壳聚糖及其水溶性衍生物对小鼠免疫功能的影响

王志华 1,江阳阳 1,余晓华 1,颜永斌 2,*,覃彩芹 2

(1.湖北工程学院 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室,湖北 孝感 432000;2.湖北工程学院 生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室,湖北 孝 感 432000)

摘 要:给小鼠喂食壳聚糖(chitosan,CS)、羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan,CMCS)、壳聚糖季铵盐(quaternary ammonium salt of chitosan,HACC)和羟丙基壳聚糖(hydroxypropyl chitosan,HPCS)30 d后,测定其免疫器官指数、碳粒廓清速率、迟发型变态反应、血清溶血素含量(半数溶血值HC 50)。结果表明:摄食CS及其水溶性衍生物的小鼠以上指标均高于对照组;除胸腺指数和双耳质量差值外,HACC组小鼠其他各项免疫指标与对照组相比均呈显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01);同样,除胸腺指数外,HPCS组小鼠其他各项免疫指标均显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01);CMCS组小鼠的吞噬指数(K)和半数溶血值(HC 50)与对照组相比均呈显著差异(P<0.05);壳聚糖及其3 种水溶性衍生物都能够增强小鼠免疫功能,增强效果排序为HPCS>HACC>CMCS>CS,这可能与引入的化学基团不同有关。

关键词:壳聚糖;水溶性衍生物;免疫功能

壳聚糖(chitosan,CS)是天然多糖中唯一的阳离子聚合多糖,主要来源于节肢动物(虾、蟹)、软体动物的外壳以及真菌的细胞壁,是一种丰富的可再生资源 [1-2]。因其具有一些独特的生物活性,如抗微生物、抗氧化、增 强免 疫功能、调节血脂水平、抑制肿瘤等,CS被广泛应用于生物医药、食品工程等领域 [3-6]。自1983年美国食品和药物监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准CS作为食品添加剂以来,CS已被广泛用于食品工业中,多用于制成保健食品或作为食品添加剂和果汁保鲜剂 [7-9]。据文献报道,CS对小鼠非特异性免疫和特异免疫有明显 的促进作用,可活化自然杀伤(nat ural killer,NK)细胞以及调节杀伤性T细胞的免疫活性,增强机体免疫力 [10-11]。但CS不溶于水,使其应用受到了很大限制。CS经过化学修饰或降解为低聚物,其水溶性提高的同时,生物学活性也会发生改变。研究表明,水溶性的低分子质量CS能增强正常小鼠的免疫功能 [12];羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan,CMCS)通过增强小鼠免疫力抑制S180肿瘤细胞生长 [13];壳聚糖季铵盐(quaternary ammonium salt of chitosan,HACC)作为免疫佐剂可增强戊型肝炎病毒疫苗的免疫效果 [14]。水溶性羟丙基壳聚糖(hydroxypropyl c hitosan,HPCS)是CS的羟丙基化衍生物,对其应用和生物活性已开展了大量研究,如抗菌活性等 [15],但有关其免疫活性尚未见文献报道。本研究主要通过给小鼠摄食CS及其3 种水溶性衍生物,比较分析HPCS与CMCS、HACC对小鼠体内免疫功能的影响,初步探讨CS水溶性衍生物中不同功能基团对小鼠免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

CS(M w2.48×10 5D、脱乙酰度92%) 浙江金壳生物化学有限公司;CMCS、HACC和HPCS由本实验室在碱性条件下将CS与氯乙酸、环氧丙烷、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵进行化学反应制备 [16-18],其取代度分别为0. 81、0.72和0.79,重均分子质量(M w)分别为1.42×10 5、1.71×10 5、1.56×10 5D。

4 周龄清洁级雌性昆明小鼠,体质量18~22 g,小鼠及其食用的基础饲料均由湖北省实验动物中心提供。

二硝基氟苯(dinitrofluorobenzene,DNFB)为优级纯试剂,其他试剂均为 分析纯,由国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

Cary 60紫外-可见分光光度计 美国Agilent公司;TGL-16C台式离心机 上海安亭仪器厂;Impact 410 FTIR红外光谱仪 美国尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及处理

将50 只健康的雌性昆明小鼠适应饲养1 周,随机分为5 组:对照组小鼠喂食基础饲料,其他4 组小鼠分别喂食含质量分数1.5% CS、HACC、CMCS和HPCS的饲料。持续喂养期间自由饮水,每周称体质量,第31天将小鼠颈椎脱臼处死,取 出肝脏、脾脏和胸腺称质量。

1.3.2 CS及其水溶性衍生物的红外光谱扫描

取少量的CS及其水溶性衍生物样品,用红外光谱仪在4 000~400 cm −1波数范围内扫描,得到其红外光谱图。

1.3.3 碳粒廓清实验

将含CS、CMCS、HACC和HPCS的不同饲料和基础饲料持续喂养小鼠30 d后,尾静脉注射1∶4(V/V)稀释的印度墨汁0.1 mL/10 g(以体质量计,下同),注入后立即计时,并分别于2 min和10 min用抗凝过的平口毛细管从小鼠眼眶内眦静脉丛取血0.025 mL,加入到盛有2 mL 0.1%碳酸钠溶液的管中,以0.1%碳酸钠溶液为空白,于600 nm波长处测定吸光度(A 600 nm)。

1.3.4 小鼠血清溶血素抗体水平测定

将含CS、CMCS、HACC和HPCS的不同饲料和基础饲料持续喂养小鼠30 d。在实验结束3 d前,给小鼠腹腔注射0.2 mL 10%的绵羊红细胞(sheep red blood cell,SRBC),3 d后摘眼球取血,分离血清。将每组小鼠的血清混合于试管中,用生理盐水1∶1稀释。取稀释血清1 mL置于冰浴中,依次加入10% SRBC 0.25 mL、生理盐水1∶10(V/V)稀释的豚鼠血清1 mL,37 ℃水浴中孵育30 min,冰水浴终止反应,2 000 r/min离心10 min,取上清液1 mL,加都氏液3 mL混匀,10 min后于540 nm波长处测定吸光度,对照组以1 mL生理盐水代替样品血清。另设半数溶血管,取10% SRBC 0.125 mL加都氏液至4 mL混匀,10 min后于540 nm波长处测定吸光度,以半数溶血值(HC 50)判断血清溶血素抗体水平。

1.3.5 迟发型变态反应

将含CS、CMCS、HACC和HPCS的不同饲料和基础饲料持续喂养小鼠30 d。在实验结束6 d前,称取DNFB 50 mg,置于清洁干燥小瓶中,将预先配好的5 mL丙酮-麻油(1∶1,V/V)溶液倒入小瓶,混匀后,取DNFB溶液50 μL均匀涂抹在用硫化钡脱毛的4 个CS及其水溶性衍生物组和对照组小鼠腹部皮肤上(约3 cm×3 cm)致敏。5 d后,用DNFB溶液10 μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24 h颈椎脱臼处死小鼠,剪下左、右耳壳,用打孔器取下直径8 mm的耳片,称质量。

1.4 数据统计分析

所有数据以±s示,均采用SPSS 19.0统计学软件中的单因素方差分析(one-way analysis of variance,oneway ANOVA)进行数据处理,比较实验组与对照组间的差异。

2 结果与分析

2.1 CS及其水溶性衍生物的结构分析

CS及其水溶性衍生物的红外光谱如图1所示。与CS相比,CMCS在1 415 cm −1处出现—COOH对称伸缩振动吸收峰,而—COOH非对称伸缩振动吸收峰(1 720~1 550 cm −1)与乙酰氨基的特征吸收峰(1 645 cm −1)叠加,在1 580 cm −1处形成一个新的强吸收峰。HACC在1 482 cm −1处出现季铵基团的C—H弯曲振动的新吸收峰。HPCS在1 428 cm −1处出现一个较强的新吸收峰、在2 976 cm −1处出现一个新的吸收峰,这两处吸收峰分别归因于—CH 3的C—H伸缩振动和不对称变形,表明CS分子上连接有羟丙基基团。

图1 CS及其水溶性衍生物的红外光谱图
Fig.1 FT-IR spectra of chitosan and its derivatives

2.2 CS及其水溶性衍生物对小鼠体质量的影响

4 周龄小鼠摄食含质量分数1.5% CS、CMCS、HACC和HPCS的饲料,在实验期内活动、生长正常。CS及其水溶性衍生物对小鼠体质量的影响如表1所示。各组小鼠初始体质量相近,实验结束时,CS及其水溶性衍生物组小鼠体质量比对照组小鼠体质量略高,但无统计学意义。

表1 各组小鼠体质量的变化(x±s , n=10)
Table 1 Body weight changes of mice (x±s , n= 10)

组别初始体质量/g第7天体质量/g第14天体质量/g第21天体质量/g终体质量/g对照组21.11±1.5722.74±2.2125.74± 2.8228.19±3.8727.44±3.80 CS组20.12±1.4922.81±2.4325.37±2.6726.88±2.8126.88±2.79 CMCS组21.14±2.1522.16±2.3125.20±3.1827.73±4.0829.60±2.93 HACC组20.08±1.2523.34±2.7826.11±3.5627.74±3.2428.82±3.70 HPCS组19.59±1.7722.85±2.0325.30±2.6727.12±3.4830.10±4.48

2.3 CS及其水溶性衍生物对小鼠免疫器官指数的影响

摄食CS及其水溶性衍生物30 d后,各组小鼠的免疫器官指数如表2所示。免疫器官质量是反映机体免疫功能重要而直观的指标,CS及其水溶性衍生物组小鼠脾脏指数和胸腺指数均有所增加,尤其是HACC组和HPCS组小鼠 的脾脏指数与对照组相比差异显著(P<0.05),以上结果表明HACC和HPCS促进小鼠免疫功能的效果比CMCS、CS好。

表2 小鼠免疫器官指数(x± s =10)
Table 2 Immune organ index changes of mice (x± s , = 10)

注:a.与对照组相比,差异显著(P<0.05)。下同。

组别脾脏指数/(mg/g)胸腺指数/(mg/g)对照组4.29±0.712.07±0.20 CS组4.33±1.192.15±0.21 CMCS组5.29±1.172.22±0.39 HACC组5.63±1.44 a2.44±0.33 HPCS组6.09±0.91 a2.42±0.21

2.4 CS及其水溶性衍生物对小鼠单核巨噬细 胞吞噬功能的影响

表3 小鼠碳粒廓清速率 (x±s ,n = 10)
Table 3 Effect of chitosan and its derivatives on the carbon clearance rate in mice (x±s ,n = 10)

注:b. 与对照组相比,差异极显著(P<0.01)。

组别吞噬指数吞噬系数对照组0.025±0.0045.355±0.934 CS组0.031±0.0055.965±0.811 CMCS组0.034±0.004 a6.091±0.327 HACC组0.041±0.007 b6.935±0.810 bHPCS组0.038±0.003 b6.813±0.476 b

表3显示了CS及其水溶性衍生物对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响,CS及其水溶性衍生物组小鼠的吞噬指数(K)和吞噬系数(α)均高于对照组,其中HAC C组和HPCS组与对照组相比差异极显著(P<0.01),C MCS组小鼠的吞噬指数与对照组相比差异显著(P<0.05),以上结果表明CS衍生物能够促进小鼠巨噬细胞碳粒廓清功能。

2.5 CS及其水溶性衍生物对小鼠迟发型变态反应的影响

图2 CS及其水溶性衍生物对小鼠迟发型变态反应的影响
Fig.2 Effect of chitosan and its derivatives on mouse delayed type hypersensitivity (DTH)

CS及其水溶性衍生物对小鼠迟发型变态反应的影响如图2所示。DNFB致敏小鼠后,CS及其水溶性衍生物组小鼠的双耳质量差值均高于对照组,HPCS组与对照组相比差异显著(P<0.05),其他各组与对照组相比差异不明显(P>0.05),以上结果表明HPCS能够促进小鼠细胞免疫功能的恢复。

2.6 CS及其水溶性衍生物对小鼠血清溶血素水平的影响

图3 CS及其水溶性衍生物对小鼠血清溶血素的HHCC 5500的影响
Fig.3 Effect of chitosan and its derivatives on the content of serum hemolysin in mice

SRBC免疫小鼠后,B淋巴细胞受抗原刺激,分化为浆细胞,浆细胞产生抗体,其含量反映了小鼠特异性体液免疫的功能。由图3可知,CS及其水溶性衍生物均可提高小鼠血清溶血素的HC 50,与对照组比较,HACC、HPCS和CMCS均能显著或极显著提高小鼠血清溶血素含量(P<0.05或P<0.01),以上结果表明摄食CS及其水溶性衍生物有利于增强小鼠特异性体液免疫功能。

3 讨 论

免疫系统的功能是消除病原微生物,清除损伤、衰老及死亡的自身细胞,监视发生突变的细胞,维持机体内环境的稳定。现代社会中人们由于各种压力和饮食结构不合理,导致体内环境酸醎不平衡,免疫系统功能紊乱,诱发顽固性疾病的发生。CS天然无毒,其氨基可以结合H +、提高HCO 3 浓度,使体液pH值倾向弱碱性,激活巨噬细胞,为淋巴细胞(T细胞和B细胞)的激活提供适宜的环 境,提高机体免疫力,作为增强机 体免 疫功能的保健食品和药物开发有良好的发展前景。

本研究将CS通过化学修饰制备成水溶性的CMCS、HACC和HPCS,经元素分析,CMCS、HACC和HPCS的取代度相近,依次为0.81、0.72和0.79。小鼠摄食4 种CS及其水溶性衍生物后,通过 对其免疫器官指数和碳粒廓清指数、血清溶血素含量和迟发型变态反应等免疫指标分析 [19-21],发现4 种CS及其水溶性衍生物均能增强小鼠的免疫功能。但四者相比较,HPCS效果最好,其次是HACC,CMCS次之,CS效果较差,这暗示CS及其水溶性衍生物的免疫效果可能与引入的化学基团有关。CS不溶于水,这严重影响了其生物活性。从结构特征看,CS羟丙基化后,不仅其水溶性升高,同时易被消化道壁吸收降解,而且还使羟基的活性增加,分布到各组织细胞中,促进其与巨噬细胞和树突状细胞表面的膜受体(TLR4和甘露糖受体)结合 [22];经季铵基团修饰的CS,分子上正电荷密度增加,增强了其与带负电荷的淋巴细胞 的亲和性。两者通过不同方式活化巨噬细胞和树突细胞,尤其是树突细胞。活化的树突细胞会释放细胞因子、使膜主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)MHCⅡ分子表达量增加、T细胞活化;活化的T细胞释放细胞因子白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-10、肿瘤坏死因子-β(tumor necrosis factor-β,TNF-β)和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ),进一步活化其他免疫细胞,产生抗体和具有免疫活性的NK细胞、粒细胞等,增强机体的免疫力 [23-26];CMCS结构中含有—NH 2和—COOH,既带有正电荷又带有负电荷,削弱了其改变体液环境pH值的能力以及与带负电荷巨噬细胞的亲和性,因此其增强小鼠免疫功能的活性弱于HACC。从结构上推测化学修饰基团在免疫调节过程发挥着重要作用,CS及其水溶性衍生物调节免疫活性的机理还有待进一步深入研究。

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Effect of Chitosan and Its Water-Soluble Derivatives on Immune Function in Mice

WANG Zhihua 1, JIANG Yangyang 1, YU Xiaohua 1, YAN Yongbin 2,*, QIN Caiqin 2
(1. Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, China; 2. Hubei Key Laboratory of Biomass-Resource Chemistry and Environmental Biotechnology, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, Chin a)

Abs tract:The immune organ index, carbon clearance rate, delayed type hypersensitivity, and serum hemolysin (HC 50) in mice were compared and analyzed after the administration of chitosan (CS), carboxymethyl chitosan (CMCS), quaternary ammonium salt of chitosan (HACC) and hydroxypropyl chitosan (HPCS) for 30 days. The values of all investigated parameters were higher in mice administered with CS or its water-soluble derivatives compared with the control group. A significant difference (P < 0.05) or extremely significant difference (P < 0.01) in all immune inde xes except for thymus index and binaural weight difference was found for the HACC an d HPCS groups compared with the control group. Comparing the CMCS group with the control group, a significant difference in carbon clearance rate and the content of serum hemolysin (P < 0.05) was observed. These results indicated that the administration of chitosan and its water-soluble derivatives could enhance the immune function of mice in the decreasing order of HPCS > HACC > CMCS > CS. This may be associated with the introduction of chemical groups.

Key words:chitosan; water-soluble derivatives; immune function

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601035

中图分类号:O6 36.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)01-0198-05

引文 格式:

王志华, 江阳阳, 余晓华, 等. 壳聚糖及其水溶性衍生物对小鼠免疫功 能的影响[J]. 食品科学, 2016, 37(1): 198-202.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601035. http://www.spkx.net.cn

WANG Zhihua, JIANG Yangyang, YU Xiaohua, et al. Effect of chitosan and its water-soluble derivatives on immune function in mice[J]. Food Science, 2016, 37(1): 198-202. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201 601 035. ht tp://www.spkx.net.cn

收稿日期:2015-03-15

基金项目:湖北省教育厅科学技术研究项目(B2015037);国家自然科学基金面上项目(31371750)

作者简介:王志华(1973—),女,副教授,硕士,研究方向为动物生理。E-mail:wangzhihuay@126.com

*通信作者:颜永斌(1975—),男,副教授,博士,研究方向为天然高分子的转化与利用。E-mail:yybyan@163.com