王淑慧，龙立梅，宋沙沙，曹学丽 *
（北京工商大学食品学院，食品添加剂与配料北京市高等学校工程中心，北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048）
摘 要：采用高效液相色谱与高分辨质谱相结合的方法对西湖龙井、黄山毛峰和信阳毛尖3 种名优绿茶茶汤中的共有特征滋味成分进行研究，并据此进行种类判别分析。通过研究，确定了以表没食子儿茶素没食子酸酯、咖啡因、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素等为主的15 种共有特征滋味成分，并建立了其相应的特征指纹图谱。利用15 种共有特征成分峰的相对峰面积，建立了多元化典型判别函数，采用逐步判别分析技术对31 个绿茶样品进行了很好的种类判别，判别正确率为100%。
关键词：高效液相色谱；高分辨质谱；绿茶；滋味成分；指纹图谱；种类判别
茶叶为山茶科植物茶（Camellia sinensis Kuntze）的芽叶，经加工而成，其饮用历史悠久，药用价值显著 [1]。茶叶中的主要化学成分有多酚、咖啡碱、茶多糖、茶氨酸、碳水化合物和维生素等 [2]。研究 [3-4]显示绿茶中的儿茶素含量相对较高，对心血管疾病和几种类型癌症的预防有重要作用，尤其是儿茶素类中的表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）能降低人类被HIV病毒感染的风险等。适量摄入咖啡因可刺激中枢神经兴奋，有提神醒脑之功效 [5]。随着人们饮食结构的调整、对健康状况、食品安全的日益重视，其对茶叶品质的要求也越来越高。中国是茶叶的发源地，栽培历史悠久，种植幅员辽阔，种类繁多，制法工艺不断推陈出新，经过上千年的传承发展成就了今天中国茶叶种类的纷繁复杂、琳琅满目 [6-7]，因此对中国茶叶的分类也出现百家争鸣的现象，有些分类甚至出现互相矛盾的结果，目前还没有较为统一的茶叶分类方法，使茶叶市场出现了鱼目混珠、以次充好的现象。
由于受产地、环境、生长周期、生产工艺等因素的影响，不同品种的茶叶滋味组成有所差异 [8-11]，对茶叶的品质评定影响也较大，因此能够快速准确地发现不同品种绿茶之间滋味成分的差异对地理标志产品的保护、名优绿茶的真伪鉴别具有重要意义。本实验采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）指纹图谱技术对西湖龙井、黄山毛峰和信阳毛尖3 种名优绿茶31 个样品的茶汤特征滋味成分进行了分析，并利用逐步判别分析技术对不同绿茶种类进行了判别分析，为名优绿茶的品质评定和种类判别提供依据 [12-13]。
1.1 材料与试剂
供试茶样为2013年4—5月的春茶，分别为黄山毛峰2 种工艺3～4 个等级7 个样品由安徽谢裕大茶叶股份有限公司提供；西湖龙井御牌、贡牌和狮牌3 个品牌4 个等级12 个样品由杭州西湖区茶叶有限公司提供；信阳毛尖3 批4 个等级12 个样品由信阳市文新茶叶有限责任公司提供。样品用复合铝箔袋密封，保存于4 ℃冰箱冷藏，及时进行分析。
乙腈（色谱级） 美国Fisher科学公司；磷酸（色谱级） 天津光复精细化工研究所；标准样品（纯度均大于98%） 国家标准样品网（表1）。
表1 11种标准样品
Table 1 Eleven tea polyphenol standards
名称英文全称英文简写儿茶素catechinC表儿茶素epicatechinEC表儿茶素没食子酸酯(-)-epicatechin gallateECG表没食子儿茶素没食子酸酯(-)-epigallocatechin gallateEGCG表没食子儿茶素(-)-epigallocatechinEGC没食子儿茶素没食子酸酯(-)-gallocatechin gallateGCG没食子儿茶素(-)-gallocatechin GC L-茶氨酸L-theanineL-TN咖啡因caffineCAF没食子酸gallic acidGA可可碱theobromineTB
1.2 仪器与设备
1260 HPLC仪（配有四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器、Chem Station色谱工作站等）、ZORBAX SB-C 18色谱柱（50 mm×4.6 mm i.d.，1.8 μm） 美国Agilent公司；Diamonsil C 18（2）（200 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）色谱柱 北京迪马科技有限公司；UPLCXevo G2 QTOF HPLC联用仪、Atlantis T3 C 18色谱柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm） 美国Waters公司；150 mL景德镇陶瓷专业茶叶评审杯。
1.3 方法
1.3.1 茶汤制备
茶汤的制备按照GB/T 23776—2009《茶叶感官审评方法》 [14]冲泡绿茶的程序进行：称量3 g绿茶样品于150 mL评查杯中，倒入150 mL沸水，盖上杯盖冲泡5 min后，将茶汤滤出，待茶汤的温度降低后，取一定量的茶汤过0.22 μm滤膜，进行HPLC分析。
1.3.2 HPLC分析条件
在HPLC分析中，色谱柱的种类、流动相的组成、检测波长、柱温、流速等操作条件都会对分析产生影响。本实验参考文献[15-18]，采用基于C 18色谱柱和乙腈溶液为流动相，通过对流动相中酸性添加剂的种类和浓度、不同性能的C 18色谱柱及检测波长进行了优化，确立了绿茶茶汤滋味成分的HPLC分析方法。色谱柱：Waters-C 18（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流动相：0.04%磷酸（A）-乙腈（B）溶液；洗脱时间60 min；洗脱方式：梯度洗脱（0～60 min，4% B→25% B）；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL；检测波长210 nm。
1.3.3 3 种绿茶茶汤成分的定性分析
对茶汤特征成分的定性分析采用与标准样品保留时间比对和HPLC-高分辨质谱相结合的方式进行。
分别称量贡牌西湖龙井、信阳毛尖和黄山毛峰样品，按照1.3.1节中的方法制备茶汤，将得到的茶汤样品分别进行HPLC分析和HPLC-高分辩质谱分析。
质谱条件：离子源电压3.00 kV；离子源温度120 ℃；电离温度280 ℃；电离模式为正负2 种模式。
液相色谱条件：Waters-C 18色谱柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流动相：0.1%甲酸（A）-0.1%甲酸-乙腈（B）溶液；洗脱时间60 min；洗脱方式：梯度洗脱（0～60 min，4% B→25% B）；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。
1.3.4 指纹图谱建立的方法学考察
1.3.4.1 稳定性考察
精确称量3 g龙井茶1 份，150 mL沸水，加盖浸泡5 min，滤出茶汤，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h取样，进行HPLC分析，计算绿茶茶汤在24 h内共有峰的保留时间和绝对峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.3.4.2 精密度考察
取11 种单标配制而成的混标连续进样6 次，计算混标中11 种物质连续进样6 次后，保留时间和绝对峰面积的RSD。
精确称量3 g龙井茶1 份，150 mL沸水，加盖浸泡5 min，滤出茶汤，待茶汤温度降低后连续进样6 次，计算绿茶茶汤共有峰的保留时间和绝对峰面积的RSD。
1.3.4.3 重复性考察
称量同一绿茶茶样3 g黄山毛峰茶5 份，均加入150 mL沸水加盖浸泡5 min，滤出茶汤后，进行HPLC分析，每份连续进样3 次，计算5 份绿茶茶汤共有峰的保留时间和绝对峰面积的RSD。
1.3.5 3 种绿茶样品的种类判别分析
将31 个样品每个样品采用相同的茶汤制备方法和HPLC分析方法平行测试3 次，生成相应等级茶叶的对照色谱指纹图谱，并以对照色谱指纹图谱中峰面积最大之主峰作为参照，计算各共有峰的相对峰面积，以此作为原始数据，采用SPSS 20.0软件，使用步进式方法中的Wilks λ法进行逐步判别分析，建立判别方程，并对所建立的判别方程进行交叉验证分析，验证判别方程对初识分组的分类结果 [19-21]。
2.1 3 种绿茶茶汤成分的定性分析
将在同一色谱条件下得到的西湖龙井、信阳毛尖、黄山毛峰的HPLC图进行比较，如图1所示，初步确定了3 种绿茶的15 种共有成分。通过与11 种标样的HPLC图进行保留时间的比对，初步确定了其中1、3、5、6、7、8、9、11、12、13、15号峰所对应的11 种成分，而2、4、10、14号峰无法确定。
图1 11种标样和3种绿茶茶汤样品HPLC分析谱图
Fig.1 HPLC chromatograms of 11 tea polyphenol standards and three green tea samples
因此，又利用HPLC-高分辨质谱对11 种已初步定性的成分进行进一步确认，同时对其他4 种未知成分进行了定性，结果如表2所示。所确定的15 个成分为茶汤的主要成分，包括氨基酸类（L-TN）、多糖类（GAQ、TGG）、儿茶素类（GA、EGCG、ECG）、生物碱类（CAF、TB）等，使绿茶滋味呈现出苦涩兼具收敛性、鲜爽、甘甜、苦味、醇厚的口感，综合形成绿茶鲜醇柔和的滋味品质 [22-25]，而且具有多重的生理活性。因此，确定这15 种成分绿茶茶汤的特征共有成分。
表2 15种绿茶茶汤成分的特征信息
Table 2 HPLC-MS data of 15 compounds in green tea infusion
编号中文名称英文简写保留时间/min相对分子质量[M-H] -/[M+H] +（m/z）分子式1L-茶氨酸L-TN3.766174.20173.092 4/175.041 1 C 7H 14N 2O 32没食子葡萄糖GAQ7.172332.07331.066 4/—C 13H 16O 103没食子酸GA9.315170.12169.014 0/171.024 1C 7H 6O 54没食子奎尼酸GAQA9.700344.07343.066/—C 14H 16O 105可可碱TB14.132180.16—/181.072 4C 7H 8N 4O 26没食子儿茶素GC15.833306.27305.065 5/—C 15H 14O 77表没食子儿茶素EGC23.976306.27305.067 7/—C 15H 14O 78咖啡因CAF26.125194.19—/195.087 4C 8H 10N 4O 29儿茶素C26.765290.28289.071 3/—C 15H 14O 610水解的单宁酸ST28.771634.36633.075 6/—C 27H 22O 1811表儿茶素EC34.041290.27289.070 7/—C 15H 14O 612表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG35.235458.38457.076 6/—C 22H 18O 1113没食子儿茶素没食子酸酯GCG38.625458.37457.076 2/—C 22H 18O 1114三没食子酰葡萄糖TGG39.501636.07635.089 4/—C 27H 24O 1815表儿茶素没食子酸酯ECG47.372442.37441.082 6/—C 22H 18O 10
2.2 指纹图谱建立的方法学考察结果
15 种茶汤滋味成分在浸泡后的0、2、4、6、8、10、12、24 h内所得的色谱峰的保留时间RSD小于0.3%，峰面积RSD小于5%，说明茶样在24 h内保持稳定；11 种单标配制成的混标连续进样6 次所得色谱峰的保留时间RSD小于0.3%，峰面积的RSD小于3%，说明仪器的精密度良好；制备的茶汤样品连续进样6 次所得色谱峰保留时间RSD小于0.3%，峰面积RSD小于3%，符合指纹图谱建立的要求；同一黄山毛峰茶样取5 份进行HPLC分析，所得15 个峰的保留时间RSD小于0.3%，峰面积RSD小于5%，符合指纹图谱建立的指标要求。
2.3 3 种绿茶的判别分析
以15 个共有峰的相对峰面积作为原始数据，分别设为变量X 1、X 2……X 15，根据SPSS 20.0计算的非标准化判别函数系数（F），得到的判别方程组为：
式中：X 1、X 4、X 8、X 10、X 13分别代表不同保留时间色谱峰的相对峰面积。
判别函数F 1、F 2的特征值分别为81.717和23.222，第1个函数解释了所有变异的77.9%，第2个函数解释了余下的22.1%，典型相关系数分别为0.994和0.979，Wilks’Lambda数据对判别函数的统计学意义进行检验，结果显示2 个判别函数（P＜0.05）均有统计学意义。从分类结果表可知，在31 个茶样中，该方法对初始分组样品进行了100%正确分类，对交叉验证分组样品进行了100%正确分类。各样品判别函数得分值如图2所示，判别分类效果较好。同一品种不同等级的茶叶能实现很好的归类，表明采用绿茶滋味特征成分可以对绿茶的种类进行很好地分类判别。
图2 3种绿茶滋味特征成分的判别分析
Fig.2 Discrimination and classification of characteristic flavor components of three kinds of green tea
本实验采用HPLC及HPLC-高分辨质谱相结合的方法对西湖龙井、黄山毛峰和信阳毛尖3 种绿茶的滋味成分进行了分析研究，确定了L-TN、GAQ、GA、GAQA、TB、GC、EGC、CAF、C、ST、EC、EGCG、GCG、TGG和ECG 15 种共有特征滋味成分。但是由于其品种、产地、加工工艺的不同，各滋味成分的相对含量有所差异，表现出不同的滋味特征指纹图谱。根据3 种绿茶15 种共有特征滋味成分的含量差异，通过多元统计分析计算很好地实现了不同茶叶种类的判别，其准确率达到100%。这对于地理标志产品的保护、名优绿茶的真伪鉴别等具有重要意义和参考价值。
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Analysis of Characteristic Flavor Components and Cultivar Discrimination of Three Varieties of Famous Green Tea
WANG Shuhui, LONG Limei, SONG Shasha, CAO Xueli*
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)
Abstract：High performance liquid chromatography (HPLC) in combination with high-resolution mass spectrometry (HRMS) was employed to analyze the characteristic flavor components of three kinds of famous Chinese green tea, including Xihu Longjing, Huangshan Maofeng and Xinyang Maojian, and their fingerprints were established for variety discrimination. As the results, 15 common characteristic flavor components were identified in the three kinds of green tea, which included epigallocatechin gallate (EGCG), caffine (CAF), epicatechin gallate (ECG), and epigallocatechin (EGC) etc. Based on the diversified typical discriminant functions established using the relative peak areas of 15 common characteristic flavor compounds, 31 green tea samples were discriminated into three categories with an accuracy of 100% through stepwise discriminant analysis.
Key words：high performance liquid chromatography (HPLC); high-resolution mass spectrometry (HRMS); green tea; flavor components; fingerprint; variety discrimination
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201602022
中图分类号：TS272.5
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）02-0128-04
引文格式：
王淑慧, 龙立梅, 宋沙沙, 等. 3 种名优绿茶的特征滋味成分研究及种类判别[J]. 食品科学, 2016, 37(2): 128-131. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602022. http://www.spkx.net.cn
WANG Shuhui, LONG Limei, SONG Shasha, et al. Analysis of characteristic flavor components and cultivar discrimination of three varieties of famous green tea[J]. Food Science, 2016, 37(2): 128-131. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602022. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2015-04-16
基金项目：国家质量监督检验检疫总局公益性行业科研专项（201310230）；北京工商大学研究生科研学术创新基金重点项目
作者简介：王淑慧（1990—），女，硕士研究生，研究方向为生物分离工程。E-mail：journeyshu@163.com
*通信作者：曹学丽（1967—），女，教授，博士，研究方向为生物分离和分析。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn