表1 微波消解条件
Table 1 Parameters of microwave digestion procedure
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胥佳佳，冯 鑫，汤 静，胡秋辉，赵立 艳*
（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）
摘 要：：建立一种同时测定香菇中6 种形态砷化合物（亚砷酸根、砷酸根、一甲基砷酸、二甲基砷酸、砷甜菜碱、砷胆碱）的超声辅助提取-高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）分析方法。选取0.3 mol/L乙酸溶液作为提取剂，超声辅助提取香菇样品中的砷化合物，选用Hamilton PRP X-100阴离子交换柱，25 mmol/L磷酸二氢铵和水作为流动相进行梯度洗脱，经HPLC-ICP-MS进行分离和定量分析。结果表明，在优化实验条件下，6 种形态砷化合物在0～50 μg/L范围内线性良好，相关系数R 2均在0.998 0以上，检出限为0.31～0.59 μg/L，相对标准偏差为1.6%～3.7%，加标回收率在94.30%～102.75%之间。4 种处理方式后的香菇样品的测定结果显示，无机砷是主要的砷化合物，占总砷含量的48.68%～64.25%。方法灵敏度高，前处理简单高效，可以有效地分析香菇样品中不同形态的砷化合物。
关键词：砷；形态分析；超声辅助提取；高相液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）
砷是一种普遍存在于环境中的有毒有害非金属，在空气、土壤、沉积物、水以及陆生植物中主要以亚砷酸根（arsenite，As Ⅲ）、砷酸根（arsenate，As Ⅴ）、一甲基砷酸（monomethyl arsenic acid，MMA）和二甲基砷酸（dimethyl arsinic acid，DMA）形态存在 [1-3]；在海产品中则以砷甜菜碱（arsenobetaine，AsB）和砷胆碱（arsenocholine，AsC）以及更为复杂的砷化合物如砷糖、砷酯等形式存在 [4-5]。研究证实，砷的毒性与砷的存在形态密切相关，不同形态的砷毒性相差甚远。在主要的砷化合物中，As Ⅲ、As Ⅴ毒性较大，而MMA和DMA毒性较小，AsB和AsC则被认为是没有毒性 [6]。研究表明，砷可以从受污染的灌溉水及土壤中转移至植物体和食物链中，对人类而言，主要是从食品和水中摄取 [1,7-10]。香菇是一种营养丰富、味道鲜美的药食同源的食用菌，具有高蛋白、低脂肪的特点，维生素和矿物质的含量较高，并且内含丰富的香菇多糖、麦角甾醇、菌甾醇、嘌呤和不饱和脂肪酸等生理活性成分，能够增强免疫功能、降血压和抗肿瘤 [11]。从全球的健康饮食趋势来看，食用菌的消耗量正在快速增加。而在2007年浙江食用菌产品调查中显示砷含量最多的是干香菇 [12]，2012年深圳关于砷超标的食用菌产品的调查显示无机砷含量最高的是干香菇 [13]。因此，建立准确测定香菇无机砷和砷形态分布的方法对香菇等食用菌质量安全评价具有重要意义。
适宜的提取方法是形态分析的关键环节，样品基质不同最优的提取方法不同，现有的研究多采用低浓度酸、甲醇-水、甲醇-氯仿等体系对食品样品中不同形态的砷化合物进行提取 [14-16]。目前，对于食用菌中砷化合物的提取的相关报道主要集中在研究DMA、MMA、As Ⅲ、As Ⅴ，少数文章还涉及到了AsC，对于香菇中6 种形态的砷化合物鲜有报道。本实验通过超声辅助溶剂提取，对比不同的提取剂对香菇中6 种形态砷化合物的提取效果，优化提取剂。由于香菇中总砷含量较低，砷化合物的含量更低，因此对检测方法的灵敏度和样品的预处理手段提出了更高的要求，只有高灵敏度的检测技术才能满足香菇中砷形态分析的要求。目前，高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（high performance liquid chromatographyinductively coupled plasma mass spectrometry，HPLCICP-MS）联用技术已经成为最有效的形态分析技术，特别是作为低浓度砷的形态分析方法。因此，本研究采用不同的前处理方法，结合高效、低干扰、高灵敏度、检出限低、线性范围广的检测手段 [17]，建立超声辅助提取-HPLC-ICP-MS联用技术对香菇中砷形态的快速分析方法。
1.1 材料与试剂
新鲜香菇购于南京市卫岗农贸市场，产地为河北省平泉县；干香菇购于南京苏果超市，产地为四川省青川县。
砷元素标准储备液（1 000 μg/L） 国家标准物质中心；As Ⅲ、As Ⅴ、MMA、DMA、AsB、AsC （含量分别为（75.7±1.2）、（17.5±0.4）、（25.1±0.8）、（52.9±1.8）、（38.8±1.1）、（28.0±1.1） μg/g）国家计量科学研究院；甲醇（色谱纯）、硝酸（优级纯）、磷酸氢二铵（优级纯） 南京化学试剂有限公司；实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm）。
1.2 仪器与设备
7700系列ICP-MS仪（包括自动进样器（I-AS）、微型同心雾化器（Glass Expansion，Pocasset）、Scott 双通道雾化室（2通）、屏蔽炬管、7500ce透镜组和八极杆碰撞池反应系统）、1260型HPLC仪 美国Agilent公司；64R冷冻离心机 美国Beckman公司；MARS密闭微波消解仪 美国CME公司；中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司；STG全速通风吸毒柜 南京住宅建设有限公司；JOYN-3000A超声波细胞破碎仪上海乔跃电子有限公司。
1.3 方法
1.3.1 HPLC-ICP-MS条件
HPLC条件：Hamilton PRP X-100阴离子交换柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；流动相A：水，流动相B：25 mmol/L磷酸二氢铵溶液（以氨水调节pH值至8.0）；梯度洗脱程序：0～15 min，100% A～100% B，15～20 min，100% B～100% A；20～25 min，100% A；流速0.9 mL/min；进样量50 μL。
ICP-MS条件：氦气流量3.7 mL/min；射频（radio frequency，RF）功率1 550 W；RF匹配电压1.80 V；载气流速1.09 mL/min；采样深度8.0 mm；雾化室温度2 ℃；监测元素 75As；停留时间60 ms。
1.3.2 样品前处理
干香菇样品：将干香菇样品均匀分为2 份，其中一部分直接用粉碎机粉碎，过60 目筛后于－20 ℃保存备用。并将剩余部分于室温（20～25 ℃）浸泡60 min后取出，将浸泡样品置于45 ℃干燥12 h，取出冷却至室温后粉碎并过60 目筛，于－20 ℃保存备用。
新鲜香菇样品：将新鲜香菇样品用去离子水清洗3 次后均匀分为2 份，去除不可食用部分，一部分直接切割至5 mm左右的薄片，于45 ℃干燥至近恒质量，粉碎后过60 目筛于－20 ℃保存备用。将新鲜香菇进行十字切割，在沸水中烫漂150 s，蒸馏水冷却5 min至室温，将烫漂处理的香菇切至5 mm薄片，于45 ℃干燥至恒质量，粉碎后过60 目筛于－20 ℃保存备用。
1.3.3 水分含量的测定
按照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》测定。
1.3.4 总砷含量的测定
准确称取香菇样品0.500 0 g（精确到0.000 1 g）于微波消解管中，加入10 mL优级纯硝酸，采用微波消解仪消化至溶液澄清透明，消解程序见表1。消解程序结束后，取出消解管，于160 ℃赶酸至近干，用体积分数2%硝酸（以浓硝酸为基准）定容至10 mL，过0.45 μm滤膜，同时做样品空白，配制标准曲线溶液，用ICP-MS仪检测样液中总砷的含量。
表1 微波消解条件
Table 1 Parameters of microwave digestion procedure
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1.3.5 超声条件的优化
研究不同的超声功率（150～750 W）、超声时间（5～30 min）、超声温度（20～80 ℃）对6种形态砷化合物稳定性的影响，在此单因素试验基础上，建立三因素三水平正交试验，如表2所示，通过极差分析找出最优组合，并在正交试验获得的最优条件下进行3 次平行实验，以验证结果的可靠性。
表2 正交试验因素与水平
Table 2 Factors and levels used in orthogonal array design
水平因素A超声功率/WB超声时间/minC超声温度/℃1 150520 2 2257.540 3 300 1060
1.3.6 香菇样品中6 种形态砷化合物的提取
准确称取2.000 0 g（精确到0.000 1 g）香菇样品于50 mL离心管中，加入30 mL 0.3 mol/L乙酸溶液进行提取，将香菇样品振荡均匀后进行超声提取（功率300 W、温度60 ℃、时间10 min），10 000 r/min离心10 min，收集上清液，将沉淀重复提取2 次，合并上清液，将上清液于10 000 r/min离心10 min后过0.45 μm滤膜，40 ℃条件下浓缩至近干，用超纯水定容至10 mL，过0.45 μm滤膜进行HPLC-ICP-MS分析。
2.1 色谱条件优化
本实验选择Hamilton PRP X-100（250 mm× 4.1 mm，10 μm）阴离子交换柱进行6 种形态的砷化合物的分离，选取碳酸铵溶液、磷酸盐缓冲液及磷酸二氢铵溶液3 种流动相进行分离。结果表明，3 种流动相中磷酸二氢铵溶液的分离效果最好，可以完全分离6 种形态的砷化合物；而磷酸盐缓冲液和碳酸铵溶液作为流动相时，只能分离到5 种形态的砷化合物，AsC和AsB无法分开。
优化了以磷酸二氢铵和水为流动相的梯度洗脱条件，结果显示：影响分离效果的因素主要为pH值。本实验考察了pH 5～8时的分离效果，当pH值小于7时，AsC、As Ⅲ不能完全分离，当pH值达到8时，6 种形态的砷化合物能够完全分离。同时发现当磷酸二氢铵的浓度逐渐增大时，可以使As Ⅴ的保留时间缩短，当浓度为25 mmol/L时，既可以缩短As Ⅴ的保留时间同时可以与MMA完全分离。当流动相浓度超过25 mmol/L时，会使砷化合物的分离程度变差，AsB和As Ⅲ不能较好分离。为了能在最短时间内将砷形态有效分离，综合考虑保留时间和分离度2 个因素，选择磷酸二氢铵浓度为25 mmol/L。而在磷酸二氢铵浓度为25 mmol/L、pH值为8时，考察流速对6 种形态砷化合物保留时间的影响。当流速在0.6～0.9 mL/min之间时，随着流速的增加，As Ⅴ的保留时间从25 min降低到15 min左右，可以有效减短洗脱时间，所以最后选择的流速为0.9 mL/min。在优化实验条件下，6 种砷形态混合标准溶液色谱图见图1。
图1 6 种砷形态混合标准溶液色谱图（50 μgg//LL）
Fig. 1 HPLC chromatogram of a mixture of six arsenic standards (50 μgg/L)
2.2 提取剂的优化
常见的提取方法有水 [4,18-19]、低浓度酸 [7,20-24]、甲醇-水 [2,25-26]等体系。本实验在此基础上，比较了水、体积分数2%磷酸溶液、甲醇溶液（1∶1，V/V）、0.3 mol/L乙酸溶液、0.5 mol/L乙酸溶液、0.3 mol/L三氟乙酸溶液、0.5 mol/L三氟乙酸溶液、0.1 mol/L硝酸溶液、0.2 mol/L硝酸溶液9 种提取剂对香菇中6 种形态砷化合物的提取效果。如图2所示，以0.3 mol/L乙酸溶液作为提取剂的提取效果最好，不仅可以提取到6 种砷化合物，同时有最高的提取率。以磷酸、乙酸、三氟乙酸、硝酸4 种酸作为提取剂时，由于实际样品的提取液与标准溶液pH值的差异，会使保留时间产生一定的偏移，但是乙酸作为提取剂可以有效地避免这一现象。体积分数2%磷酸溶液仅能提取到AsC、AsB、As Ⅲ3 种砷化合物，提取效果最差。综合考虑形态转化、提取时间及提取效率等因素，最终选择0.3 mol/L乙酸溶液作为提取剂，该提取剂可快速有效地提取到香菇样品中的6 种砷化合物，并且避免了砷形态之间的转化及6 种砷形态保留时间的偏移。
图2 9 种提取剂对干香菇中砷的提取效果
Fig. 2 Extraction efficiencies of arsenic from dried Lentinus edodes with nine extraction solvents
2.3 超声条件的优化
图3 超声条件对6 种砷形态化合物含量的影响
Fig. 3 Effects of ultrasonic conditions on the contents of six arsenic species
相比较加速溶剂提取和热浸提，超声辅助提取可以在较短的时间内达到较高的提取效率。因此，采取超声辅助提取的方法，通过考察超声功率（150～750 W）、超声时间（5～30 min）、超声温度（20～80 ℃）对6 种形态砷化合物稳定性的影响，在此基础上进行正交试验优化最佳的提取条件，如图3所示。图3a表明，随着超声功率的增大，As Ⅲ逐渐转化为As Ⅴ，因此本试验采用无机砷含量表达As Ⅲ和As Ⅴ2 种形态砷化合物含量之和，而AsB在超声功率为150、300、450 W的条件下差异不显著（P＞0.05），而DMA、MMA、AsC在150 W和300 W条件下差异不显著（P＞0.05），因此超声条件为150～300 W时，DMA、MMA、AsB、AsC 4种砷形态的化合物较为稳定。如图3b所示，DMA、MMA、AsB、AsC 4 种砷形态的化合物在超声时间为5～10 min时，稳定性差异不显著（P＞0.05）。图3c结果表明，在超声温度为20～80 ℃范围内，随着温度的升高，As Ⅴ逐渐转化为As Ⅲ，而与标准溶液相比，趋势仍然为As Ⅲ向As Ⅴ转化，DMA、AsB、AsC在20、40、60 ℃差异不显著（P＞0.05），而MMA在20～80 ℃条件下，差异不显著（P＞0.05），因此，本试验选取的超声温度为20～60 ℃。
2.4 正交试验结果
根据单因素试验结果，选取超声功率、超声时间、超声温度进行三因素三水平的正交试验设计。如表3所示，各因素对6 种砷形态化合物总和的提取率影响的大小次序依次为：超声功率＞超声时间＞超声温度，提取率最高的组合为A 3B 3C 3，由于正交试验中并没有该组合，因此进行验证性实验，结果表明，在该最优条件下，提取率达到78.56%，高于正交试验中的其他梯度，并且可以提取到6 种形态的砷化合物。因此最优条件为A 3B 3C 3，即为超声条件300 W、超声时间10 min、超声温度60 ℃。
表3 L 3 L
9（33
3）正交试验设计及结果
Table 3 Le 3 L
9(3 (3
3) orthogonal array design with experimental results ) orthogonal array design with experimental results
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2.5 方法线性范围与检出限
分别配制1、2、5、10、20、50 μg/L的系列砷形态混合标准溶液，在优化的HPLC条件下进行分析，得到标准曲线，如表4所示，6 种形态的砷化合物的相关系数R 2均大于0.998 0。
在优化的HPLC工作条件下，采用逐级稀释法以3 倍信噪比测定检出限，As Ⅲ、As Ⅴ、MMA、DMA、AsB和AsC的检出限分别为0.39、0.59、0.46、0.37、0.31、0.51 μg/L。
表4 6 种砷化合物的标准曲线、检出限及精密度
Table 4 Standard curve, limits of detection and precision (relative standard deviation) for six arsenic species
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2.6 方法的精密度
为考察方法的精密度，选择50 μg/L的6 种砷形态的混合标样连续测定6 次，按优化的实验条件进行分析，以相对标准偏差评价其重复性，如表4所示，6 种形态砷化合物的相对标准偏差为1.6%～3.7%，均小于5%。
2.7 加标回收率
表5 6 种砷形态化合物的加标回收率
Table 5 Recoveries of six arsenic species from spiked samples
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选择干香菇样品进行研究，选择提取效果最好的0.3 mol/L乙酸溶液进行超声辅助提取，分别向其中加入低、中、高3 种浓度的6 种砷形态混合标准溶液，按优化的实验条件进行测定，如表5所示。AsC、AsB、As Ⅲ、DMA、MMA、As Ⅴ的加标回收率分别为94.30%～97.35%、99.14%～102.49%、98.56%～100.07%、97.75%～101.01%、99.11%～102.75%、95.59%～99.21%。
2.8 样品测定
选取0.3 mol/L乙酸溶液作为提取剂，进行超声辅助提取干香菇、浸泡后的干香菇、鲜香菇、烫漂处理的鲜香菇4 种样品，如表6所示。浸泡后的干香菇总砷含量及各形态的含量均有降低，而水溶性的As Ⅲ、DMA、MMA、As Ⅴ均有所降低；而在鲜香菇和烫漂处理后的鲜香菇未检测到AsC和MMA，其他4 种水溶性的砷化合物含量均有所降低；浸泡后的干香菇比干香菇的总砷含量低38.68%，而烫漂处理后的鲜香菇比鲜香菇的总砷含量低12.76%，而在4 种香菇样品中无机砷的含量分别为其总砷的64.25%、58.67%、49.35%、48.68%，在浸泡和烫漂的过程中，水溶性的砷化合物会转移至水中，从而使无机砷含量占总砷的比例下降。
表6 处理后的香菇样品中砷的形态分析
Table 6 The speciation of arsenic in Lentinus edodes samples
注：ND.未检出；无机砷含量为As Ⅲ和As Ⅴ含量之和；∑As. 6 种砷形态总和，总砷含量为ICP-MS测定结果。
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本实验通过对提取剂和色谱分离条件的优化，建立了超声辅助溶剂提取HPLC-ICP-MS联用测定香菇中6 种形态砷化合物的方法：最优提取剂为0.3 mol/L乙酸溶液，最优的提取条件为超声功率300 W、超声温度60 ℃、超声时间10 min，选用水和25 mmol/L磷酸二氢铵（以氨水调节pH值至8.0）进行梯度洗脱。在优化的实验条件下，6 种砷化合物的检出限为0.31～0.59 μg/L，相对标准偏差为1.6%～3.7%，加标回收率为94.30%～102.75%。通过测定4 种处理后的香菇样品中的砷化合物，干香菇与浸泡的干香菇可检测到6 种砷化合物，而鲜香菇和烫漂处理的鲜香菇没有检测到AsC和MMA。而干香菇中的砷化合物以无机砷为主，无机砷含量占总砷含量的60%以上，浸泡和烫漂可以促进水溶性的As Ⅲ、DMA、MMA、As Ⅴ的溶出，降低其无机砷的比例。结果表明，所建立的方法灵密度高、准确性好、精密度高、前处理简单且提取效率高，适用于香菇样品中砷化合物形态的分析。
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Arsenic Speciation Analysis of Lentinus edodes by Ultrasonic-Assisted Extraction-High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry
XU Jiajia, FENG Xin, TANG Jing, HU Qiuhui, ZHAO Liyan*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract：The speciation of arsenic in Lentinus edodes was analyzed using ultrasonic-assisted extraction (UAE) combined with high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS). Six arsenic compounds were extracted ultrasonically from the samples using 0.3 mol/L acetic acid solution as extraction solvent. The chromatographic separation was performed on a Hamiton PRP-X100 anion exchange column using a mixture of 25 mmol/L ammonium dihydrogen phosphate and water as the mobile phase. Under the optimized conditions, there were good linear relationships in the range of 0–50 μg/L for six arsenic compounds, with correlation coeffi cients all above 0.998 0. The limit of detection (LODs) of six arsenic species (AsC, AsB, DMA, MMA, As III, and As V) were between 0.31 and 0.59 μg/L. The precision of the method, expressed as relative standard deviation (RSD), was less than 5%. The recoveries of AsC, AsB, As III, DMA, MMA, and As Vwere in the range of 94.30%–102.75%. Speciation analysis could accurately determine six arsenic species in L. edodes. Inorganic arsenic was the main species in L. edodes, which was in the range of 48.68%–64.25%. This method was simple, rapid, sensitive and accurate, and could meet the requirements for the quantitative analysis of arsenic speciation in plant materials.
Key words：arsenic; speciation analysis; ultrasonic-assisted extraction; high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry (HPLC-ICP-MS)
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201624034
中图分类号：TS201.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）24-0216-06
引文格式：
胥佳佳, 冯鑫, 汤静, 等. 超声辅助提取-高相液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定香菇中6 种形态砷化合物[J]. 食品科学, 2016, 37(24): 216-221. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624034. http://www.spkx.net.cn
XU Jiajia, FENG Xin, TANG Jing, et al. Arsenic speciation analysis of Lentinus edodes by ultrasonic-assisted extraction-high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry[J]. Food Science, 2016, 37(24): 216-221. (in Chinese with English abstract)
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201624034. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-06-22
基金项目：中央高校基本科研业务费专项（KYZ201653）；国家现代农业（食用菌）产业技术体系建设专项（CARS-24）
作者简介：胥佳佳（1993—），女，硕士研究生，研究方向为食品营养化学。E-mail：2014108077@njau.edu.cn
*通信作者：赵立艳（1977—），女，教授，博士，研究方向为食品营养与化学、食品质量与安全。E-mail：zhlychen@njau.edu.cn