超高效液相色谱-串联质谱法检测鱼肉和暂养水中丁香酚残留量

赵东豪,王 强,王旭峰,黎智广,柯常亮,李刘冬*

(中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(广州),农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心(广州),广东 广州 510300)

摘 要::建立超高效液相色谱-串联质谱测定鱼肉和暂养水中丁香酚残留量的分析方法。鱼肉样品经正己烷提取,水样则直接用HLB小柱浓缩、富集与净化,以电喷雾离子源负离子模式,在多反应监测模式下测定,内标法定量。结果表明,样品在4 min内完成测定,在1~200 μg/L质量浓度范围内,相关系数(R 2)大于0.996,鱼肉样品的加标回收率在88.6%~106%之间,相对标准偏差为7.82%~11.90%;水样的加标回收率在89.2%~96.5%之间,相对标准偏差为5.18%~7.83%。鱼肉和水样中丁香酚的定量限分别为2.5 μg/kg和0.05 μg/L。

关键词:超高效液相色谱-串联质谱;固相萃取;丁香酚;鱼肉;暂养水样

丁香酚主要来自丁香、肉豆蔻、月桂叶等植物的花蕾、叶和茎提取的精油,为无色至淡黄色稠厚油状液体,易溶于有机溶剂,几乎不溶于水。丁香酚的主要用途为牙科麻醉治疗药物和香料用食品添加剂。GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》、美国香味料和萃取物制造者协会、欧洲食品安全局的香料物质清单中均有丁香酚 [1-3]。除此之外,丁香酚对淡水鱼类、海水鱼类和甲壳类均有良好的麻醉效果 [4]。流通环节合理使用麻醉剂能够强制改变鱼类在运输途中的生理状态,使鱼进入类似休眠状态,降低鱼体代谢强度,减少水质污染,提高运输成活率 [5]。丁香酚来源广泛、价格低廉、麻醉效果好、将鱼放入清水中又可快速复苏,近年来常被作为鱼用麻醉剂使用。

国际上对丁香酚作为食用鱼的麻醉剂存在争议,主要是从安全性考虑。作为天然植物提取物质,丁香酚可对人体肝脏产生损害 [6]。美国国家毒理学计划认为丁香酚是可疑致癌物 [7]。世界癌症研究机构也因丁香酚具有潜在致癌性而将其划分为第3类致癌物 [8]。目前不同国家对丁香酚作为鱼用麻醉剂规定不一。新西兰曾规定食用鱼中丁香酚的最高残留限量为0.1 mg/kg,但随后又予以撤销 [9-10];日本规定最高残留限量为0.05 mg/kg [11];美国和加拿大则拒绝批准丁香酚作为鱼用麻醉剂使用 [12-13]。我国对鱼用麻醉剂的使用尚无明确规定,但包括本实验室在内的数家单位联合调研表明,2015年鲜活水产品流通环节使用的麻醉剂主要为丁香酚。

当前测定丁香酚的方法有紫外分光光度法 [14]、毛细管电泳法 [15]、气相色谱法 [16-17]、液相色谱法 [18-19]以及色谱-质谱联用技术 [20-22]等。利用光谱法和色谱法测定丁香酚,具有操作简单、准确度高、重复性好等优点,但在测定鱼肉等复杂基质样品时,容易受杂质干扰,而液相色谱-串联质谱法特异性强,能较好地解决此类问题。陈焕等 [16]将水产品中残留的丁香酚类麻醉剂提取后,用分散固相萃取技术净化,再经气相色谱测定,定量限为100 μg/kg。高平等 [18]采用高效液相色谱荧光法测定了水产品中丁香酚类化合物,定量限为10~20 μg/kg。余颖 [20]以甲基丁香酚为内标,建立了鱼肉中丁香酚残留量的气相色谱-质谱检测方法,定量限也为10 μg/kg。Beaudry等 [22]采用液相色谱-串联四极杆-离子阱质谱测定了大鼠血浆中丁香酚的含量,为提高信号强度,先将丁香酚进行洐生化,定量限为100 μg/L。这些方法检测限高,灵敏度低,难以对水及鱼肉中痕量的丁香酚残留进行准确的定性和定量分析。

与鱼肉相比,水样处理简单方便,经富集与净化后即可上机测定。作为鱼用麻醉剂,丁香酚药浴给药,通过监测暂养水中药物的含量,即可有效监控丁香酚的使用情况。因此,本研究分别建立了暂养水样和鱼肉中丁香酚残留量的固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品经HLB小柱富集与净化后,经液相色谱-质谱联用仪测定,内标法定量。方法前处理过程比较简单,无需洐生化,结果灵敏度、准确度好,可以用于暂养水和鱼样中丁香酚的残留检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼肉 市购;丁香酚对照品(纯度98.0%;CAS号97-53-0)、丁香酚-D 3内标物(纯度97.2%;CAS号1335401-17-6) 美国Accustandard公司;甲醇、乙酸乙酯(均为色谱纯) 美国Fisher Scientic公司;水为超纯水。

将丁香酚和丁香酚-D 3用甲醇稀释,配制成质量浓度为1 μg/mL的标准储备液,存于-20 ℃冰箱中,保存期限为1 个月。使用时配成不同质量浓度的标准工作溶液。

1.2 仪器与设备

HLB固相萃取小柱(60 mg/3 mL)、Xevo-TQ液相色谱-质谱联用仪(配有电喷雾离子源及Masslynx数据处理系统) 美国Waters公司;5810型台式离心机德国Eppendorf公司;Milli Q去离子水发生器 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱:Waters Acquity BEH C 18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相:甲醇和水,梯度洗脱程序见表1;流速0.35 mL/min;柱温35 ℃;进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program

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1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源;负离子模式;毛细管电压2 kV;脱溶剂气温度350 ℃;脱溶剂气流量700 L/h;锥孔电压20 V;锥孔反吹气流量30 L/h。多反应监测离子对及条件见表2。

表2 丁香酚的质谱多反应监测离子对及质谱条件参数
Table 2 MRM ion pairs and mass spectral parameters for eugenol

注:*.定量离子。

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1.3.3 样品处理

1.3.3.1 样品的提取

鱼肉:取鱼的背部两侧肌肉,于绞肉机中绞成肉泥状,准确称取2.00 g(±0.02 g)于50 mL聚丙烯离心管中,加入质量浓度为100 μg/L的丁香酚-D 3内标溶液0.1 mL,静置30 min。加入5 mL正己烷,旋涡振荡5 min,5 000 r/min离心5 min,上清液转移至10 mL玻璃试管,残渣再用5 mL正己烷重复提取1 次,合并上清液,40 ℃水浴中氮气吹干,用3 mL体积分数60%甲醇溶液复溶,备用。

水样:从运输车或暂养池采集水样1 L,装入玻璃瓶中。经沉淀后,从上层取约300 mL水,先经2 μm的玻璃纤维过滤器过滤以去除较大的颗粒杂质,然后再经0.45 μm的尼龙膜过滤。准确量取100 mL,加入质量浓度100 μg/L丁香酚-D 3内标溶液0.1 mL,混合均匀,备用。

1.3.3.2 固相萃取

水样上柱时,为便于操作,将50 mL注射器去掉活塞后,用转接头接在HLB小柱的上方。先将HLB小柱用3 mL甲醇和3 mL水活化,然后将准备好的样品以1 mL/min速率上样,弃流出液,用3 mL体积分数60%甲醇溶液淋洗后,用4 mL甲醇洗脱,收集洗脱液,40 ℃水浴条件下氮气吹至0.5 mL以下,用初始比例的流动相定容至1 mL,过0.22 μm针头滤膜,上机检测。

1.3.4 方法验证

将丁香酚的标准储备液用体积分数50%甲醇溶液稀释成1、5、10、50、100、200 μg/L系列标准工作液,每个质量浓度的标准工作液均含有10 μg/L丁香酚-D 3内标,内标法定量,获得丁香酚的标准曲线和相关系数。

在空白鱼肉样品中添加质量浓度为0.05、0.1、0.5 μg/mL和2 μg/mL的丁香酚标准工作液0.1 mL,制得2.5、5、25 μg/kg和100 μg/kg添加水平样品;在100 mL空白水样中添加质量浓度为0.05、0.1、0.5、2 μg/mL的丁香酚标准工作液0.1 mL,制得0.05、0.1、0.5 μg/L和2 μg/L添加水平样品。所有样品均添加质量浓度为100 μg/L的丁香酚-D 3内标溶液0.1 mL。每个质量浓度水平制作6 个平行样品,按1.3.3节所述方法处理,内标法定量,计算回收率和相对标准偏差,考察方法的准确度和精密度。

在空白样品中添加系列质量浓度的标准工作液和内标溶液,以最低检出质量浓度计算,在能够定性分析的基础上,以定量离子的信噪比不小于10为定量限,考察鱼样和水样方法的灵敏度。

2 结果与分析

2.1 质谱裂解对定性和定量分析的影响

丁香酚的结构式中含有酚羟基,在电喷雾离子源质谱中,容易丢失一个质子形成[M-H] 的准分子离子峰,在负电离时具有较高的信号强度 [23]。在负离子模式下,[M-H] 很容易丢失甲基获得特征离子m/z 148,该离子具有很高的丰度,可以作为定量离子。根据欧盟2002/657/EC指令规定,质谱确证分析须达到4 个识别点,但除了m/z 148,[M-H] 直接生成的其他碎片离子丰度都比较弱。增加碰撞能,m/z 148又继续碎裂出丰度较高的m/z 121。此2 个特征离子可与母离子m/z 163组成多反应监测离子对进行定性分析。按照1.3.1节和1.3.2节设定的色谱和质谱条件分析,与m/z 148相比,m/z 121的相对丰度只有约7%~8%,如图1所示。当丁香酚的质量浓度水平比较低时,m/z 148的信噪比大于10,但m/z 121的信噪比却小于3,甚至可能观测不到明显的信号峰,无法对丁香酚定性分析,从而影响方法的定量限,尽管此时m/z 148的信噪比已足够高,超过了定量限。因此,在电喷雾离子源质谱中,丁香酚2 对特征离子太低的相对丰度,直接影响低质量浓度时对该化合物进行准确的定性和定量分析,事实上提高了方法的定量限。

图1 鱼肉中添加10 μgg/kg丁香酚及内标物的总离子流图(AA)和多反应监测色谱图(BB、CC)
Fig. 1 Total ion current (A) and MRM chromatograms (B, C) of eugenol and eugenol-D 3fortified in fish at 10 μgg/kg

2.2 提取液的选择

丁香酚可溶于甲醇、乙腈、正己烷和乙酸乙酯等常用的有机溶剂,本实验对比了4 种有机溶剂对丁香酚的提取率,均大于85%,都能有效提取鱼肉中残留的丁香酚。使用甲醇时,提取液比较混浊,过柱时容易堵塞,而乙腈毒性大,价格贵,且浓缩所需时间显著长于其他几种试剂,检测效率低。乙酸乙酯提取的样品经固相萃取净化后,在目标物附近仍有较大的杂质峰,而正己烷则没有观察到明显的干扰峰(图1),因此被确定为鱼肉样品的提取液。

2.3 固相萃取条件的优化

为选择合适的淋洗液和洗脱液,配制不同比例的甲醇-水溶液(10∶90、20∶80、30∶70 … 90∶10、100∶0,V/V)进行淋洗和洗脱实验。分别取3 mL溶液,加入100 ng丁香酚标准溶液和内标溶液,混合均匀后,直接过柱。依次用甲醇、水、相应比例的甲醇-水溶液活化、平衡HLB小柱后上样,再用3 mL该比例的甲醇-水溶液淋洗,抽干后用甲醇洗脱,氮气吹干后再溶解即可上机检测。结果显示,当甲醇的比例为60%以下时,目标物不会在上样和淋洗时随柱漏穿;甲醇比例为70%时,则会有少量丁香酚随柱流失,回收率降低,如图2所示。为确保目标物吸附在小柱上,且尽可能多地洗去杂质,确定淋洗液为体积分数60%甲醇溶液。

图2 丁香酚在60 mg/3 mL的HLB小柱上的洗脱曲线
Fig. 2 Elution curve of eugenol performed on HLB cartridge (at 60 mg/3 mL)

从图2可以看出,100%甲醇溶液将丁香酚从HLB小柱上洗脱的效率最佳。为确定洗脱液的体积,用5 mL甲醇洗脱小柱上吸附的丁香酚,分别精确收集每毫升的洗脱液,并测定丁香酚的质量浓度水平,计算每毫升甲醇得到的回收率。结果表明:1 mL甲醇即可洗脱约85%的丁香酚,第5毫升洗脱液中没有检出丁香酚,共需4 mL甲醇能够将丁香酚从60 mg/3 mL的HLB小柱上完全洗脱。因此,确定固相萃取时的洗脱液为4 mL甲醇溶液。

2.4 氮吹时水浴温度对回收率的影响

丁香酚广泛存在于许多中药和其他植物的挥发油中,具有强烈的香味。为考察其在氮吹时的稳定性,取5 mL甲醇溶液,加入质量浓度为1 μg/mL丁香酚标准溶液0.1 mL,分别在25、30、35、40 ℃和45 ℃水浴中用氮气浓缩至0.5 mL以下,再用超纯水定容至1 mL,测定丁香酚的质量浓度。结果表明,在25~40 ℃时,丁香酚的平均回收率约为97%,相对标准偏差小于2.5%;而45 ℃时,回收率降至约92%,可能因温度升高后少部分目标物分解所致。结果表明,丁香酚在氮气浓缩时稳定性良好,适合的水浴温度为40 ℃。

2.5 线性范围、回收率、精密度与定量限

在1~200 μg/L的范围内,丁香酚标准溶液的线性关系良好,相关系数R 2大于0.996。在2.5、5、25 μg/kg及100 μg/kg添加水平上,鱼肉中丁香酚的回收率均在88.6%~106%之间,相对标准偏差为7.82%~11.90%。在0.05、0.1、0.5 μg/L和2 μg/L添加水平上,水样中丁香酚的回收率在89.2%~96.5%之间,相对标准偏差为5.18%~7.83%。以10 倍信噪比计算,鱼肉中丁香酚的定量限为2.5 μg/kg,水样中丁香酚的定量限为0.05 μg/L。

采用该方法检测实际水体中残留的丁香酚含量时,水样在固相萃取时被浓缩了100 倍,样品中的丁香酚被富集,质量浓度水平低于1 μg/L的水样,经100 倍浓缩与富集后,其质量浓度也在1~200 μg/L的线性范围内,因此水样中丁香酚的定量限可低至0.05 μg/L。

2.6 实际样品分析

为验证本方法的适用性和可靠性,将其用于测定从广东省多个水产批发市场采集的鳜鱼、鲈鱼、乌鳢、草鱼、石斑、真鲷等鱼类样品及相应的暂养水样各50 份,有7 份鱼样及其暂养水检出了丁香酚残留(其中鱼肉样品的残留量为3.11~90.5 μg/kg,暂养水为2.03~196 μg/L),主要为石斑、鲈鱼、真鲷及草鱼等品种。结果表明,本方法适合用于水产品及暂养水中丁香酚的残留检测。

3 结 论

鱼肉中的丁香酚经正己烷提取,水样则直接用HLB小柱浓缩、富集与净化,采用超高效液相色谱-串联质谱法测定,内标法定量。方法准确度高、稳定性好,能够用来检测鱼肉和暂养水中丁香酚的残留,可以为监控水产品流通环节丁香酚的使用提供技术支持。

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Determination of Eugenol in Fish and Farming Water by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Donghao, WANG Qiang, WANG Xufeng, LI Zhiguang, KE Changliang, LI Liudong*
(Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, Laboratory of Quality and Safety Risky Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation (Guangzhou), Ministry of Agriculture, Fishery Environment and Aquatic Products Quality Inspection and Testing Center (Guangzhou), Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)

Abstract:An analytical method based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was developed for the determination of eugenol in fi sh and farming water samples. Fish samples were extracted with n-hexane and the extract was cleaned up by solid phase extraction with a hydrophilic-lipophilic balance (HLB) cartridge. Water samples were directly concentrated and purifi ed with HLB cartridge. Eugenol was quantitated with an internal standard method in the multiple reaction monitoring mode using negative electrospray ionization within 4 min. The calibration curve for the analyte was linear (R 2> 0.996) in the range of 1 to 200 μg/L. The recoveries of the drug from fi sh and farming water samples were 88.6%–106% and 89.2%–96.5%, respectively with relative standard deviations (RSDs) of 7.82%–11.90% and 5.18%–7.83%. The limits of quantity (LOQs) were 2.5 μg/kg in fi sh and 0.05 μg/L in water, respectively.

Key words:ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); solid phase extraction; eugenol; fi sh; farming water

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624040

中图分类号:TS207.5

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)24-0252-05

引文格式:

赵东豪, 王强, 王旭峰, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法检测鱼肉和暂养水中丁香酚残留量[J]. 食品科学, 2016, 37(24): 252-256. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624040. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Donghao, WANG Qiang, WANG Xufeng, et al. Determination of eugenol in fish and farming water by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2016, 37(24): 252-256. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624040. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-05-30

基金项目:中国水产科学研究院南海水产研究所基本科研业务费项目(2014TS28);

广东省水产品质量安全专项(GDSCZA2015008);国家农产品质量安全风险评估重大专项(GJFP201501003)

作者简介:赵东豪(1981—),男,助理研究员,博士,研究方向为水产品质量安全与风险评估。E-mail:donghaozhao@126.com

*通信作者:李刘冬(1959—),男,研究员,学士,研究方向为水产品质量安全与风险评估。E-mail:168lld@163.com