃取pH值（B）、酒样酒精度（C）、酒样加入NaCl质量浓度（D）、平衡时间（E）对LLE结果的影响
Fig.2 Effect of LLE parameters: (A) extraction fiber; (B) temperature; (C) time; (D) alcohol content of liquor; (E) NaCl concentration added to liquor on the extraction efficiency of volatile compounds
2.2.1 萃取溶剂的选择
本实验考察了3 种萃取溶剂乙醚、正戊烷、二氯甲烷对LLE萃取1.3.1.2节所述目标含硫化合物的结果影响。由图2A可知，综合考虑3 种含硫化合物，当选用二氯甲烷作为萃取溶剂进行萃取时，虽然糠硫醇回收率低于使用正戊烷时的回收率，但二糠基二硫醚、4-甲基-5-羟乙基噻唑的回收率均较高，RSD值均小于5%。因此，最终选择二氯甲烷作为萃取溶剂进行萃取。
2.2.2 萃取pH值的选择
7 个萃取pH值水平1、3、5、7、9、11、13对LLE萃取1.3.1.2节所述目标含硫化合物的结果影响如图2B所示。萃取条件如下：用配制好的氢氧化钠、盐酸溶液调节模拟酒样的pH值，待模拟酒样稳定后，用二氯甲烷作为萃取溶剂进行萃取，其他操作同1.3.2.2节所述。由图2B可知，3 种目标含硫化合物回收率均随萃取pH值的增大呈先增后减趋势。当pH值为7时，3 种目标含硫化合物的回收率均达到峰值。因此选用pH 7作为最优萃取pH值进行萃取，实验RSD值均小于5%。
2.2.3 酒样酒精度的选择
实验考察了4 个酒精度水平60°、30°、15°、10°对LLE萃取1.3.1.2节所述目标含硫化合物的结果影响。萃取条件如下：用配制好的氢氧化钠、盐酸溶液，将稀释后的模拟酒样pH值调节至7，待模拟酒样稳定后，用二氯甲烷作为萃取溶剂进行萃取，其他操作同1.3.2.2节所述。由图2C可知，二糠基二硫醚、糠硫醇的回收率均随酒样酒精度的稀释呈增加趋势，而4-甲基-5-羟乙基噻唑呈下降趋势。综合考虑3 种含硫化合物，当酒样酒精度为15°时，三者的回收率均较大。因此，选用15°作为最优酒样稀释酒精度进行萃取，上述实验RSD值均小于5%。
2.2.4 酒样加入NaCl质量浓度的选择
4 个酒样加入NaCl质量浓度水平不加NaCl、0.12、0.24 g/mL、加入NaCl至过饱和对LLE萃取1.3.1.2节所述目标含硫化合物的结果影响如图2所示。萃取条件如下：用配制好的氢氧化钠、盐酸溶液，将稀释至15°并加入NaCl的模拟酒样pH值调节至7，待模拟酒样稳定后，用二氯甲烷作为萃取溶剂进行萃取，其他操作同1.3.2.2节所述。由图2D可知，二糠基二硫醚、糠硫醇的回收率均随酒样加入NaCl质量浓度的增加呈下降趋势，而4-甲基-5-羟乙基噻唑呈上升趋势。综合考虑3 种含硫化合物，当不加入NaCl时，三者的回收率均较大。因此，选用不加入NaCl作为最优酒样加入NaCl质量浓度进行萃取。上述试验RSD值均小于5%。
2.2.5 平衡时间的选择
实验考察了4 个平衡时间水平0、12、24、48 h对LLE萃取1.3.1.2节所述目标含硫化合物的结果影响。萃取条件如下：用配制好的氢氧化钠、盐酸溶液，将稀释至15°的模拟酒样pH值调节至7，待模拟酒样稳定后，将其静置平衡一段时间，后用二氯甲烷作为萃取溶剂进行萃取，其他操作同1.3.2.2节所述。由图2E可知，3 种含硫化合物的回收率均随平衡时间的增长呈缓慢上升趋势，当平衡时间达到24 h后，三者的回收率均基本保持不变。因此，选用24 h作为最优平衡时间进行萃取，实验RSD值均小于5%。
2.2.6 LLE最优条件
综上所述，LLE最优萃取条件为萃取溶剂为二氯甲烷，萃取pH值为7，酒样酒精度稀释至15°，不加NaCl，平衡时间为24 h。
2.3 芝麻香型白酒中含硫化合物的分析
2.3.1 SPME分析结果
图3 酒样经顶空SPME法结合GC-MS分析的TIC图
Fig.3 GC-MS TIC of liquor sample extracted by SPME
应用顶空SPME法结合GC-MS分析手段对芝麻香型白酒酒样中的微量成分进行定性分析，总离子流色谱（total ion chromatography，TIC）图如图3所示。36 个芝麻香型白酒酒样经顶空SPME结合GC-MS分析，总共检出178 种挥发性化合物，包括醇类13 种、醛酮类13 种、酸类13 种、酯类71 种、含苯环类40 种、含呋喃环类13 种、内酯类1 种、缩醛类4 种、含氮化合物1 种、含硫化合物9 种。9 种含硫化合物分别为3-甲硫基丙醇、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、3-甲硫基丙酸乙酯、硫代丁酸甲酯、糠基甲基硫醚、硫代呋喃甲酸甲酯、4-甲基二苯并噻吩、苯并噻吩。其中，首次在芝麻香型白酒中检出硫代丁酸甲酯、糠基甲基硫醚、硫代呋喃甲酸甲酯、4-甲基二苯并噻吩、苯并噻吩5 种含硫化合物。除苯并噻吩外，为首次在中国白酒中检出。
2.3.2 LLE分析结果
应用LLE法结合GC-MS分析手段对芝麻香型白酒酒样中的微量成分进行定性分析，TIC如图4所示。36 个芝麻香型白酒酒样经LLE结合GC-MS分析，总共检出239 种挥发性化合物，包括醇类25 种、醛酮类18 种、酸类17 种、酯类83 种、含苯环类39 种、含呋喃环类13 种、内酯类3 种、缩醛类12 种、烃类4 种、含氮化合物12 种、含硫化合物11 种、其他类2 种。检测出的化合
物种类较本实验室郑杨之前的检测结果增加了60 种 [34]。共检出二甲基二硫醚、苯并噻唑、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙酸乙酯、二甲基三硫醚、3-甲硫基丁醛、硫代丁酸甲酯、3-甲硫基丙醇、甲硫基乙酸乙酯、4-甲基二苯并噻吩、甲基硫代磺酸甲酯11 种含硫化合物。其中，首次在芝麻香型白酒中检出3-甲硫基丁醛、硫代丁酸甲酯、4-甲基二苯并噻吩、甲基硫代磺酸甲酯、苯并噻唑5 种含硫化合物。除苯并噻唑外，为首次在中国白酒中检出。
图4 酒样经LLE结合GC-MS分析的TIC图
Fig.4 GC-MS TIC of liquor sample extracted by LLE
2.3.3 含硫化合物结果分析
表1 含硫化合物GC-MS检测结果
Table1 Sulfur-containing compounds identified by GC-MS
注：化合物经NIST 11谱库检索，匹配度均大于80%；RIc.酒样中化合物保留指数计算值；RIs.标准品保留指数计算值；MS.谱库检索；RI.保留指数比对；S.经标准品比对。
应用顶空SPME法、LLE法结合GC-MS分析手段对芝麻香型白酒酒样中的含硫化合物进行定性分析，含硫化合物检测结果如表1所示。36 个芝麻香型白酒酒样经GC-MS分析，共检出14 种含硫化合物。其中，首次在白酒中检出硫代丁酸甲酯、糠基甲基硫醚、硫代呋喃甲酸甲酯、4-甲基二苯并噻吩、3-甲硫基丁醛、甲基硫代磺酸甲酯这6 种含硫化合物；此外首次在芝麻香型白酒中检出苯并噻唑、苯并噻吩；3-甲硫基丙醇、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、3-甲硫基丙酸乙酯、3-甲硫基丙醛、甲硫基乙酸乙酯是文献报道已在芝麻香型白酒中检出的 [29]。本研究在前期工作的基础上进一步增加了白酒中可检测到的含硫化合物数量，建立的方法更适用于白酒中含硫化合物的分析。
新发现的含硫化合物中，硫代丁酸甲酯香气特征为果香、奶酪香，可用于调制水果、奶制品等食用香精。糠基甲基硫醚是一种可食用香料，香气特征为肉香。硫代呋喃甲酸甲酯又称硫代糠酸甲酯，香气特征为奶酪香、洋葱香，硫代糠酸酯类还具有咖啡、坚果香气，可用于调配蔬菜、水果、咖啡、奶制品、肉、海鲜等食用香精 [35]。4-甲基二苯并噻吩是玫瑰香型香料的助剂 [36]。3-甲硫基丁醛一般具有土豆香、肉香，甲基硫代磺酸甲酯是韭菜的特征香气成分 [37]。苯并噻唑具有肉香、坚果香，可用于调配坚果、肉、可可、咖啡等食用香精 [35]。
同时由表1可知，二甲基二硫醚、二甲基三硫醚在芝麻香型白酒中普遍存在，具有洋葱味 [35]。3-甲硫基丙酸乙酯、甲硫基乙酸乙酯具有果香，是瓜果中常见的含硫化合物 [38]。3-甲硫基丙醇俗称菠萝醇，是国家标准GB/T 20824—2007《芝麻香型白酒》规定的芝麻香型白酒特征成分，标准规定芝麻香型白酒中3-甲硫基丙醇含量高度酒不小于0.5 mg/L，低度酒不小于0.4 mg/L。但孙啸涛等 [30]前期研究中在21 个芝麻香型白酒样品中仅有5 个样品检出3-甲硫基丙醇，同时认为从香味特征角度来衡量，3-甲硫基丙醇香气特征为肉香、菜香 [39]，并不具有典型的芝麻香、焙烤香，将其作为芝麻香型白酒特征风味物质是值得商榷的。相关样品结果与本研究结果一致。3-甲硫基丙醛香气特征与3-甲硫基丙醇类似，为肉香、土豆香，常见于多种食品中，如酱油等 [40]。
上述含硫化合物多为食品中天然存在的含硫化合物，且多为可食用香料，其中部分含硫化合物香气特征为咖啡香、坚果香，与芝麻香型白酒香气特征相契合。由此可见，芝麻香型白酒中的含硫化合物对芝麻香型白酒风味形成应当具有一定的贡献。
本研究采用SPME法、LLE法结合GC-MS分析手段着重对芝麻香型白酒中含硫化合物进行定性分析。通过配制模拟酒样对SPME法、LLE法的前处理条件进行优化。在最优条件下对36 个芝麻香型白酒酒样中的微量成分提取分析，共检出14 种含硫化合物。其中，硫代丁酸甲酯、糠基甲基硫醚、硫代呋喃甲酸甲酯、4-甲基二苯并噻吩、3-甲硫基丁醛、甲基硫代磺酸甲酯为首次在白酒中检出；此外，苯并噻唑、苯并噻吩为首次在芝麻香型白酒中检出。
研究表明，该方法适用于提取分析白酒中的含硫化合物，是一种有效的研究白酒中含硫化合物分析方法。含硫化合物具有阈值低的特点，能在极低含量下影响白酒风味的形成。本研究检出的含硫化合物均具有特征香气，常见于食品，多数为常用食用香料。其对芝麻香型白酒风味的贡献值得进一步探究。本研究为探究含硫化合物对芝麻香型白酒风味的贡献，科学解释芝麻香型白酒风味的形成以及优化芝麻香型白酒酿造工艺提供一定的参考依据。此外，可能还有其他阈值和含量都更低的含硫、含氮化合物有待后续研究发现。
参考文献：
[1] 李维青. 漫谈白酒的香型[J]. 科技, 2007(7): 84-86.
[2] 赵章报, 曹广勇, 赵雷光. 试论芝麻香型白酒的发展趋势[J]. 酿酒, 2010, 37(2): 27. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2010.02.013.
[3] 张媛媛, 孙金沅, 张锋国, 等. 扳倒井芝麻香型白酒中含硫风味成分的分析[J]. 中国食品学报, 2012, 12(12): 173-179. DOI:10.16429/ j.1009-7848.2012.12.027.
[4] 徐希望. 鲁酒芝麻香的现状及发展[J]. 酿酒科技, 2012(3): 111-117. DOI:10.13746/j.njkj.2012.03.038.
[5] 孙宝国, 吴继红, 黄明泉, 等. 白酒风味化学研究进展[J]. 中国食品学报, 2015, 15(9): 1-8. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.09.001.
[6] 张锋国. 复粮芝麻香型白酒的勾兑与调味[J]. 酿酒科技, 2008(10): 62-64. DOI:10.13746/j.njkj.2008.10.015.
[7] 张锋国. 复粮芝麻香型白酒的生产[J]. 酿酒, 2009, 36(1): 11-14. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2009.01.005.
[8] 高传强, 朱双良, 信亚伟. 梅兰春芝麻香型白酒中四甲基吡嗪生成途径的初步研究[J]. 酿酒科技, 2015(8): 36-38. DOI:10.13746/ j.njkj.2015015.
[9] 刘玉平, 黄明泉, 郑福平, 等. 中国白酒中挥发性成分研究进展[J].食品科学, 2010, 31(21): 437-441.
[10] 胡国栋, 陆久瑞, 蔡心尧, 等. 芝麻香型白酒特征组分的分析研究[J].酿酒科技, 1994(4): 75-77. DOI:10.16429/j.1009-7848.2014.05.005
[11] ANTALICK G, PERELLO M C, de REVEL G, et al. Development, validation and application of a specific method for the quantitative determination of wine esters by headspace-solidphase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2010, 121(4): 1236-1245. DOI:10.1016/ j.foodchem.2010.01.011.
[12] PEÑA R M, BARCIELA J, HERRERO C. Headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry analysis of volatiles in orujo spirits from a defined geographical origin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(8): 2788-2794. DOI:10.1021/jf073481f.
[13] FANG Yu, QIAN M C. Sensitive quantification of sulfur compounds in wine by headspace solid-phase microextraction technique[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1080(2): 177-185. DOI:10.1016/ j.chroma.2005.05.024.
[14] BOUTOU S, CHATONNET P. Rapid headspace solid-phase microextraction/gas chromatographic/mass spectrometric assay for the quantitative determination of some of the main odorants causing offflavours in wine[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1141(1): 1-9. DOI:10.1016/j.chroma.2006.11.106.
[15] D’AGOSTINO M F, SANZ J, SANZ M L, et al. Optimization of a solid-phase microextraction method for the gas chromatographymass spectrometry analysis of blackberry (Rubus ulmifolius Schott) fruit volatiles[J]. Food Chemistry, 2015, 178: 10-17. DOI:10.1016/ j.foodchem.2015.01.010.
[16] SALA C, MESTRES M, MART´L M P, et al. Headspace solid-phase microextraction analysis of 3-alkyl-2-methoxypyrazines in wines[J]. Journal of Chromatography A, 2002, 953(1): 1-6. DOI:10.1016/S0021-9673(02)00123-1.
[17] ROCHA S, RAMALHEIRA V, BARROS A, et al. Headspace solid phase microextraction (SPME) analysis of flavor compounds in wines, effect of the matrix volatile composition in the relative response factors in a wine model[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(11): 5142-5151. DOI:10.1021/jf010566m.
[18] PENA R M, BARCIELA J, HERRERO C, et al. Optimization of solidphase microextraction methods for GC-MS determination of terpenes in wine[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2005, 85(7): 1227-1234. DOI:10.1002/jsfa.2121.
[19] GAO Wenjun, FAN Wenlai, XU Yan. Characterization of the key odorants in light aroma type Chinese liquor by gas chromatographyolfactometry, quantitative measurements, aroma recombination, and omission studies[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(25): 5796-5804. DOI:10.1021/jf501214c.
[20] FAN Wenlai, XU Yan, ZHANG Yanhong. Characterization of pyrazines in some Chinese liquors and their approximate concentrations[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(24): 9956-9962. DOI:10.1021/jf071357q.
[21] 范文来, 徐岩. 应用液液萃取结合正相色谱技术鉴定汾酒与郎酒挥发性成分(上)[J]. 酿酒科技, 2013(2): 17-26. DOI:10.13746/ j.njkj.2013.02.021.
[22] 范文来, 徐岩. 应用液液萃取结合正相色谱技术鉴定汾酒与郎酒挥发性成分(下)[J]. 酿酒科技, 2013(3): 17-27. DOI:10.13746/ j.njkj.2013.03.049.
[23] ZHU Shukui, LU Xin, JI Keliang, et al. Characterization of flavor compounds in Chinese liquor Moutai by comprehensive twodimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 597(2): 340-348. DOI:10.1016/ j.aca.2007.07.007.
[24] 李贺贺, 柳金龙, 梁金辉, 等. 2种古井贡酒中挥发性成分的研究[J]. 食品科学技术学报, 2016, 34(1): 55-65. DOI:10.3969/ j.issn.2095-6002.2016.01.009.
[25] PINO J A, QUERIS O. Characterization of odor-active compounds in Guava wine[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(9): 4885-4890. DOI:10.1021/jf2011112.
[26] GRACIA-MORENO E, LOPEZ R, FERREIRA V. Determination of 2-, 3-, 4-methylpentanoic and cyclohexanecarboxylic acids in wine: Development of a selective method based on solid phase extraction and gas chromatography-negative chemical ionization mass spectrometry and its application to different wines and alcoholic beverages[J]. Journal of Chromatography A, 2015, 1381: 210-218. DOI:10.1016/ j.chroma.2014.12.074.
[27] ZHOU Qin, QIAN Yanping, QIAN M C. Analysis of volatile phenols in alcoholic beverage by ethylene glycol-polydimethylsiloxane based stir bar sorptive extraction and gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2015, 1390: 22-27. DOI:10.1016/j.chroma.2015.02.064.
[28] FAN Wenlai, SHEN Haiyue, XU Yan. Quantification of volatile compounds in Chinese soy sauce aroma type liquor by stir bar sorptive extraction and gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2011, 91: 1187-1198. DOI:10.1002/jsfa.4294.
[29] 张媛媛, 孙金沅, 张锋国, 等. 芝麻香型白酒中含硫风味组分的分析[J]. 中国食品学报, 2014, 14(5): 218-225. DOI:10.16429/j.1009-7848.2014.05.005.
[30] 孙啸涛, 张锋国, 董蔚, 等. GC-MS/SIM法测定芝麻香白酒中3-甲硫基丙醇[J]. 中国食品学报, 2015, 15(2): 214-222. DOI:10.16429/ j.1009-7848.2015.02.033.
[31] 王柏文, 李贺贺, 张锋国, 等. 应用液-液萃取结合GC-MS与GC-NPD技术对国井芝麻香型白酒中含氮化合物的分析[J]. 食品科学, 2014, 35(10): 126-131. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201410023.
[32] 王柏文, 信春晖, 韩晶晶, 等. 顶空固相微萃取结合GC/NPD技术分析芝麻香白酒中含氮化合物[J]. 中国食品学报, 2015, 15(4): 247-253. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.04.033.
[33] 张媛媛. 芝麻香型白酒中含硫化合物的分析研究[D]. 北京: 北京工商大学, 2014: 54-56.
[34] 郑杨, 赵纪文, 张锋国, 等. 扳倒井芝麻香型白酒香成分分析[J]. 食品科学, 2014, 35(4): 60-65. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201404013.
[35] 刘玉平, 孙宝国. 含硫食用香料的合成及应用[J]. 中国食品添加剂, 2003(6): 82-84; 69. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2003.06.019.
[36] 徐永强, 赵瑞玉, 商红岩, 等. 4-甲基二苯并噻吩的合成与表征[J].石油大学学报(自然科学版), 2003, 27(2): 107-109. DOI:10.3321/ j.issn:1000-5870.2003.02.029.
[37] 徐超, 谭亮, 陈晓辉, 等. GC法同时测定韭菜中3 种硫化物的含量[J].沈阳药科大学学报, 2010, 27(9): 719-723. DOI:10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2010.09.009.
[38] 赵光伟, 徐志红, 孔维虎, 等. 3 个甜瓜品种果实香气成分的HS-SPEM/GC-MS比较分析[J].果树学报, 2015, 32(2): 259-266. DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.20140220.
[39] 刘玉平, 孙宝国, 郑福平, 等. 3-甲硫基-1-丙醇的合成研究[J]. 香料香精化妆品, 2004(6): 1-2.
[40] 赵谋明, 蔡宇, 冯云子, 等. HS-SPME-GC-MS/O联用分析酱油中的香气活性化合物[J]. 现代食品科技, 2014, 30(11): 204-212. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.11.036.
Analysis of Sulfur-Containing Compounds in Sesame-flavor Chinese Liquor by Solid Phase Microextraction and Liquid-Liquid Extraction Coupled with GC-MS
ZHAO Dongrui
1, ZHANG Limo
1, ZHANG Fengguo
3, SUN Jinyuan
1,2,*, SUN Xiaotao
1,2HUANG Mingquan
1,2, ZHENG Fuping
1,2, SUN Baoguo
1,2
(1. Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 3. Technology Center of Guojing Co. Ltd., Gaoqing 256300, China)
Abstract：The sulfur-containing compounds of sesame-favor Chinese liquor were analyzed by solid phase microextraction (SPME) and liquid-liquid extraction (LLE) coupled with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Using a simulated liquor sample, the optimum experimental conditions were determined. A total of 178 volatiles were identified by SPME combined with GC-MS and 239 volatiles by LLE combined with GC-MS. Among them, 14 sulfur-containing compounds were identified by comparing mass spectra and linear retention indices (RI) of those of standards in 36 sesame-flavor Chinese liquor samples. S-Methyl ester butanethioic acid, 2-[(methylthio)methyl]-furan, S-methyl ester 2-furancarbothioic acid, 4-methyl-dibenzothiophene, 3-methylthiobutyraldehyde, and S-methyl methanethiosulphonate were detected in Chinese liquor for the frst time; In addition, benzothiazole and benzo [b] thiophene were detected in sesamefavor Chinese Baijiu for the frst time.
Key words：solid phase microextraction; liquid-liquid extraction; gas chromatography-mass spectrometry; sesame-favor Chinese liquor; sulfur-containing compound
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201622014
中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）22-0099-08
引文格式：
赵东瑞, 张丽末, 张锋国, 等. 固相微萃取、液液萃取结合气相色谱-质谱法分析芝麻香型白酒中的含硫化合物[J]. 食品科学, 2016, 37(22): 99-106. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622014. http://www.spkx.net.cn
ZHAO Dongrui, ZHANG Limo, ZHANG Fengguo, et al. Analysis of sulfur-containing compounds in sesame-flavor chinese liquor by solid phase microextraction and liquid-liquid extraction coupled with GC-MS[J]. Food Science, 2016, 37(22): 99-106. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622014. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-04-08
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31301466）；北京市教委科技计划重点项目（KZ201410011015）
作者简介：赵东瑞（1991—），男，硕士研究生，研究方向为白酒风味化学。E-mail：zdrui6789@sina.com
*通信作者：孙金沅（1983—），女，助理研究员，硕士，研究方向为白酒风味化学。E-mail：sunjinyuan@btbu.edu.cn