图1 米酵菌酸光谱吸收图
Fig. 1 Absorption spectrum of bongkrekic acid
李红艳 1，金燕飞 2，黄海智 1，翁晨辉 1，胡玉霞 3
（1.浙江省质量检测科学研究院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018；3.临安市产品质量监测中心，浙江 临安 311300）
摘 要：：建立WAX混合型弱阴离子固相萃取富集净化，高效液相色谱-二极管阵列检测器快速测定食品中米酵菌酸残留的方法。采用C 18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-甲醇-1%乙酸溶液（10∶62∶28，V/V）为流动相，以269 nm为分析波长，米酵菌酸在0.1～40 mg/L质量浓度范围内线性良好，相关系数r值大于0.999。本实验考察样品的提取条件及不同固相萃取小柱净化效果，结果表明，选择体积分数80%乙腈溶液为提取溶剂，超声提取30 min，WAX小柱富集、净化，效果最佳。方法检出限为0.03 mg/kg。通过不同样品加标验证，平均回收率为83.3%～95.6%，相对标准偏差不大于5%（n=6）。与GB/T 5009.189—2003《银耳中米酵菌酸的测定》方法相比，该方法精确灵敏、回收率高、前处理简单快速，适用于各种食品中米酵菌酸残留快速测定。
关键词：米酵菌酸；固相萃取；高效液相色谱；食品
米酵菌酸是一种脂溶性酸性化合物，分子式C 28H 38O 7，相对分子质量为486.6，耐热，在酸性条件、氧化剂及日照等条件下不稳定 [1-2]。米酵菌酸是由椰毒假单胞菌酵米面亚种产生的一种可引起食物中毒的呼吸毒素，常见的污染食品主要为谷类发酵制品、薯类制品及银耳等，食用受其污染的食物会引发中毒，严重可致死亡 [2]。多年来关于米酵菌酸中毒机制的研究及因食物中毒引发死亡的报道较多 [3-10]。动物实验表明，米酵菌酸主要作用于肾脏、肝脏及大脑等器官，且细胞内的线粒体对于米酵菌酸的毒性最为敏感 [11-12]，比起其他的线粒体毒物如氰化物或2,4-二硝基苯，具有更强的致死性。除了对于细胞内线粒体的毒性外 [13-14]，米酵菌酸还可以使部分巯基酶失活 [12,15]。但也有研究表明米酵菌酸在生化和药理学方面具有一定的生物活性和研究价值 [16-22]。
目前，我国关于米酵菌酸测定的国家标准GB/T 5009.189—2003《银耳中米酵菌酸的测定》中采用液液萃取-薄层色谱和液液萃取-液相色谱的检测方法 [23]，仅适用于银耳样品中米酵菌酸的测定，且前处理复杂，有机试剂消耗量大、干扰多、回收率低，不适用于批量样品的检测分析。近年来，国内外关于米酵菌酸检测方法的研究鲜有报道。苏肯明 [24]和周鹏 [25]等报道了用甲醇提取银耳中米酵菌酸，通过液相色谱-串联质谱测定的方法。串联质谱法灵敏度高、检出限低，但设备昂贵，难以推广普及。
本实验基于现有标准方法的不足和局限性，建立了混合弱阴离子固相萃取-液相色谱二极管阵列检测器测定食品中米酵菌酸残留的方法。与标准方法相比，一方面，本方法前处理简单快速，低有机试剂消耗对环境污染小，回收率及灵敏度高，适用于各类食品基质中米酵菌酸测定；另一方面，国家标准制定于2003年，二极管阵列检测器尚未普及，采用紫外检测器仅能根据保留时间定性，检测结果可能存在假阳性，因此标准中规定采用薄层色谱法定性确证，检测过程繁琐，本方法采用二极管阵列检测器，通过保留时间和光谱扫描定性可实现样品确证。与质谱方法相比，一方面，本方法定量准确，检测成本低，易于普及；另一方面，本方法通过制备阳性样品探讨了提取条件，发现最佳提取溶剂为体积分数80%乙腈溶液，而非文献报道的甲醇 [24-25]。该方法是现有标准方法的极大改进和完善，对提高检测分析效率和检测结果的灵敏度及准确性提高重要的参考依据。
1.1 材料与试剂
糯米粉、玉米面、银耳等样品采集于商场。
米酵菌酸标准品（纯度≥95%） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；乙酸、乙腈、甲醇均为色谱纯；丙酮、乙醇、石油醚、氯仿等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
LC-20AD高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器、LCsolution工作站） 日本岛津制作所；Milli-Q Gradient超纯水净化器 密理博中国有限公司；超声波清洗仪 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；0.22 μm有机滤膜 上海安谱实验科技股份有限公司；Oasis HLB固相萃取小柱及混合型阴离子小柱Oasis WAX（3 cc/60 mg） 沃特世科技（上海）有限公司；ProElut C 18固相萃取柱（500 mg） 北京五洲东方科技发展有限公司；MycoSep 226 AflaZon＋多功能净化柱上海玉博生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C 18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-1%乙酸溶液（62∶10∶28，V/V）；柱温：35 ℃；波长：269 nm；进样量：100 μL。
1.3.2 样品前处理
WAX混合型弱阴离子固相萃取柱活化：依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，保持填料湿润。
称取20～25 g（精确到0.01 g）粉碎后的样品加入乙腈体积分数80%为提取液100 mL，超声提取30 min，然后于5 000 r/min离心5 min。取上清液5.0 mL上柱，分别以5 mL 2%甲酸溶液和甲醇淋洗后用5 mL 5%氨水-甲醇洗脱。50 ℃氮气吹干，1.0 mL含2%乙酸的甲醇-水（80∶20，V/V）溶液定容，涡旋后，过膜分析。
2.1 米酵菌酸色谱行为、仪器检出限及线性回归方程
米酵菌酸结构式含有3 个羧基（—COOH），酸性较强，其保留因子和选择性受pH值影响大，当流动相条件为酸性时可避免离子化从而得到对称色谱峰。为得到米酵菌酸最佳分离条件，对流动相中乙酸含量和溶剂组成进行了优化。当乙酸比例为1%时，可有效防止米酵菌酸离子化。样品中存在杂质干扰，以甲醇、乙酸溶液为流动相，通过调节甲醇比例实现完全分离分析时间较长。当流动相中加入一定比例乙腈，通过降低流动相极性减小米酵菌酸在反相色谱柱中的保留，从而缩短分析时间，并获得良好的分离效果。
配制米酵菌酸质量浓度为0.1～40 mg/L系列标准溶液，以质量浓度-峰面积计算线性回归方程为y=82.246x＋1.197，相关系数r=0.999 6，以仪器响应与基线噪音比（R SN=3）计算仪器检出限为0.05 mg/L。经二极管阵列检测器光谱扫描发现，米酵菌酸最大吸收波长为269 nm，且光谱特征显著（图1），通过保留时间和光谱图可以对米酵菌酸实现定性分析，无需薄层色谱法进行确诊。
图1 米酵菌酸光谱吸收图
Fig. 1 Absorption spectrum of bongkrekic acid
2.2 提取条件优化
本实验择玉米面中添加米酵菌酸标准品，通过和面、添加酵母粉制备成发酵玉米面阳性样品。考察提取溶剂及提取条件对提取效率的影响。
2.2.1 有机溶剂选择
图2 乙腈体积分数对提取效率的影响
Fig. 2 Effect of acetonitrile concentnration on extraction efficiency
米酵菌酸为脂溶性极性化合物。选择乙腈为有机溶剂，探讨了不同体积分数的乙腈溶液（0%～100%）对米酵菌酸提取效率的影响。样品经不同溶剂提取后，取离心后上清液5.0 mL氮吹浓缩，定容后直接上机分析。从图2可以看出，分别以水和乙腈为提取液时，提取效率最低，分别为22%和35%，提取溶剂的极性对米酵菌酸的提取效率影响较大，当乙腈体积分数为80%作为提取液时提取效率达到98%以上。进一步比较了体积分数80%的甲醇溶液、乙醇溶液及丙酮溶液为提取溶剂时的提取效率，结果发现80%甲醇溶液和80%乙腈溶液的提取效率相当，均大于80%乙醇溶液（60%）和80%丙酮溶液（85%）的提取效率，如图3所示。本实验选择体积分数为80%的乙腈溶液作为提取液，以便于固相萃取小柱选择（包括MycoSep 226多功能净化柱）及提取条件等优化讨论。
图3 不同提取溶剂对提取效率的影响
Fig. 3 Effect of different organic solvents on extraction efficiency
2.2.2 超声时间选择
超声波提取因其提取效率高、时间短、操作简单等优势成为近年来应用最广泛的提取方式。本部分考察了超声提取时间对米酵菌酸提取效率的影响，选择超声时间0～60 min，离心得到样品上清液，取5.0 mL上清液氮气吹干浓缩，定容后上机分析。其中，未经超声的样品（超声时间0 min）涡旋1 min后分析。其余样品经同样涡旋处理后经不同超声时间提取后分析。如图4所示，超声提取30 min时，可以实现样品的完全提取。
图4 超声时间对提取效率的影响
Fig. 4 Effect of sonication time on extraction efficiency
2.3 固相萃取柱选择
固相萃取技术由于具有简便、高效、溶剂消耗少等优点，成为近年来痕量分析中使用最为广泛的前处理手段。本部分选择C 18、Waters HLB及WAX等固相萃取小柱及MycoSep 226多功能净化柱，与标准中液液萃取方法进行了净化效果比较。样品经80%乙腈溶液超声提取、离心后得到上清液，分别经C 18、Oasis HLB及WAX等固相萃取小柱及MycoSep 226多功能净化柱净化，并对前者进行分段收集，结果发现，C 18、HLB对溶于80%乙腈溶液的米酵菌酸无保留。这是由于这两类固相萃取小柱为通用型小柱，通过疏水作用力与目标物结合，适用于非极性至中等极性的水溶性化合物分析，当乙腈体积分数为80%时为强洗脱溶剂，从而使目标分析物在此类固相小柱上无法保留。而MycoSep 226多功能净化柱则是以极性、非极性及离子交换等基团组成填充剂，多应用在真菌毒素类前处理中，实验发现，细菌性毒素米酵菌酸作为可离子化酸性化合物，可与填充剂发生离子交换而被完全吸附WAX混合型弱阴离子固相萃取柱对强酸性化合物具有高度选择性，米酵菌酸基团上的羧基与WAX填料上的胺基离子作用力强，可以有效去除样品基质中碱性及极性化合物，从而达到目标化合物的富集净化、提高灵敏度的目的。加标样品净化效果如图5所示。样品按照1.3.2节处理后，回收率均在80%以上。从图2中WAX混合型弱阴离子固相萃取柱回收效果系列可以看出，不同体积分数的乙腈对WAX混合型弱阴离子固相萃取柱分析目标化合物的回收率无显著影响。
图5 Oasis WAX小柱净化效果
Fig. 5 Purification efficiency of Oasis WAX SPE
同时，本实验与标准方法液液萃取前处理进行了净化及回收效果比较，结果如图5a所示。结果表明，液液萃取方法因前处理繁琐，对结果影响因素多，测得米酵菌酸回收率仅为50%～60%。从图5可以看出，WAX混合型弱阴离子固相萃取柱在净化效果上显著优于液液萃取。
2.4 方法回收率及精密度实验结果
表1 样品加标回收率(n==66))
Table 1 Recoverie n == 66))
?
按照1.3.2节处理方法，选择常被米酵菌酸污染的食品种类糯米面、发酵玉米面、银耳进行3 个水平加标测定回收率，每个水平进行6 个平行测定。如表1所示，3 种样品平均加标回收率在83.3%～95.6%之间，方法的相对标准偏差（日内精密度）不大于5%（n=6）。说明本方法适用于各类食品中米酵菌酸的含量测定。以样品中目标物响应和基线噪音比（R SN=3）计算本方法的检出限为0.03 mg/kg。
2.5 实际样品的检测
利用1.3.1节处理方法，对市场上购买的3 批糯米面、5 个年糕样品、2 份玉米面、5 份银耳样品进行测定，其中1 份银耳样品经分析后发现米酵菌酸残留量为0.3 mg/kg，色谱图及光谱吸收图如图6所示，由于样品中测得米酵菌酸含量较低，其紫外吸收光谱图较弱，但最大吸收波长269 nm处仍清晰可见。从而验证了该方法在实际样品检测中具有操作性强、结果准确、检测灵敏度高等特点。
图6 银耳样品色谱（A）及光谱（B）图
Fig. 6 Chromatogram and spectrum of Tremella fuciformis
本实验建立了基于混合型阴离子固相萃取-液相色谱-二极管阵列检测器快速测定食品中米酵菌酸残留的方法，完全不同于标准中液液萃取-薄层色谱/液相色谱分析技术，实现了简化前处理操作、提高样品提取效率、提高方法回收率及灵敏度和检测结果定性定量准确性、无需薄层色谱进行确证等目的。该方法的建立，是现有标准的极大改进，对政府部门开展相关产品的风险监测和检测部门开展相应的常规分析检测具有重要的技术支持与指导意义。
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Fast Determination of Bongkrekic Acid in Foods Using Mixed-Mode Weak Anion Exchange Solid Phase Extraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detection (HPLC-DAD)
LI Hongyan
1, JIN Yanfei
2, HUANG Haizhi
1, WENG Chenhui
1, HU Yuxia
3
(1. Zhejiang Institute of Quality Inspection Science, Hangzhou 310018, China; 2. School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China; 3. Lin’an Products Quality Inspection Center, Lin’an 311300, China)
Abstract：A method for the determination of bongkrekic acid (BKA) in foods was developed using mixed-mode weak anion exchange (WAX) solid phase extraction (SPE) combined with high performance liquid phase chromatography with diode array detection (HPLC-DAD). BKA was separated on a C 18column using a mobile phase consisting of acetonitrile, methanol and 1% acetic acid aqueous solution (10:62:28, V/V). There was a good linearity between the peak area of the analyte and its concentration in the range of 0.1–40 mg/L with a correlation coeffi cient of more than 0.999. The extraction solvent and conditions were investigated and optimized, and six SPE catridges were compared for their purifi cation effi ciencies. The best effi ciency was achieved when samples were ultrasonically extracted with 80% acetonitrile in water for 30 min and the extract was cleaned up by WAX solid phase extraction. The limit of detection (LOD) of the method was 0.03 mg/kg. The mean recoveries of BKA from spiked samples were 83.3%–95.6% with relative standard deviation (RSD) less than 5% (n = 6). Compared with the standard method, this method is more accurate and sensitive with higher recovery, requires a simpler and quicker pretreatment and thus, can be used for the determination of BKA in various food samples.
Key words：bongkrekic acid; solid phase extraction; high performance liquid chromatography; food
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201624039
中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）24-0247-05
引文格式：
李红艳, 金燕飞, 黄海智, 等. 高效液相色谱-二极管阵列检测器结合固相萃取法快速测定食品中米酵菌酸残留[J]. 食品科学, 2016, 37(24): 247-251. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624039. http://www.spkx.net.cn
LI Hongyan, JIN Yanfei, HUANG Haizhi, et al. Fast determination of bongkrekic acid in foods using mixed-mode weak anion exchange solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC-DAD) [J]. Food Science, 2016, 37(24): 247-251. (in Chinese with English abstract)
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201624039. http:// www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-05-09
基金项目：浙江省科技厅公益性项目（2016C37072）
作者简介：李红艳（1982—），女，高级工程师，硕士，研究方向为色谱分析。E-mail：yourlhy@163.com