PCR-DGGE法结合传统技术研究4 ℃冷链贮运条件下三文鱼菌相变化

张新林,谢 晶*,钱韻芳,刘永吉,曾丹妮

(上海海洋大学食品学院,上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306)

摘 要::为研究三文鱼在冷链贮运4 ℃条件下的细菌腐败机制,运用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术、传统鉴定技术以及PCR技术分析了4 ℃冷链贮运条件下的三文鱼中腐败菌菌相变化规律,并通过产量因子测得各优势菌株致腐能力,从而确定特定腐败菌。DGGE指纹图谱显示,贮藏期间微生物多样性降低,假单胞菌属和希瓦氏菌属条带亮度却逐渐提高。这表明这两个属的微生物在三文鱼冷藏期间逐渐成为优势菌。通过分离和鉴定贮藏末期腐败三文鱼的优势腐败菌,本实验得到5 株优势腐败菌,分别为麦芽糖肉食杆菌(Carnobacterium maltaromaticum LMA28)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. syringae B728a)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens SBW25)、肉食杆菌(Carnobacterium sp. WN1359)和波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica OS678)。将这5 株纯培养的腐败菌分别接种到无菌三文鱼中并冷藏一定时间后,各腐败菌的挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)产量因子分别为1.26×10 -7、1.25×10 -7、1.36×10 -7、1.08×10 -7mg TVB-N/CFU和1.03×10 -7mg TVB-N/CFU。这5 株腐败菌对三文鱼致腐败能力的顺序依次为荧光假单胞菌SBW25>麦芽糖肉食杆菌LMA28>丁香假单胞菌B728a>肉食杆菌WN1359>波罗的海希瓦氏菌OS678。

关键词:三文鱼;菌相变化;特定腐败菌;荧光假单胞;致腐能力

三文鱼(Salmon salar)又名大马哈鱼或鲑鱼,为冷水域洄游鱼类 [1],广泛分布在北半球高纬度地区,肉质鲜美、口感好,是制作刺身的良好原料。三文鱼是补充人体营养物质的理想食物来源,具有良好的保健作用 [2]。2013年国内三文鱼产量为3.23万 t,为2010年产量的1.8 倍,全部供应于内销;2012年进口鲜、冻三文鱼的量接近6万 t;未来三文鱼的数量和质量需求可能会越来越高 [3-4]

三文鱼在贮运过程中极易发生腐败变质,其中特定腐败菌(specific spoilage organisms,SSOs)在水产品的腐败过程中起着主导作用,其生长繁殖与水产品的货架期有着密切的关系 [5]。为确定水产品中的SSOs,不仅需要分析优势腐败菌的组成,还需结合感官、理化等指标通过对优势腐败菌致腐能力的评价进一步确定。腐败菌致腐能力的定量分析常用接种到无菌鱼块中的单位腐败菌产生的腐败代谢产物挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)值和微生物的生长量表示 [6]。然而,目前关于贮藏期间三文鱼微生物群落演替规律及优势腐败菌致腐能力方面的研究还鲜见相关报道。本研究拟通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCRDGGE)、传统表型鉴定和PCR等技术分析4 ℃冷链贮运条件下的三文鱼中腐败菌菌相变化规律,并以TVB-N产量因子Y TVB-N/CFU为标准评价各优势腐败菌菌株致腐能力,从而确定4 ℃条件下三文鱼SSOs,为建立微生物生长货架期模型及设计靶向抑菌保鲜方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三文鱼(产地挪威)购于芦潮港海鲜市场,鱼体铺满碎冰后置于4 ℃的冷藏箱内运回实验室。

营养琼脂培养基、假单胞菌CFC选择性培养基、肠道菌计数琼脂培养基、MRS琼脂培养基、STAA培养基、铁琼脂培养基、甘露醇高盐琼脂培养基、精氨酸水解酶培养基、葡萄糖氧化发酵培养基、1%盐酸二甲基对苯二胺溶液、3% H 2O 2青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;琼脂糖、用于PCR扩增的全套试剂及合成的扩增引物 生工生物工程(上海)股份有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;NaCl、MgO、H 3BO 3、HCl(均为分析纯) 国药集团化学试剂北京有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KE高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂;VS-1300L-U洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;DHP-9162型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;PowerPac Basic电泳仪、Universal HoodⅡ凝胶成像仪、Bio-Rad Dcode System 美国Bio-Rad公司;Kjeltec8400全自动凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司;Mastercycler6325 PCR扩增仪、5427R离心机 德国Eppendorf公司;PCR仪 美国Mycycler Bid-rad公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

将购买的3 条新鲜三文鱼去头去尾去内脏,用无菌蒸馏水洗净,沥干,取鱼背肉切成7~8 cm长的鱼段,随机装入带有托盘的保鲜袋中,置于4 ℃恒温冰箱中贮藏。1.3.2 DGGE法研究三文鱼菌相变化 [7]

1.3.2.1 总DNA的提取

在第0、2、4、6、8、10天和12天随机取两组三文鱼鱼肉。在超净台中将90 mL无菌生理盐水加入装有10 g肉的无菌拍打袋,均质2 min,取30 mL上清于灭菌离心管中,4 ℃、200×g离心10 min后,取20 mL上清液于另一灭菌离心管中,4 ℃条件下10 000×g离心20 min。取沉淀置于1.5 mL离心管,DNA提取按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒的方法并进行稍作调整:沉淀加入150 μL缓冲液悬浮,加入20 μL溶菌酶(50 mg/mL),混匀,37 ℃孵育1 h,加入30 μL蛋白酶K(20 mg/mL),混匀,55 ℃孵育2~3 h,然后继续按试剂盒操作说明进行。

1.3.2.2 16S rDNA PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检验

扩增对象为细菌16S rDNA的V3可变区:上游引物为341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCG GGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’);下游引物为R518(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)。

PCR扩增在梯度PCR仪上进行。PCR反应体系(50 μL):Taq PCR Master Mix(2×)25 μL,上下游引物各2 μL及模板DNA 2 μL,补充ddH 2O至终体积50 μL。总DNA扩增采用降落PCR,反应程序为94 ℃预变性4 min,先20 个循环(94 ℃变性30 s,退火温度从65 ℃到55 ℃,每个循环降低0.5 ℃,退火30 s,72 ℃延伸30 s),再于恒定退火温度条件下进行10 个循环(94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),最终72 ℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后,-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2.3 DGGE

PCR产物的DGGE分析在Bio-Rad Dcode System上进行,聚丙烯酰胺凝胶质量分数为8%(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺37.5∶1)。变性梯度40%~55%(100%变性剂含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺),在1×TAE缓冲液中,先200 V预电泳5~10 min,然后在100 V的固定电压条件下电泳10 h。用SYBR greenⅠ(1∶10 000)染色20 min后用凝胶成像系统进行照相。图像分析用Quantity one分析软件进行。

1.3.2.4 割胶回收

切下的亮度条带放入无菌EP管中,加入0.5 mL的去离子水清洗,离心,去上清液,此冲洗步骤重复2~3 次,加入50 μL ddH 2O,4 ℃过夜保存。取10 μL上清液作为PCR模板进行扩增,引物分别为341F、518R,反应条件同1.3.2.2节。PCR产物回收试剂盒进行纯化回收PCR产物,并委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.3.3 腐败菌的筛选和确定

1.3.3.1 腐败菌的分离纯化

在无菌环境下,随机取10 g变质三文鱼(4 ℃条件下贮藏10 d,根据预实验结果)鱼肉于无菌均质袋中,加入90 mL无菌生理盐水封口后拍打2 min,取上清液1 mL进行10 倍梯度稀释,选择3 个合适的稀释度,每个稀释度做3次重复,倾注于含有不同选择培养基的平板中,培养基的选择及培养条件见表1。

表1 各菌的选择性培养基及培养条件
Table 1 Culture media and conditions for different bacteria

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从上述不同选择培养基的平板中,挑取各种典型生长的菌落,然后在各自的培养基上反复进行平板划线分离,至少3 次划线分离后得到纯化的单菌落 [11],最后于肉汤中培养到10 8CFU/mL后贮藏菌株。

1.3.3.2 优势腐败菌的筛选

取保存的菌株,将其培养至对数期后,用无菌生理盐水制成菌悬液,摇匀,利用血球计数板直接测定菌液浓度,调整菌液浓度为10 6CFU/mL [12]。用无菌手术刀将三文鱼背部肉分割成约40 g大小均匀的肉块,先用75%酒精喷其表面,静置10 s后用无菌超纯水清洗,再在超净台上用酒精灯对其进行表面灭菌,然后浸泡于调整过的菌液30 s后取出放入无菌自封袋中,每种菌株接种2 个肉块,以2 个未接种菌液的肉块为对照,都放置于4 ℃条件下贮藏。根据肉块的色泽、黏度、弹性和气味,每天进行感官评价 [1],将腐败最快的肉块所接种的菌株作为筛选出的优势腐败菌,对其进行菌种鉴定并测定该菌对无菌三文鱼(总菌数低于2(lg(CFU/g)))的腐败能力。

1.3.3.3 优势腐败菌的鉴定

1)观察菌落特征和菌体形态

观察描述划线平板上所见的菌落和菌体形态特征,如菌落的大小、颜色、隆起程度等。

2)生理生化实验

根据《常见细菌系统鉴定手册》 [13]和《伯杰细菌鉴定手册》 [14]对各菌株进行生理生化鉴定。

3)单菌落细菌基因组DNA的提取

挑取重新培养18~24 h的单菌落至液体培养基中过夜培养,采用天根细菌基因组DNA快速抽提试剂盒直接提取DNA,于-20 ℃保存待下一步实验。

4)16S rDNA的PCR扩增

以提取的DNA作为模板,采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)来扩增目的片段的基因。采用25 μL体系进行PCR扩增,即Taq PCR Master Mix(2×)12.5 μL、ddH 2O 9.5 μL、上下游引物各1 μL及模板DNA 1 μL。PCR扩增程序为:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,进行35 个循环;最后72 ℃延伸10 min。用1×TAE缓冲液配制2%琼脂糖凝胶,取3 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,再用溴化乙锭对其染色后,在凝胶成像仪中观察电泳结果并拍摄电泳图谱,每种菌株均获得长度为1 500 bp左右的条带,将PCR成功的样品委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

5)DNA测序和系统发育树的构建

登陆网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),将测序所得16S rDNA序列与核酸序列数据库中已知序列进行同源比对,从中选取若干个相似性高的菌株序列,使用MEGA 6.06软件,通过邻接法做1 000 次随机抽样构建系统发育树 [15]

1.3.4 优势腐败菌腐败能力的测定

将筛选所得的优势腐败菌按照1.3.3.1节的方法制得一定浓度的菌悬液,接种于灭菌的肉块后放入无菌自封袋中4 ℃贮藏。将筛选得到的5 种菌株接种到无菌的三文鱼鱼肉上,贮藏在4 ℃条件下每12 h测得各组的总菌落数 [8]和每24 h测定TVB-N值 [16],以未接种菌株的三文鱼肉为空白对照组。将TVB-N产量因子Y TVB-N/CFU作为各优势腐败菌腐败能力的定量指标 [17],公式如下:

1.4 数据分析

系统发育树的构建用MEGA 6.06软件。数据采用3 次平行实验的平均值,结果用 ±s表示;采用OriginPro 9.0绘制数据图。

2 结果与分析

2.1 DGGE指纹图谱分析

DGGE是根据DNA在不同浓度变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化,从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开 [18]。4 ℃条件下三文鱼鱼肉的16S rDNA V3片段的DGGE指纹图如图1所示。不同位置的条带代表不同的优势细菌;亮度反映出细菌相对量的多少。

图1 4 ℃贮藏条件下三文鱼的DGGE指纹图谱
Fig. 1 DGGE-based bacterial profile of salmon stored at 4 ℃

在紫外灯照射下挑选和切割下13 条变化显著的条带,从上到下依次标号为1~13。从DGGE的指纹图谱可以看出,随着贮藏时间的延长各菌株的亮度出现明显的差异性变化:条带6、7、8、9、11、12和13亮度呈明显增强趋势;条带5保持较高亮度,在第10和12天略有减弱;条带4和10亮度在前8 d逐渐减弱,在第10和12天略有增强;条带2亮度呈先增强后减弱的波动趋势;条带12亮度到第10天才出现,亮度逐渐增强。这些结果表明,在低温贮藏过程中三文鱼菌相有较大变化。

图2 DGGE图谱相似性分析
Fig. 2 Similarity analysis of DGGE profiles

进一步对DGGE图谱进行相似性分析,结果如图2所示。每天的取样点均获得较高的相似性,表示图谱中每组取样无显著差异,但各组间存在较大的差异;对DGGE图谱进行多样性分析发现,多样性分数从第0天的2.76下降到第8天的2.40,10~12 d后多样性维持不变。对图谱的相似性和多样性分析表明冷链温度4 ℃条件下的三文鱼的微生物存在着较大动态演替过程。

表2 DGGE条带分离的细菌16S rDNA基因序列鉴定
Table 2 16S rDNA sequence similarities to the closest relatives of DNA recovered from the respective bands in the DGGE gel

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为确定不同条带代表的细菌种类,对13 个条带进行了割胶回收和克隆测序,将13 个割胶条带测序所得16S rDNA序列结果在NCBI上用BLAST软件在Genbank中与参考序列进行相似性比对,分析结果如表2所示。13 条条带根据所对应的相似度最高的菌株中共发现8 种菌属,其中有6 个条带为假单胞菌属微生物,其他各条带分别代表氢噬胞菌属、氧化葡萄糖酸杆菌属、热死环丝菌属、不动杆菌属、肠球菌属、希瓦氏菌属和肉食杆菌属微生物。本实验结果与寒带、温带水域捕获的海水鱼初始菌主要包括非发酵型革兰氏阴性菌假单胞菌属、嗜冷杆菌属、不动杆菌属等这一结论相符 [19]

从图1可以看出,6 条假单胞菌属的条带亮度在贮藏周期内一直处于明亮状态,说明假单胞菌属是三文鱼的优势菌群,与Hozbor等 [20]的研究一致。

2.2 腐败菌的筛选和鉴定结果

2.2.1 优势腐败菌的筛选

将经过12 d贮藏后变质三文鱼肉的稀释液倾注于含有不同选择培养基的平板,从中挑取典型生长的菌落共17 株,其中在假单胞菌琼脂培养基中5 株(J1~5)、肠道菌计数琼脂培养基4 株(V1~4)、STAA培养基3 株(S1~3)、MRS培养基3 株(M1~3)、铁琼脂培养基2 株(T1~2)。

对分别接种了这17 株菌的新鲜无菌三文鱼块在贮藏期间的感官品质进行评价,发现接种菌株M1、J1、J4、S2和T2的肉块感官得分最低,腐败较快。因此对筛选出的5 株优势腐败菌M1、J1、J4、S2和T2进行菌种鉴定并测定各种菌株对4 ℃条件下三文鱼的腐败能力。

2.2.2 优势腐败菌的鉴定

2.2.2.1 菌落特征和菌体形态

表3 三文鱼冷藏过程中各细菌菌落形态与特征分析
Table 3 Analysis of colony morphology and characteristics of the bacteria in salmon stored at 4 ℃

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表4 5 种菌种的生理生化鉴定
Table 4 Physiological and biochemical characteristics of 5 strains

注:-.阴性;+.阳性。

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细菌菌落形态与特征分析及生理生化鉴定结果见表3和表4。由郭光平 [21]推荐的肉品中微生物鉴定图谱可知,M1为肉食杆菌属,J1和J4均为假单胞菌属,S2为热死环丝菌属,T2为希瓦氏菌属。

2.2.2.2 系统发育树分析

将测序所得16S rDNA序列与核酸序列数据库中已知序列进行比对,选取相似性高的菌株序列构建系统发育树,结果如图3所示。可以较清晰地判断出5 株菌株的同源性:M1与肉食杆菌属中的Carnobacterium maltaromaticum LMA28的同源性最高;J1与假单胞菌属中的Pseudomonas syringae pv. syringae B728a的同源性最高;J4与假单胞菌属中的Pseudomonas fl uorescens SBW25的同源性最高;S2与肉食杆菌属中的Carnobacterium sp. WN1359最相似,但是在生理生化鉴定上为热死环丝菌属,且相似比例较低,由于分子鉴定结果和生理生化结果存在一定的差异,根据细菌鉴定原则,当分类鉴定出现差异时,以分子鉴定结果为主,形态、生理生化鉴定结果为辅 [22],因此S2应为麦芽糖肉食杆菌;T2与希瓦氏菌属中的Shewanella baltica OS678的同源性最高。

综合生理生化鉴定结果和16S rDNA测定结果,确定4 ℃贮运过程三文鱼的5 种致腐能力较强的腐败菌分别为M1麦芽糖肉食杆菌(Carnobacterium maltaromaticum LMA28)、J1丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. syringae B728a)、J4荧光假单胞菌(Pseudomonas fl uorescens SBW25)、S2肉食杆菌(Carnobacterium sp. WN1359)和T2波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica OS678)。

图3 基于16S rRNA序列同源性的5 株菌株的系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree of 5 strains based on their 16S rRNA gene analysis

2.3 致腐能力的测定结果

从图4可以看出,接菌组三文鱼的菌落总数在贮藏期间均明显高于对照组,在120 h时5 种菌的数量均已超过6(lg(CFU/g))。其中,荧光假单胞菌SBW25在贮藏48 h后保持着较高增长速率,48 h后菌落总数一直保持最高,在120 h已达到7(lg(CFU/g))。在贮藏初期接菌组和空白组的差异明显低于贮藏末期的差异,在贮藏第2天开始各接菌组的菌落总数明显高于空白组,表明挑选出的腐败菌都较好地适应了生长环境;在贮藏末期接菌组的微生物总数至少比对照组高1(lg(CFU/g))。荧光假单胞菌SBW25和丁香假单胞B728a菌虽同属于假单胞菌属且都具有较强的致腐能力,但两菌株的生长情况随着贮藏时间呈现出显著差异(P<0.05)。在0~48 h内,各组微生物总量都在快速增长中,未出现明显的延缓期,直接呈现出对数期的生长状态;各菌株在36~84 h内处于对数期,此时鱼肉中的生长环境特适合该菌株的生长,出现一个较明显的生长趋势。从96 h开始,各组的生长曲线趋于平缓,表示进入稳定期。波罗的海希瓦氏菌在贮藏末期才出现快速的增长,与DGGE图谱的条带12的亮度变化情况相似,表明波罗的海希瓦氏菌是三文鱼4 ℃条件下贮藏末期的优势腐败菌群。低温条件下各菌种的生长缓慢可能与生物体内各种化学反应的活性及酶活性降低有关 [23]

图4 接种优势腐败菌的三文鱼鱼肉在4 ℃贮藏条件下菌落总数的变化
Fig. 4 Total bacterial counts of salmon inoculated with dominant spoilage bacteria and stored at 4 ℃

图5 接种优势腐败菌的三文鱼鱼肉在4 ℃贮藏条件下TVB-N值的变化
Fig. 5 TVB-N of salmon inoculated with dominant spoilage bacteria and stored at 4 ℃

TVB-N值是指肉、鱼类样品浸液在弱碱性条件下能与水蒸气一起蒸馏出来的总氮量,可反映由微生物繁殖导致蛋白质的分解而形成的产物数量 [24]。接菌组和对照组的TVB-N值在120 h贮藏期间的变化见图5。通过TVB-N值随着贮藏时间延长而增长的线性变化,可看出各腐败菌对三文鱼的致腐能力具有显著差异。在120 h时,接种荧光假单胞菌SBW25的三文鱼样品TVB-N值达到36.96 mg/100 g,接种丁香假单胞菌B728a样品的TVB-N值达到32.27 mg/100 g,均已超过变质所规定的30 mg/100 g;而接种麦芽糖肉食杆菌LMA28、肉食杆菌WN1359和波罗的海希瓦氏菌OS678组相对于对照组并无显著差异,只是略微增长,分别较对照组高2.32、1.18 mg/100 g和0.85 mg/100 g。与图4菌落总数对比,腐败菌的生长和TVB-N值上升呈正相关,这与高磊等 [12]研究结论一致。

表5 各种优势腐败菌的TVB-N产量因子
Table 5 Yield factors of TVB-N of the dominant spoilage bacteria

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本研究将TVB-N值与菌落总数结合,进一步用TVB-N产量因子Y TVB-N/CFU定量表示各优势腐败菌的腐败能力 [6]。由表5可知,接种腐败菌荧光假单胞菌SBW25的Y TVB-N/CFU值为1.36×10 -7mg TVB-N/CFU,明显高于其他4 株,而接种腐败菌波罗的海希瓦氏菌OS678的Y TVB-N/CFU值最小,为1.03×10 -7mg TVB-N/CFU。结果表明,在4 ℃贮藏期间,腐败菌荧光假单胞菌SBW25对三文鱼的腐败能力较强,其次是麦芽糖肉食杆菌LMA28和丁香假单胞菌B728a,而肉食杆菌WN1359和波罗的海希瓦氏菌OS678腐败能力相对较弱。本实验腐败菌的TVB-N的产量因子最高达到1.36×10 -7mg TVB-N/CFU,高于丁婷等 [25]发现荧光假单胞菌TVB-N产量因子为6.36×10 -9mg TVB-N/CFU,这可能因本实验三文鱼贮藏温度为4 ℃,高于丁婷等 [25]三文鱼的贮藏温度(0 ℃)。

3 结 论

本研究通过PCR-DGGE技术、传统鉴定技术和PCR技术对4 ℃冷链贮运条件下的三文鱼的菌相变化进行了分析。

经DGGE图谱分析发现13 条变化显著的条带分别对应8 个菌属,其中假单胞菌所对应的6 条条带的亮度较明亮,且亮度随着贮藏时间的延长未出现显著减弱。表明假单胞菌属为4 ℃冷链温度贮运条件下三文鱼的优势腐败菌群。在贮藏末期,波罗的海希瓦氏菌亮度出现明显增强,这表明是波罗的海希瓦氏菌是三文鱼4 ℃条件下贮藏末期的优势菌群。

通过感官评分法筛选到的5 株三文鱼优势腐败菌,经生理生化鉴定和16S rDNA测定鉴定为麦芽糖肉食杆菌(Carnobacterium maltaromaticum LMA28)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. syringae B728a)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens SBW25)、肉食杆菌(Carnobacterium sp. WN1359)和波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica OS678)。通过对各优势腐败菌菌株的TVB-N产量因子的计算进一步确定这5 株菌株中荧光假单胞菌 SBW25对三文鱼的腐败能力最强。

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Detection of Microfl oral Changes in Salmon during Cold Chain Storage and Transport at 4 ℃ by PCR-DGGE and Phenotypic Analysis

ZHANG Xinlin, XIE Jing*, QIAN Yunfang, LIU Yongji, ZENG Danni
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing & Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Abstract:This study attempted to elucidate the bacterial spoilage mechanism of salmon during cold chain storage and transport at 4 ℃. Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE), the traditional identifi cation method and PCR were adopted to analyze the microfl ora changes in salmon during cold chain storage and transport at 4 ℃ and identify the specific spoilage organisms by testing the spoilage abilities of the dominant strains with yield factors. DGGE fi ngerprint showed that the diversity of bacterial species decreased during the cold storage of salmon, but the brightness of bands for Pseudomonas spp. and Shewanella spp. increased, which indicated that both strains became the predominant bacteria during the storage. Five dominant spoilage bacteria, Carnobacterium maltaromaticum LMA28, Pseudomonas syringae pv. syringae B728a, Pseudomonas fluorescens SBW25, Carnobacterium sp. WN1359 and Shewanella baltica OS678, were isolated and identified at the end of storage. After separately inoculating the 5 dominate spoilage organisms into sterilized salmon and refrigerating them for a certain period of time, their yield factors of TVB-N were 1.26 × 10 -7, 1.25 × 10 -7, 1.36 × 10 -7, 1.08 × 10 -7and 1.03 × 10 -7mg TVB-N/CFU, respectively. These results showed that P. fl uorescens SBW25 has the strongest spoilage ability for salmon, followed by C. maltaromaticum LMA28, P. syringae pv. syringae B728a, Carnobacterium sp. WN1359 and S. baltica OS678 successively.

Key words:salmon; microfl oral changes; special spoilage organisms (SSOs); Pseudomonas fl uorescens; spoilage ability

收稿日期:2016-05-09

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31571914);2016年上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字(2016)第1-1号);上海市科委研究中心能力提升项目(16DZ2280300)

作者简介:张新林(1990—),男,硕士研究生,研究方向为食品科学与工程。E-mail:zxl465308208@163.com

*通信作者:谢晶(1968—),女,教授,博士,研究方向为食品工程。E-mail:jxie@shou.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624043

中图分类号:TS254.4

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)24-0271-07

引文格式:

张新林, 谢晶, 钱韻芳, 等. PCR-DGGE法结合传统技术研究4 ℃冷链贮运条件下三文鱼菌相变化[J]. 食品科学, 2016, 37(24): 271-277. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624043. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Xinlin, XIE Jing, QIAN Yunfang, et al. Detection of microfl oral changes in salmon during cold chain storage and transport at 4 ℃ by PCR-DGGE and phenotypic analysis[J]. Food Science, 2016, 37(24): 271-277. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624043. http://www.spkx.net.cn