实时荧光环介导等温扩增快速检测鸡肉中沙门氏菌

（江西农业大学食品科学与工程学院，南昌市农产品加工与质量控制重点实验室，江西南昌 330045）

摘要：：根据沙门氏菌invA基因序列设计特异性引物，利用Midori Green新型核酸荧光染料，建立了沙门氏菌实时荧光定量环介导等温扩增检测方法。结果表明，检测过程仅需45 min，灵敏度达6 CFU/管，而且细菌数量对数值（lg（CFU/管））与扩增荧光指数增加时间（T p值）具有良好正相关线性关系，R 2为0.985 1。通过模拟沙门氏菌人工污染25 g鸡肉样品，经37 ℃保温4 h，提取样品制备DNA模板用于实时荧光定量环介导等温扩增检测，结果表明灵敏度达450 CFU/g，共需时约7 h。随机从市场购买冷冻鸡肉样品21 份，采用国标沙门氏菌检测方法和鸡肉样品实时荧光定量环介导等温扩增检测进行对比检测，结果两种方法均检测出同一份样品为沙门氏菌阳性，其余20 份样品均为沙门氏菌阴性，表明本研究建立的鸡肉沙门氏菌实时荧光定量环介导等温扩增检测，其灵敏性和准确性与国标检测方法相当，但检测时间可缩短至7 h。

关键词：沙门氏菌；鸡肉；实时荧光定量环介导等温扩增；检测

病原微生物污染食物是影响食品安全的主要问题之一，在过去的数十年中食物中毒事件的爆发大多与食品中致病菌的存在有关。当前，无论在发达国家还是在发展中国家，食源性疾病都尚未得到有效控制 [1]。沙门氏菌是肠杆菌科重要的人畜共患病原菌之一，自1880年Eberth首先发现伤寒沙门氏菌和1885年Salmon等分离获得猪霍乱沙门氏菌，迄今已发现2 500多个血清型及其变种 [2-3]。沙门氏菌可分离于多种食物，但鸡肉、牛肉和猪肉及其加工产品等肉类食品是其主要污染对象 [4-6]，这些食物的分布极为广泛，导致在沙门氏菌食源性疾病暴发流行期间，人们很难对它们进行调查和溯源。因此，如何快速地检测食品尤其是肉类食品中的沙门氏菌，防止被污染了的食品进入市场，是有效防控沙门氏菌食源性疾病暴发的前提条件。

然而食品中沙门氏菌一般采用国标检测方法（细菌培养）进行检测，该方法操作繁琐，耗时费力，整个实验过程需要2～3 个工作日，甚至更长时间 [7]。目前，从肉类等食品中快速、准确、灵敏地检测沙门氏菌仍然是一个巨大的挑战。环介导等温扩增检测法自2000年日本科学家Notomi发明报道后，因其可在等温条件下数十分钟内完成核酸的高倍扩增 [8]，从而成为继聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术之后又一新型更快速简便的检测技术，目前各国研究人员在此基础上发展出了多种病原菌的环介导等温扩增检测法检测方法 [9-12]。Midori Green是一种新型的核酸荧光染料，具有敏感性高、毒性低、安全性好的优点，而将该染料应用于实时荧光定量环介导等温扩增检测法还鲜见报道 [13]。本研究应用Midori Green核酸染料，建立沙门氏菌实时荧光定量环介导等温扩增检测技术并运用于鸡肉样品沙门氏菌的检测，旨在建立一种快速、灵敏、准确的鸡肉样品沙门氏菌的检测技术。

1 材料与方法

沙门氏菌ATCC BAA-708菌株为本实验室保存，鸡脯肉样品为当地市场购买。

亚硒酸盐胱氨酸增菌液、亚硫酸铋琼脂、沙门氏菌显色培养基青岛高科园海博科技有限公司；胰蛋白酶大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）美国Difco公司；BstDNA polymerse 新西兰Biolabs公司；Midori Green、dNTPs 美国Bulldog Bio公司；2×Taq Master Mix上海欣百诺生物科技有限公司；Whirl-Pak均质过滤袋美国Nasco公司；八连管美国Bio-Rad公司。

35172 BRUZ拍击式均质机法国AES Chemuex公司；WFZ-UV-2100紫外-可见分光光度计尤尼科（上海）仪器有限公司；GL-21M高速冷冻离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；XB-150B全自动雪花制冰机宁波新艺超声设备有限公司；凝胶成像系统法国Vibler Lourmat公司；EPS300电泳仪、VE-180电泳槽上海天能科技有限公司；CFX Connect Real-time System荧光PCR仪美国Bio-Rad公司。

针对沙门氏菌invA基因，参考Hara-Kubo等 [14]设计了6条特异性引物用于实时荧光定量环介导等温扩增检测，包括两条内引物（FIP/BIP），两条外引物（F3/B3），两条环引物（Loop F/Loop B），详见表1。引物由北京鼎国生物技术有限公司合成。

表1 环介导等温扩增引物
Table 1 Primers used in the Rti-LAMP

将活化的沙门氏菌接种于3 mL TSB液体培养基中，37 ℃、150 r/min过夜培养16～18 h，以2%沙门氏菌菌液量转接于10 mL TSB液体培养基，37 ℃、150 r/min培养2 h左右至对数期细菌（OD 600 nm≈0.5）。将菌液用灭菌的生理盐水按10倍梯度依次稀释，取100 μL涂于平板，培养18～24 h细菌计数，测定OD 600 nm值，建立OD 600 nm值与菌浓度的标准曲线。

细菌总DNA制备，生理盐水稀释的细菌50 μL加入50 μL 2×TZ裂解液 [15]，于99.5 ℃加热10 min，冰上冷却后高速离心5 min，取上清即为细菌DNA模板。

实时荧光定量环介导等温扩增反应体系总体积为25 μL：2.5 μL 10×buffer，5 μL 25 mmol/L MgCl 2，2.5 μL 12.5 mmol/L dNTPs，2 μL 20 mmol/L FIP，2 μL 20 mmol/L BIP，0.4μL 20 mmol/L F3，0.4 μL 20 mmol/L B3，1.2μL 20 mmol/L Loop F，1.2μL 20 mmol/L Loop B，1 μL 1∶500稀释的荧光染料Midori Green，0.9 μL Bst聚合酶，2 μL DNA模板，无菌去离子水补足至25 μL。制备好的反应管放入Bio-Rad CFX Connect Real-time System内65 ℃扩增反应60 min。每分钟读取荧光数值，设定样品荧光值出现指数增加的时间为T p值（类似于实时-PCR的Ct值） [16-17]，测定T p值与细菌浓度之间关系函数。

实时荧光定量环介导等温扩增产物上样于2%琼脂糖凝胶，将1 μL的Midori Green原液加入到20 mL琼脂糖凝胶后进行电泳。电泳条件为电压80 V、电流60 mA、时间35 min，取出置于凝胶成像系统拍照观察。

取25 g经国标检测沙门氏菌阴性的鸡肉样品，置于装有75 mL磷酸缓冲液（50 mmol/L）的Whirl-Pak均质过滤袋中，加入生理盐水稀释至适宜浓度的沙门氏菌0.5 mL，以制备含沙门氏菌浓度为0、130、450、1 300、4 500、13 000、45 000 CFU/g的人工模拟污染样品，将均质袋置于均质机中，37 ℃拍打1 min，随后放入37 ℃的水浴锅中水浴预增菌4 h。

样品过滤液转移至离心杯中，在800 r/min离心5 min，上清液通过含0.5 g玻璃棉的灭菌注射器，过滤液于10 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀重悬于0.5 mL生理盐水，加入等体积2×TZ裂解液，混匀后于99.5 ℃加热10 min，冰浴2 min后12 000 r/min离心10 min，上清液即为样品DNA模板，取2 μL作为实时荧光定量环介导等温扩增反应模板。

从市场上购买21 份冷冻鸡肉样品，利用上述鸡肉样品实时荧光定量环介导等温扩增方法检测沙门氏菌，同时用国标法（GB 4789.4—2010《食品微生物学检验沙门氏菌检验》）进行对比检测分析 [18]。

2 结果与分析

根据环介导等温扩增检测原理，应用Midori Green新型核酸荧光染料，以沙门氏菌细菌裂解液为模板，通过沙门氏菌invA基因6 条特异性引物进行实时荧光定量环介导等温扩增反应，结果表明沙门氏菌阳性样品在30 min之内可以出现荧光值呈指数增加，而阴性样品荧光值则没有指数增加现象，经优化反应体系后建立了沙门氏菌实时荧光定量环介导等温扩增检测方法。为考察实时荧光定量环介导等温扩增的检测灵敏度，设置了2、6、20、60、200、600 CFU/管共6 个不同梯度的菌数，0 CFU为不加目标菌的空白对照，结果表明沙门氏菌6 CFU/管可稳定扩增，荧光值呈指数增加，而2 CFU/管3 次反应中仅有1 次荧光值呈指数增加，因而该实时荧光定量环介导等温扩增的检测灵敏度为6 CFU/管（图1）。设定荧光值500作为衡量各反应荧光指数增加出现时间（T p值）的标准，结果表明在6～600 CFU/管各梯度之间与其相应T p值具有线性关系，以T p值为纵坐标，lg（CFU/管）为横坐标，其回归方程为Y=－2.24X＋25.73，决定系数R 2为0.985 1，表明通过实时荧光定量环介导等温扩增的T p时间可定量检测沙门氏菌（图1）。环介导等温扩增产物是一系列大小不一的DNA片段混合物，在电泳图上呈现出规律的梯状条带，其基本单元片段大小约180 bp。如图2所示，实时荧光定量环介导等温扩增对沙门氏菌基因扩增产物经电泳后呈环介导等温扩增特有的阶梯状条带，DNA条带最小单元片段长度符合预扩增基因片段大小，说明本研究建立的实时荧光定量环介导等温扩增沙门氏菌的特异性好。

图1 实时荧光定量环介导等温扩增沙门氏菌荧光曲线（a）及T p值与细菌数量对数的线性函数（bb）
Fig. 1 Typical RT-LAMP plots and linear detection plot of S. enterica derived from various numbers of lg phase S. enterica cells from pure culture

图2 实时荧光定量环介导等温扩增沙门氏菌DNA电泳图
Fig. 2 Detection of amplicons derived from RT-LAMP reactions by agarose gel electrophoresis

2.2 实时荧光定量环介导等温扩增检测法对模拟沙门氏菌污染鸡肉样品检测

图3 实时荧光定量环介导等温扩增人工模拟沙门氏菌污染鸡肉样品荧光曲线（a）及aT p值与lg（CFU/g）的线性函数（b）b
Fig. 3 Typical RT-LAMP quanti☒cation curves and linear detection plot of S. enterica derived from chicken inoculated with various numbers of Salmonella

图4 鸡肉样品实时荧光定量环介导等温扩增沙门氏菌DNA电泳图
Fig. 4 Detection of amplicons derived from RT-LAMP reactions for chicken samples by agarose gel electrophoresis

为提高实时荧光定量环介导等温扩增检测鸡肉样品的准确性和灵敏度，同时整个检测时间能在一个工作日内完成，本研究人工模拟沙门氏菌污染鸡肉样品经37 ℃预增菌4 h，然后提取样品细菌总DNA进行扩增检测。实验共设置了130、450、1 300、4 500、13 000、45 000 CFU/g共6组不同梯度进行实时荧光定量环介导等温扩增检测。实验结果表明，实时荧光定量环介导等温扩增检测130 CFU/g的鸡肉样品，3 次重复检测实验出现了2 次阳性结果和1 次阴性结果，但450 CFU/g及以上浓度的鸡肉样品3次重复检测结果均为阳性。因此，本研究建立的实时荧光定量环介导等温扩增检测鸡肉样品灵敏度为450 CFU/g，整个检测时间约为7 h。从图3可知，将450～45 000 CFU/g各个沙门氏菌常浓度对数值与其相应T p值进行线性回归分析，以T p值为纵坐标，lg（CFU/g）为横坐标，其函数方程为Y=－3.89X＋45.39，决定系数R 2为0.989 1，表明通过该实时荧光定量环介导等温扩增的T p值可定量检测分析鸡肉样品中沙门氏菌的污染浓度。如图4所示，实时荧光定量环介导等温扩增对人工模拟沙门氏菌污染鸡肉样品扩增产物电泳后扩增DNA条带与纯沙门氏菌实时荧光定量环介导等温扩增电泳条带完全一致，进一步表明实时荧光定量环介导等温扩增检测模拟沙门氏菌污染鸡肉样品扩增基因的特异性。

2.3 实时荧光定量环介导等温扩增检测法对市场鸡肉样品的检测

应用上述鸡肉样品沙门氏菌实时荧光定量环介导等温扩增检测方法和国标检测法，同时检测市场上购买的21份冷冻鸡肉样品，结果见表2。结果表明，两种方法都检测到1份沙门氏菌阳性样品，且为同一份鸡肉样品；另外20份样品中，国标法与实时荧光定量环介导等温扩增均为阴性结果。因此，本研究建立的鸡肉样品沙门氏菌实时荧光定量环介导等温扩增检测法与国标法检测市场鸡肉样品中沙门氏菌具有相似的灵敏度，但实时荧光定量环介导等温扩增检测法将国标法检测时间的4～5 d缩短至7h，减轻了劳动强度，提高了检测效率。

表2 两种方法对比检测市售鸡肉样品沙门氏菌污染结果
Table 2 Comparison of results of detection of chicken samples for Salmonneellllaa by two different methods

注：两种方法检出的为同一阳性市场鸡肉样品。

图5 实时荧光定量环介导等温扩增检测市售鸡肉样品
Fig. 5 RT-LAMP quanti cation curves for detection of S. enterica derived from chicken samples

此外，实时荧光定量环介导等温扩增检测市场鸡肉样品的T p值为34 min，根据上述鸡肉样品沙门氏菌回归方程Y=－3.89X＋45.39，理论上推算该鸡肉样品中污染的沙门氏菌数为847 CFU/g；另一份鸡肉样品的T p值为55 min，超出了本实验建立的实时荧光定量环介导等温扩增检测灵敏度范围，虽然该样品在55 min出现了扩增荧光值增加并超过了500，但超过了该方法检测敏感性，因此仍判定为沙门氏菌阴性样品（图5）。

3 讨论

沙门氏菌是全球范围内最重要的几种食源性致病菌之一，其发病率在细菌性食源性疾病中所占比例最大，给人类卫生保健系统造成了沉重的经济负担。快速检测技术是监测和防控沙门氏菌食源性疾病最重要的环节之一，而衡量快速检测技术性能最关键指标是检测所需时间与灵敏度。目前实时荧光定量环介导等温扩增已经运用到多种食品病原微生物的检测中，其敏感、快速、简便的优点备受关注。李月华等 [19]运用实时荧光环介导等温扩增技术检测原料乳中志贺氏菌，其对纯菌菌悬液及人工污染样品的检测灵敏度均达到了100 CFU/mL；陈文秀等 [20]将实时荧光环介导等温扩增技术应用于检测乳粉中的肺炎克雷伯氏菌，检测纯菌和人工污染乳粉的检出限均达到了79 CFU/g，并呈现出了100%的特异性。贾雅菁等 [21]报道了运用实时荧光环介导等温扩增技术检测牛乳中蜡样芽孢杆菌，20 min左右即可检测出牛乳中8.2 CFU/mL的蜡样芽孢杆菌；Wu等 [22]利用实时荧光定量环介导等温扩增检测法对生菜中沙门氏菌进行检测，灵敏度达到了4 CFU/g，全过程3 h左右完成；庞心怡等 [2]报道利用环介导等温扩增技术快速检测肉中沙门氏菌，对人工污染的沙门氏菌肉样检测限达98 CFU/mL，全程用时15 h。在Hara-Kudo等 [14]对沙门氏菌环介导等温扩增检测法进行过特异性验证的基础上，本实验结合Midori Green新型核酸染料，建立的实时荧光定量环介导等温扩增检测沙门氏菌纯培养菌液灵敏度达6 CFU/管，人工模拟感染鸡肉中沙门氏菌检测灵敏度达450 CFU/g，全过程用时约7 h，实现了一个工作日完成检测，且具有检测可定量的优点，为鸡肉等肉制品中的沙门氏菌快速检测筛选提供了一种新的方法。

许多研究表明，食品中存在多种水溶性DNA聚合酶抑制剂，同时肉类食品所含有的脂肪，会干扰细菌提取时进入水相从而降低细菌回收量，影响PCR等分子生物学技术直接检测食品中致病菌的灵敏性，因此目前大多快速检测技术都需要增加预增菌环节，拖延了检测的时间 [ 23-25]。如何去除肉制品中DNA聚合酶抑制剂、消除脂肪影响，实现非预增菌快速灵敏检测食品中致病菌有待进一步深入研究。

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Development and Application of a Real-Time Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Salmonella enterica ser. Enteritis Retrieved from Chicken

WANG Jin, LIN Liping, GAO Yanyan, WU Guoping *
(Key Laboratory for Agricultural Products Processing and Quality Control of Nanchang City, School of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

Abstract：In this study, a real-time loop-mediated isothermal amplifi cation (Rti-LAMP) assay system was developed for the rapid detection of Salmonella enterica in chicken. It showed that the lowest level of 6 CFU/reaction for pure Salmonella culture could be detected in 45 minutes by the Rti-LAMP targeting the invA gene using Midori Green as nucleic acid dye. Furthermore, 25 g of chicken was artifi cially with various numbers (CFU) of Salmonella, followed by enrichment culture at 37 ℃ for 4 h and then fi ltration through Whirl-Pak bag and the bacterial cells were pelleted by centrifugation at 13 000 g. The resulting pellets were suspended in saline and processed for cell lysis and DNA purifi cation. Finally, 2 μL of purifi ed DNA sample was incorporated into 25 μL of Rti-LAMP reactions at 65 ℃ for 60 min. The lowest level of 450 CFU/g of Salmonella was consistently detected by the Rti-LAMP assay. The entire assay could be completed in 7 h. A total of 21 chicken samples purchased from local market were detected by the Rti-LAMP assay using Salmonella culture as positive control. The same one sample was detected positive to Salmonella by the Rti-LAMP assay and the method described in the Chinese national standard. It suggested that the sensitivity and accuracy of the Rti-LAMP assay were comparable to those of the national standard method, and the former took only 7 h, which was highly time-saving compared with the latter.

Key words：Salmonella enterica ser. Enteritidis; chicken; real-time loop-mediated amplifi cation; detection

王瑾, 林丽萍, 郜彦彦, 等. 实时荧光环介导等温扩增快速检测鸡肉中沙门氏菌[J]. 食品科学, 2016, 37(24): 170-174. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624026. http://www.spkx.net.cn

WANG Jin, LIN Liping, GAO Yanyan, et al. Development and application of a real-time loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Salmonella enterica ser. Enteritis retrieved from chicken[J]. Food Science, 2016, 37(24): 170-174. (in Chinese with English abstract)

基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31560480）；江西省教育厅科技计划项目（GJJ150379）

作者简介：王瑾（1992—），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物检测。E-mail：jw15270959970@163.com

*通信作者：吴国平（1972—），男，副教授，博士，研究方向为食品微生物检测和生物技术。E-mail：jdwgp@163.com

实时荧光环介导等温扩增快速检测鸡肉中沙门氏菌

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨 论

3 讨论