三元超分子荧光增敏快速检测黄曲霉毒素M 1

马 良,张宇昊,江 涛,苏 敏,涂春蓉

(西南大学食品科学学院,重庆 400715)

摘 要::根据黄曲霉毒素M 1(afl atoxin M 1,AFM 1)的荧光特性,研究β-环糊精(β-cyclodextrin,β-CD)及其衍生物(β-CDs)、金属盐(Hg 2+)与AFM 1形成的三元超分子体系及对AFM 1荧光增强作用,并探索超分子包合物形成的机理。甲基-β-CD-Hg 2+-AFM 1三元体系中,当溶剂组成为体积分数20%甲醇溶液,Hg 2+、M-β-CD与AFM 1物质的量比分别为6.6×10 4∶1、5.80×10 5∶1时,荧光增强倍数可达到4.5 倍。光谱法、热力学方法表明AFM 1能进入M-β-CD空腔,从而减少荧光淬灭,增强荧光检测的灵敏度。利用Benesi-Hildebrand双倒数法和Van’t Hoff热力学方程研究超分子体系的包合常数与热力学常数,初步探讨超分子反应机理。该荧光增敏技术检测AFM 1,在0.01~2.00 µg/L范围内分析线性良好,相关系数R 2为0.999 2,检出限为0.002 6 μg/L。这种衍生方法具有灵敏、简单、高效、经济等优点,乳品中除铁元素以外的大多数强化微量元素对测定无干扰作用,可应用于奶制品中AFM 1的快速检测。

关键词:黄曲霉毒素M 1;超分子体系;荧光增强;快速检测;包合

黄曲霉毒素M 1(afl atoxin M 1,AFM 1)是哺乳动物摄入黄曲霉毒素B 1(aflatoxin B 1,AFB 1)污染的食物后,经肝脏细胞色素P450等相关酶代谢,发生Ⅱ相反应形成的羟基化代谢产物 [1],毒性仅次于AFB 1。1993年,AFM 1被世界卫生组织和国际癌症研究机构列为2B类致癌物质,2002年被提至Ⅰ类致癌物,严重威胁人体健康 [2]。AFM 1对食物的污染主要存在于乳及其乳制品中,而人类尤其是婴幼儿对乳制品的接触率极高,危害极大,因此世界各国对AFM 1的限量标准一直非常严格。国际食品法典委员会国际标准规定牛奶中AFM 1限量为0.5 μg/kg [3],我国规定乳及乳制品中AFM 1限量标准为0.5 μg/kg [4],欧盟制定的标准更为严格,乳及乳制品中限量为0.05 μg/kg,婴幼儿配方奶限量为0.025 μg/kg [5]。为保障乳品安全,急需发展高准确度、高灵敏度、简便快捷的AFM 1检测技术。

目前检测AFM 1的方法主要有高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法 [6-13]、HPLC-串联质谱(HPLC-tandam mass spectrometry,HPLC-MS/MS)法 [6,8,11]、酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorlent assay,ELISA)法 [9,14-15]、荧光分光光度(fluorescence spectrophotometer,FL)法 [4,6]、便携型荧光计 [16]等。色谱技术灵敏度高,定量精确,可同时分离多种黄曲霉毒素,适用于大批量样品分析,是国内外针对黄曲霉毒素检测最常用的方法 [7-8],但仪器价格昂贵,前处理较复杂,需专业人员操作,而且大多数衍生物易挥发,对人体和自然危害较大。ELISA技术灵敏度高,特异性强,实验操作污染少,可用于现场检测,目前它已成为应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术,但是存在检测结果重复性差、酶稳定性差、试剂寿命短、存在假阳性等缺陷 [9,15]。荧光增强技术具有操作简单、快捷、标准品用量少,短时间内可完成大批量检测等优势 [4,12,17-20]。本实验利用荧光分光光度法对β-环糊精(β-cyclodextrin,β-CD)及其衍生物(β-CDs)与金属离子共同作用AFM 1形成的三元超分子包合物的荧光强度以及变化进行测定,并对其影响因素和作用机理进行分析,为建立快速灵敏、准确稳定的乳制品AFM 1检测技术提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

AFM 1标准品 美国Sigma公司;甲醇、乙腈(均为色谱纯) 天津四友精细化学品有限公司;β-CD、甲基-β-CD(methyl-β-cyclodextrin,M-β-CD)、羟丙基-β-CD(hydroxypropyl-β-cyclodextrin,HP-β-CD)、羟乙基-β-CD(hydroxyethyl-β-cyclodextrin,HE-β-CD)、磺丁基-β-CD(sulfobutyl-ether-β-cyclodextrin,SBE-β-CD)、羧甲基-β-CD(carboxymethyl-β-cyclodextrin,CM-β-CD)、聚合-β-CD(β-cyclodextrin polymer,β-CDP)(均为分析纯) 山东智源生物科技有限公司;氯化汞(分析纯) 贵州铜仁汞试剂公司;氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化铁、KI(均为分析纯) 成都市科龙化工有限公司。

1.2 仪器与设备

F-2500荧光分光光度仪 日本日立公司;分析天平(精度0.000 1 g) 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂;Milli-QA10 System超纯水发生器 法国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 AFM 1溶液的配制

将1 mg AFM 1用1 mL乙腈溶解,配制成质量浓度为10 6µg/L的AFM 1溶液,再取10 µL 10 6µg/L AFM 1溶液,加甲醇到1 mL,配成10 4µg/L的标准储备液,密封后于4 ℃条件下避光保存。使用时,准确移取100 µL标准储备液于25 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成质量浓度为40 µg/L的标准工作液。

1.3.2 荧光光谱扫描

取1 mL AFM 1标准工作液,用1.0 cm荧光石英比色皿放置在荧光分光光度计中进行荧光发射光谱、激发光谱的扫描(激发光源为150 W氙弧灯,响应时间自动,扫描速率1 500 nm/min,扫描光谱进行仪器自动校正),狭缝均置为5 nm。固定365 nm波长,扫描样液的荧光发射光谱;固定410 nm波长,扫描样液的最佳激发光谱。

1.3.3 荧光值测定

根据1.3.2节的结果固定最佳激发波长和最佳发射波长,狭缝宽均为5 nm,取1 mL标准工作液,用1.0 cm荧光比色皿测定荧光值。

1.3.4 β-CDs对AFM 1-Hg 2+-β-CDs体系荧光值的影响

按1.3.3节的方法先测体积分数50%甲醇溶液条件下0.004 mol/L β-CDs的荧光本底值。再取500 μL 4 µg/L AFM 1溶液,加入100 μL 0.01 mol/L HgCl 2溶液和400 μL 0.01 mol/L β-CDs溶液,混匀,放置1 min,按1.3.3节方法测其荧光值。

1.3.5 反应物质的量对体系荧光值的影响

取50 µL 40 µg/L AFM 1溶液,固定0.01 mol/L HgCl 2溶液用量,再分别加入100、200、300、350、400、450、500、600 µL 0.01 mol/L的M-β-CD溶液;得出M-β-CD最佳体积。利用最佳体积,加入10、20、30、40、50、60、70 µL 0.01 mol/L的HgCl 2溶液,得出最佳HgCl 2体积。

1.3.6 甲醇比例对体系荧光值的影响

取6 支试管,均加入50 µL 40 µg/L AFM 1溶液、40 µL 0.01mol/L HgCl 2溶液,混匀后加入350 µL 0.01 mol/L β-CDs溶液,再依次加入0、50、150、250、350、450 µL甲醇溶液,混匀,再依次补加水到1 mL,采用1.3.3节方法测其荧光值。

1.3.7 AFM 1-M-β-CD的包合常数测定

取50 μL 40 μg/L AFM 1标准工作液于13 只试管中,分别加入10、15、20、30、40、60、80、100、200、300、500、700、900 μL 0.01 mol/L的M-β-CD溶液,混匀后加水至1 mL,按照1.3.3节方法,分别测定荧光值F。另取50 μL 40 μg/L AFM 1标准工作液于1 支试管中,加入950 μL水,混匀后测定荧光值F 0。以1/(F-F 0)对1/(M-β-CD)作双倒数图,当出现一条线性关系良好的直线,说明是形成了1∶1包合物,直线的截距与斜率之比即为包合物的包合常数K [19]

1.3.8 KI荧光淬灭实验

取50 μL 40 μg/L AFM 1溶液于1、2两组试管中(每组6 只试管)。第1组均加入850 μL水,第2组中均加入850 μL 0.01mol/L M-β-CD溶液,混匀后,于2 组试管中分别加入10、20、40、60、80、100 μL 1 mol/L KI溶液,再加水至1 mL,采用1.3.3节方法测定荧光值,以加入淬灭剂前后的荧光值之比F 0/F对猝灭剂KI浓度作图。

1.3.9 共存离子对体系荧光的影响

取50 µL 40 μg/L AFM 1溶液于10 支试管中,试管中依次加入50、100 µL 0.01 mol/L NaCl、KCl、CaCl 2、MgCl 2溶液,50、100 µL 0.001 mol/L FeCl 3溶液,混匀后均加入350 µL 0.01 mol/L M-β-CD溶液,再加入150 µL甲醇溶液,最后加水到1 mL,混匀后按1.3.3节方法测各样品荧光值。

1.3.10 AFM 1以及加入Hg 2+-M-β-CD后体系的线性关系

取8 支试管,用AFM 1标准工作液配成质量浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 µg/L的AFM 1溶液,测其标准曲线;用移液枪移取0、1、5、10、20、50、100、200 µL 10 µg/L AFM 1标准工作液于试管中,分别加入40 µL 0.01 mol/L HgCl 2溶液和350 µL 0.01 mol/L M-β-CD溶液,再分别加入200、199、195、190、180、150、100、0 µL甲醇溶液,分别加水至1 mL,配制成0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 µg/L的AFM 1-HgCl 2-M-β-CD标准系列溶液,用荧光分光光度计测其标曲曲线。

2 结果与分析

2.1 AFM 1快速荧光分析的最佳波长

图1 AFM 1激发光谱和发射光谱
Fig. 1 Excitation spectrum and emission spectrum of AFM 1

如图1所示,最佳激发波长和发射波长分别为365 nm和410 nm,在该激发波长和发射波长条件下,可以对AFM 1的荧光增强作用和快速检测条件进行考察。

2.2 AFM 1-Hg 2+-β-CDs三元超分子体系增强荧光的影响因素

2.2.1 不同β-CD对体系荧光值的影响

图2 不同β-CDD对AAFFMM 1三元超分子体系的影响
Fig. 2 Effect of different β-CDs on fluorescence ternary systems containing AFM 1

由图2可看出,不同β-CD对AFM 1-Hg 2+-β-CDs体系的荧光增强效果不同。CM-β-CD和聚合-β-CD(β-CDP)荧光本底值较高,另外5 种CD体系的荧光值虽然相差不大,但是具有极显著差异(P<0.01)。考虑到要满足荧光本底值低,体系荧光强度高的要求,选用M-β-CD作为该体系的荧光增强剂,且M-β-CD具有在水中的溶解度高、低吸湿性和高表面活性等特性,适用于配制快速检测试剂。

2.2.2 反应物质的量比对体系荧光值的影响

图3 M-β-CDD与AAFFMM 1(A)和HHggCCll 2与AAFFMM 1(B)物质的量比对体系荧光值的影响
Fig. 3 Effect of molar ratio of M-β-CD to AFM 1(A) and HgCl 2to AFM 1(B) on fluorescence intensity of ternary systems

AFM 1体系的荧光强度分别随M-β-CD、HgCl 2量的增加而增加,如图3A、B所示。M-β-CD、HgCl 2与AFM 1的物质的量比分别为5.80×10 5∶1、6.60×10 4∶1时,三元体系的荧光值显著增大且达到最大且趋于稳定。在该过程中由于包合反应是可逆反应,体系中反应物浓度高有利于化学反应快速完成;但考虑对环境影响和节省试剂,要尽量减少HgCl 2用量。

2.2.3 甲醇溶液体积分数对体系荧光值的影响

图4 不同体积分数甲醇溶液对体系荧光值的影响
Fig. 4 Effect of methanol concentration on fluorescence intensity of ternary systems containing AFM 1

AFM 1水中溶解度极低且在极性环境中易发生荧光淬灭。β-CDs易溶于水,可以增加AFM 1在水相中的溶解度,同时也可以保护AFM 1的荧光不被淬灭。实验过程中选择合适的甲醇、水比例,可达到更好的荧光增强效果。由图4可知,甲醇体积分数为20%时,荧光增强幅度最大,且反应快速(6 min左右平衡),所以选择体积分数20%甲醇溶液比例作为三元体系的最佳比例。

2.3 AFM 1-Hg 2+-M-β-CD体系的荧光特性

图5 体系的发射光谱(A)和激发光谱(B)
Fig. 5 Excitation spectrums (A) and emission spectrums (B) of fluorescence systems

按照1.3.3节方法,对各体系的荧光光谱进行比较分析,如图5所示。AFM 1被HgCl 2、M-β-CD和HgCl 2-M-β-CD荧光增强后,各体系的最大激发波长和发射波长谱带形状类似,表明形成的体系光谱学特征相似。分析各体系的最佳激发波长没有明显移动,而各体系的最佳发射波长却发生明显红移(由410 nm到420 nm),说明AFM 1与HgCl 2、M-β-CD和HgCl 2-M-β-CD作用后,基态分子结构没有发生变化,而AFM 1与Hg 2+可能产生配合物,AFM 1-HgCl 2作为客体分子被包合在M-β-CD内,从而形成超分子。AFM 1-HgCl 2-M-β-CD三元体系的荧光值最高,其原因和实验室前期对AFB 1和AFG 1的研究结果相似 [19-20],原因可能为:AFM 1在水中的荧光量子产率较低,被M-β-CD包络后,疏水性空腔为AFM 1提供了一个非极性的微环境,减少了分子移动自由度,避免了失活碰撞,也增加了疏水性AFM 1在水中的溶解度,同时保护了AFM 1的荧光单重态,使它的荧光不被溶剂中的淬灭剂淬灭。

2.4 KI荧光淬灭实验

荧光淬灭现象是指一些特殊物质能使产生荧光的物质荧光强度减弱甚至消失,通过对荧光淬灭现象的研究能够获得目标物质中发光基团所处的微环境的有用信息 [21]。KI是阴离子淬灭剂,可以淬灭多种物质的荧光。在动态淬灭过程中,可用Stern-Volmer方程定量(F 0/F[Q]=1+Ksv[Q])测量荧光猝灭强度 [20]。以加入淬灭剂前后的荧光强度比F 0/F对淬灭剂KI浓度作图。

图6 KI对AFM 1及AAFFMM 1--MM--β-CD体系的荧光淬灭
Fig. 6 AFM 1fluorescence quenching by KI in the absence and presence of M-β-CD

KI是带电荷的猝灭剂,它不能进入CD内部的疏水环境,只能猝灭处于极性环境中的分子荧光。如图6所示,当M-β-CD存在时,KI对体系的荧光淬灭强度要比对游离的AFM 1弱一些,说明M-β-CD疏水空腔对AFM 1的荧光具有保护作用,这为AFM 1进入M-β-CD空腔并提高荧光强度提供直接证据。

2.5 包络反应热力学常数的测定

β-CDs和AFM 1在甲醇溶液中的包合是一个平衡过程,当形成1∶1包合时,包合过程为:AFM 1+CD AFM 1-CD。

包合常数K按公式(1)计算:

式中:[CD-AFM 1]、[AFM 1]、[CD]分别表示混合物中包合物、游离的AFM 1以及游离CD浓度/(mol/L)。

当主体CD浓度远大于客体分子G浓度(即[CD]>>[G])时,根据Benesi-Hildebrand方程 [22-23]求得包合常数,表达式为:

式中:F 0和F分别为加入CD前后溶液的荧光强度;κ为常数;[G]和[CD]分别为AFM 1和CD的总浓度/(mol/L);Q为AFM 1的荧光量子产率。

根据公式(1)计算出包合常数K值,再根据范德霍夫方程lnK=-ΔH/RT+ΔS/R,以各温度条件下的lnK对温度的倒数1/T进行线性回归,根据直线的斜率和截距可求得包络物形成过程的热力学参数ΔH及ΔS;再根据热力学定律ΔG=-RTlnK,可求得包合反应的ΔG。本实验中,利用lnK对温度的倒数1/T进行线性回归,结果为lnK=2.516 4x-1.039 2。

表1 不同温度条件下AFM 1--MM--β-CD的包合常数和热力学参数
Table 1 Effect of temperature on K anndd ΔS of the inclusion complex of AAFFMM 1--MM--β--CCDD

?

从表1可看出,随温度的升高,K值逐渐降低,说明包合物的稳定性逐渐降低,表明温度较低对包络反应的进行有利。各温度条件下的ΔG均为负值,根据热力学第二定律,该反应可正向自发进行;系统的混乱度变化决定了熵变ΔS,该反应熵变为负,原因可能是:随包合反应的进行,AFM 1被包合进入M-β-CD的空腔内,这极大的限制了客体分子的自由移动,分子不同的几何形状引起的空间障碍以及空腔对客体分子平移和旋转自由度的限制引起负熵变;也可能是M-β-CD的柔性修饰部分参与结合并被相对固定,结合客体前的修饰部分处于自包埋状态,在结合客体过程减少了释放的结合水,从而使正熵变减少 [24]。且焓变ΔH为负值,说明该包合反应是放热反应,负的焓变又主要源于主客体分子间的范德华力和偶极-偶极相互作用等,这也是反应自发进行的主要推动力。

2.6 共存离子对AFM 1-Hg 2+-M-β-CD体系荧光的影响

AFM 1的检测主要是针对奶制品。奶制品中通常存在比如K 、Ca 2+、Na 等常量元素离子及微量的Mg 2+、Fe 3+等。为了提高检测的准确性,以空白干扰信号强度的3 倍标准差作为是否产生干扰的标准,考察离子对三元体系荧光的影响,如表2所示。除Fe 3+对荧光有明显淬灭作用外,大多数金属离子不会对测定值产生干扰,在实际测定时,对于含Fe 3+较高的奶产品(如强化营养素乳品)进行应用时要考虑Fe 3+的淬灭干扰作用。

表2 共存离子对AFM 荧光值的影响
Table 2 Influence of concomitant substances on AFM fluorescence signal ( AFM = 2 μg/L)

注:F 0和F分别为加入共存离子前后超分子体系的荧光值,ΔF为加入共存离子前后体系的荧光差值,即F-F 0。3S/F 0=0.041 8,当ΔF/F 0大于0.041 8时,有干扰。

2.7 Hg 2+-M-β-CD-AFM 1检测体系的线性范围与灵敏度

在最佳条件下,采用1.3.3节方法测定AFM 1以及AFM 1-HgCl 2-M-β-CD体系在不同含量条件下的荧光值,如图7所示。在扣除背景干扰后,在0.01~2.00 µg/L低含量AFM 1范围内,荧光增强前AFM 1的线性方程为:F=24.11C AFM1+156.3,R 2=0.998 7;加入荧光增强剂后,三元体系的线性方程为:F=300.86C AFM1+170.51,R 2=0.999 2。荧光增强前后的相关系数均达到0.99以上。HgCl 2-M-β-CD荧光增强剂对微量的AFM 1检测有很好的灵敏度增强效果,以空白测定值3 倍信噪比计算三元体系的检出限为0.002 6 μg/L。

图7 AFM 1荧光增强前后的标准曲线Fig. 7 Standard curves with and without fluorescence enhancement of AFM 1

3 结 论

本实验主要运用光谱法研究7 种CD(β-CD、M-β-CD、HP-β-CD、HE-β-CD、SBE-β-CD、CM-β-CD、β-CDP)对AFM 1荧光增强实验,发现M-β-CD对AFM 1的荧光增强效果最好。通过对M-β-CD和HgCl 2用量的考察,得出M-β-CD、HgCl 2与AFM 1的物质的量之比分别为5.8×10 5∶1、6.6×10 4∶1时,增强效果较好。通过研究甲醇溶液体积分数,得出甲醇体积分数为20%时,体系荧光强度最强,且体系在6 min时,反应平衡。利用光谱法、Benesi-Hildebrand双倒数法、热力学方法以及KI猝灭法对AFM 1-M-β-CD体系机理进行初步的探讨,AFM 1可能与Hg 2+形成金属螯合物,以客体分子的身份与M-β-CD主体分子结合,从而进入CD的空腔中,形成三元超分子包合物,减少了AFM 1的荧光被淬灭。利用该荧光增强体系检测AFM 1,标准曲线在0.01~2.00 µg/L范围内,相关系数R 2可达到0.99以上,检出限为0.002 6 μg/L,这低于一般衍生方法的检出限。

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Rapid Detection of Afl atoxin M 1by Ternary Supramolecular System-Based Fluorescence Enhancement

MA Liang, ZHANG Yuhao, JIANG Tao, SU Min, TU Chunrong
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract:The formation mechanism of ternary supra-molecular systems composed of afl atoxin M 1(AFM 1), β-cyclodextrin or its derivatives (β-CDs) and Hg 2+was studied by measuring the native fl uorescence of AFM 1and fl uorescence changes of the β-CD-Hg 2+-AFM 1system. The fl uorescence intensity of the methyl-β-CD-Hg 2+-AFM 1ternary supramolecular system in 20% (V/V) aqueous methanol with a molar ratio of Hg 2+to M-β-CD to AFM 1of 6.6 × 10 4:5.80 × 10 5:1 could be 4.5 times higher than that of the native fluorescence intensity of AFM 1. It was proved that AFM 1entered the cavity of M-β-CD, leading to reduced fluorescence quenching and increased sensitivity of detection by spectroscopic and thermodynamic analyses. Supermolecular inclusion constants and thermodynamic constant were calculated and the superamolecular reaction mechanism was studied preliminarily by the Benesi-Hidebrand equation and Van’t Hoff equation. Good linearity was observed in the AFM 1concentration range of 0.01–2.00 µg/L with a correlation coeffi cient of 0.999 2 and the detection limit of this method was 0.002 6 μg/L. The method could be used in the rapid detection of AFM 1in dairy products with high sensitivity. It was simple, effi cient and economical without interference from most fortifi ed trace minerals except Fe 3+in dairy products.

Key words:afl atoxin M 1; supramolecular system; fl uorescence enhancement; fast detection; inclusion

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624031

中图分类号:TS207.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)24-0197-06

引文格式:

马良, 张宇昊, 江涛, 等. 三元超分子荧光增敏快速检测黄曲霉毒素M 1[J]. 食品科学, 2016, 37(24): 197-202. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201624031. http://www.spkx.net.cn

MA Liang, ZHANG Yuhao, JIANG Tao, et al. Rapid detection of aflatoxin M 1by ternary supramolecular system-based fl uorescence enhancement[J]. Food Science, 2016, 37(24): 197-202. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624031. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-04-18

基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2013CB127803);国家自然科学基金青年科学基金项目(31301476)

作者简介:马良(1979—),女,副教授,博士,研究方向为食品安全与食品检测技术。E-mail:zhyhml@163.com