金泽林，金太花*
（临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276005）
摘 要：为改善模拟干酪的品质，首先研究了乳化盐种类、温度及pH值对酶凝干酪素溶胶性的影响，然后结合扫描电子显微镜观察确定乳酸发酵前酶凝干酪素的最低乳化盐添加量，最后进行发酵模拟干酪感官品质和微观结构的对比分析。结果表明：5 种乳化盐对酶凝干酪素的溶胶能力依次为五聚磷酸钠＞六偏磷酸钠＞JOHA PZ 7复合乳化盐＞柠檬酸钠＞焦磷酸四钠；从25～42 ℃变化范围内，酶凝干酪素的溶解度随温度的升高而增加且增加速率较大，而从42～85 ℃变化范围内，增加速率较小；从pH 5.5～11.5变化范围内，溶解度随pH值的升高而明显增加；发酵时最低乳化盐添加比例为：m（酶凝干酪素）∶m（五聚磷酸钠）∶V（水）=1 g∶25 mg∶2.5 mL；发酵模拟干酪的风味评定分数与感官评定总分均明显高于普通模拟干酪。因此，发酵模拟干酪不仅具备了模拟干酪应具有的外观与质构特征，且克服了普通模拟干酪固有的风味缺陷。
关键词：酶凝干酪素；溶胶性；乳酸发酵；模拟干酪；微观结构
酶凝干酪素（rennet casein）是以脱脂乳为原料，添加凝乳酶使乳中的酪蛋白凝聚，经脱水干燥而成的干酪素，主要用于仿制干酪的生产 [1-4]。其生产原理是凝乳酶切断酪蛋白胶束的“外套”κ-酪蛋白中105与106位氨基酸间的肽键，使整个酪蛋白胶束失去稳定性，形成副酪蛋白微粒。副酪蛋白在钙离子的“桥梁”作用下， 进一步发生团聚形成不溶性凝块 [5]。因此酶凝干酪素的主要成分实际上就是副酪蛋白-钙（Ca-paracaseinate）。
模拟干酪（imitation cheese）是以各种食用油脂（植物油脂、乳脂肪等）、蛋白质（酶凝干酪素、酪蛋白酸钠、大豆蛋白等）、水为主要原料，在乳化盐的作用下，经加热、剪切形成的一种光滑均匀的类似于天然干酪的产品，是天然干酪的替代品 [6-7]。其中，以酶凝干酪素为蛋白源，以植物油脂为脂肪源最为常见 [8]。目前天然干酪作为麦当劳、肯德基等西方快餐食品的主要配料，需求量日益增加，不仅导致干酪的供应紧张，而且提高了快餐食品的成本。因此模拟干酪以其成本低廉、工艺简单的特点日益得到关注 [7-12]。但由于酶凝干酪素中含有吲哚、邻甲氧基苯酚、对甲苯酚等臭源物质，具有一种令人不快的异味 [13]，特别是在加热过程中会产生其特有的异臭，从而影响模拟干酪产品的风味，使市场竞争力受到严重影响。因此，要改善模拟干酪的风味，首先应去除其蛋白质源——酶凝干酪素的异味。
目前，国内外关于改善模拟干酪风味方面的研究较少，为了克服模拟干酪的风味缺陷，一般采用添加香精、香料的方法 [14-15]、模拟干酪热加工后添加菌种进行成熟 [16]或原料混合物中添加其他发酵食物增容液的方法来弥补 [17]。本实验拟利用乳酸发酵法去除酶凝干酪素异臭以改善模拟干酪的风味，首先进行酶凝干酪素的溶胶性实验，以此为依据确定发酵用乳化盐、最低乳化盐添加量及发酵pH值范围，并进行酶凝干酪素溶胶质混合物的发酵。再用该发酵混合物制造模拟干酪（以下简称为发酵模拟干酪），并观察该模拟干酪的感官品质与微观结构，探讨发酵去除酶凝干酪素异臭，以改善模拟干酪风味的可行性。
1.1 材料、菌种与试剂
酶凝干酪素粉 荷兰Habero公司；BekSul牌（韩国）大豆油 市售。
保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌 丹麦科汉森公司。
焦磷酸四钠、柠檬酸钠（分析纯） 美国Sigma公司；五聚磷酸钠（分析纯） 法国Rhone Poulenc公司；大豆磷脂、乳糖、六偏磷酸钠（分析纯） 日本Junsei公司；JOHA PZ 7（复合乳化盐） 日本BK Giulini Chemie公司。
1.2 仪器与设备
HM-17MX食品用笔式pH测定仪 日本DKK-TOA公司；BS-21恒温振荡水槽 韩国JEIO TECH公司；JSM 6400电子显微镜 日本东京JEOL公司；CI-4C恒温培养箱 韩国宇宙科学公司；GH-252电子天平 日本AND公司。
1.3 方法
1.3.1 酶凝干酪素溶胶的配制
准确称取1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 g的酶凝干酪素置于250 mL旋盖三角瓶中，分别加入0.1 mol/L焦磷酸四钠、柠檬酸钠、五聚磷酸钠、六偏磷酸钠、JOHA PZ 7乳化盐溶液100 mL，使质量浓度分别达到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 g/100 mL，并在水槽中常温振摇5 h，达到溶解平衡。取出静置3 h后观察其溶液的状态。
1.3.2 环境因素对酶凝干酪素溶胶性的影响分析
1.3.2.1 温度对酶凝干酪素溶胶性的影响
称取过量的酶凝干酪素置于250 mL旋盖三角瓶中，分别加入0.005 mol/L的五聚磷酸钠溶液100 mL，分别于25、42、60、85 ℃恒温水槽中振荡5 h，取出静置，等到未溶固体都沉到容器底部后，准确吸取10 mL的上部饱和胶体溶液，置于已称好的称量瓶中，放入烘箱中烘干，采用常规干物质测定方法测干物质质量。
1.3.2.2 pH值对酶凝干酪素溶胶性的影响
称取过量的酶凝干酪素置于250 mL旋盖三角瓶中，分别加入pH值为5.5、7.5、9.5、11.5的0.005 mol/L五聚磷酸钠溶液100 mL，于30 ℃恒温振荡水槽振摇5 h，后续方法与1.3.2.1节相同。
1.3.3 乳化盐浓度对酶凝干酪素溶胶性的影响
将10 g酶凝干酪素置于50 mL烧杯中，分别加入不同浓度的五聚磷酸钠溶液25 mL，搅拌均匀，室温放置60 min。取出少量混合物揉搓观察溶胶状态：可挤出水分，颗粒粗糙不结合则视为未溶胶；不出水分，黏结但稍粗糙则视为溶胶不完全；不出水分，物料黏结、较透明、光滑则视为完全溶胶。
1.3.4 发酵模拟干酪的配方及加工工艺流程
往含有53.75 g水、21.50 g植物油、0.32 g大豆磷脂的植物油乳化液中依次加入0.54 g五聚磷酸钠、6 g乳糖、3 mL工作发酵剂和21.5 g酶凝干酪素粉，经搅拌均匀压平后，置于42 ℃恒温培养箱中进行乳酸发酵。发酵过程中适时滴加2 mol/L的NaOH溶液，并搅拌使pH值保持在6～7之间。经8 h后终止发酵并加入2.46 g六偏磷酸钠，混合均匀，90 ℃左右热搅拌后装模成型，冷藏待用。
1.3.5 模拟干酪感官评定方法
请9 位食品专业研究人员，对发酵模拟干酪与未发酵模拟干酪，从外观、质地、风味等指标进行感官评定，总分值为100 分，根据各指标对成品的重要程度，确定其相应的分值比例 [17]，具体评定标准见表1。
表1 模拟干酪感官评定标准
Table1 Criteria for sensory evaluation of imitation cheese
具油脂味，无奶香，并带有令人不快的加热臭（20～33 分）不平整、不光滑，干燥或湿润，颜色不均匀（＜18 分）具清淡奶香味，后味香浓，无异味（34～40 分）基本平整，略干燥或略湿润，颜色稍不均匀（18～25 分）外观（30 分）质地（30 分）风味（40 分）平整、光滑，颜色均匀（26～30 分）致密均一、细腻，软硬适度，有可塑性（26～30 分）致密均一、细腻，偏硬或偏软，有可塑性（18～25 分）质地不均一，过硬或过软，可塑性差（＜18）具氧化味或异常发酵味，并带有明显的异臭（＜20 分）
1.3.6 微观结构的观察
使用扫描电子显微镜（s c a n n i n g e l e c t r o n microscope，SEM）对比观察发酵模拟干酪和普通模拟干酪的微观结构，并对比观察最低乳化盐添加量及零盐量处理后的酶凝干酪素的微观结构。
1.4 数据统计处理
本实验设3 次重复，采用SAS软件进行方差分析和显著性检验，显著水平设为0.01。
2.1 不同乳化盐对酶凝干酪素溶胶性的影响
酶凝干酪素又称为副酪蛋白-钙，在乳化盐的离子交换作用下，副酪蛋白-钙中的钙离子被乳化盐中的钠离子所取代，由不溶的副酪蛋白-钙变成可溶性的副酪蛋白-钠（Na-paracaseinate） [7,18-20]。可见乳化盐分离钙的能力与其溶解蛋白质的能力紧密相关 [18]。
表2 不同添加量的酶凝干酪素在各种乳化盐溶液中的状态
Table2 States of rennet casein at different concentration levels in aqueous solutions of various emulsifying salts
酶凝干酪素添加量/（g/100 mL）12345678910五聚磷酸钠溶液溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶六偏磷酸钠溶液溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶静置、分层JOHA PZ 7溶液 溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶溶胶静置、分层静置、分层静置、分层静置、分层焦磷酸四钠溶液溶胶静置、分层静置、分层柠檬酸钠溶液溶胶溶胶溶胶溶胶静置、分层静置、分层静置、分层静置、分层静置、分层静置、分层静置、分层静置、分层静置、分层静置、分层静置、分层静置、分层静置、分层
由表2可知，5 种乳化盐溶液在相同条件下促进酶凝干酪素形成溶胶的能力依次为五聚磷酸钠＞六偏磷酸钠＞JOHA PZ 7＞柠檬酸钠＞焦磷酸四钠。武晗等 [20]认为，乳化盐中的磷酸根离子数量直接影响到其钙螯合能力。本实验五聚磷酸钠促溶胶能力明显高于其他乳化盐，可能就是因为其分子中有5 个磷酸根，使得该盐具有很强的螯合钙能力。而考虑了乳化盐的各种作用得到的复合盐 JOHA PZ 7，反而在蛋白质溶胶这一单方面的能力表现得并不很强。另外，据Abdel-Hamid等 [21]报道，各种乳化盐都具有离子交换、促进水合、乳化以及调整pH值等功能。作为一种常用的非磷酸根乳化盐——柠檬酸钠（枸橼酸钠）溶解酪蛋白的原理，可能是由于其分子中含有枸橼酸根离子。枸橼酸根具有离子交换（螯合钙）能力。因此，也是通过钙螯合作用溶解酶凝干酪素 [2]。本实验将蛋白质溶解能力最强的五聚磷酸钠作为酶凝干酪素的乳化盐。
2.2 环境因素对酶凝干酪素溶胶性的影响
2.2.1 温度的影响
图1 温度对酶凝干酪素溶解度的影响
Fig.1 Effect of temperature on the solubility of rennet casein
由图1可知，酶凝干酪素在不同温度下，在一定浓度五聚磷酸钠溶液中的溶解度随着温度的增加而成非线性增加。这是因为较高的温度有利于酶凝干酪素分子结构的伸展状态，从而促进酶凝干酪素的溶解 [2]，图中曲线的斜率先大后小，即在较低温度范围（25～42 ℃）内，溶解度的变化速率较大，说明温度的变化对酪蛋白溶解度影响较大；在较高温度范围（42～85 ℃）内，溶解度的变化速率较小，说明温度的变化对酪蛋白溶解度的影响相对变小。可见本实验中常温（25 ℃左右）下已溶胶的酶凝干酪素不会在更高的温度（发酵温度42 ℃）下发生沉淀。
2.2.2 pH值的影响
图2 pH值对酶凝干酪素溶解度的影响
Fig.2 Effect of pH on the solubility of rennet casein
由图2可知，在pH 5.5～11.5内，酶凝干酪素的溶解度随pH值的升高而增加。这是由于pH值可以改变蛋白质的结构、蛋白质的溶解性和乳化盐与钙的结合效率，当pH值增加时，蛋白质的溶解度增加 [22]。Go等 [19]也曾报道，酪蛋白不溶于水，但可溶于pH 9.5以上的碱性水溶液中。这些结果与本实验的研究结果相符。图中曲线的斜率变化缓慢，图像几乎呈线性关系。说明pH值的变化对酪蛋白的溶解度影响显著。据莫蓓红 [22]报道，当周围溶液的pH值接近等电点时，蛋白质中正电荷和负电荷在溶液中离子的影响下会逐渐趋于平衡，当pH值处于等电点时，蛋白质的电荷正好平衡，由于异性电荷相吸引，蛋白质卷曲起来并达到最小溶解度。图中pH 5.5时其溶解度表现最低，是由于该pH值最接近酪蛋白的等电点（pH 4.6）。可见本实验中由于乳酸发酵引起的酸性化会使已溶胶的酶凝干酪素重新沉淀。因此，应采取添加碱性溶液的方法，使发酵过程中酶凝干酪素混合物的pH值保持在一定范围内，防止酶凝干酪素溶胶质的大量沉淀析出。
2.3 酶凝干酪素发酵时乳化盐最低添加量的确定
2.3.1 混合原料中水分含量的确定
在乳化盐的离子交换作用下，疏水性的副酪蛋白-钙被转化成亲水性的副酪蛋白-钠，吸收大量的水分，锁定在蛋白质内部 [23]，因此再制干酪生产中若水分含量过低会导致乳化盐的乳化效果不强，整个干酪体系的乳化状态不理想 [24]。当水分含量小于40%时，其制品的组织结构粗糙，口感较差 [23]；另一方面，酪蛋白的网络结构只能和一定量的水分结合，当水分含量超出酪蛋白网络结构所能承载的能力时，就会导致自由水含量的增加 [24]，因此当再制干酪加工中水分含量大于55%时，其制品的组织结构就会变得很松散而弹性较差，当水分含量在40%～50%之间时，制品的组织结构致密而细腻，有较好的弹性和口感 [23]。因此本实验考虑到模拟干酪热加工过程中部分水分的蒸发，将混合原料中酶凝干酪素与水分的配比确定为：m（酶凝干酪素）∶V（水）=1 g∶2.5 mL，使模拟干酪装模成品中的水分含量约达到50%。
2.3.2 盐浓度对溶胶性的影响及最低乳化盐添加量的筛选
表3 不同浓度的五聚磷酸钠溶液对酶凝干酪素溶胶性的影响
Table3 Effect of different concentrations of sodium pentapolyphosphate on sol properties of rennet casein
五聚磷酸钠溶液浓度/（10 －3mol/L）11.513.014.516.017.519.0酶凝干酪素状态不溶胶不溶胶溶胶不完全溶胶不完全完全溶胶完全溶胶
由表3可知，将相同体积、不同浓度的五聚磷酸钠溶液添加到一定质量的酶凝干酪素时，随着盐溶液浓度的增高其溶胶性也逐渐增加，当浓度达为17.5×10 －3mol/L时，酶凝干酪素已经完全溶胶。据司炜等 [25]报道，再制干酪加工中，如果乳化盐的添加量过少，则其乳化效果不好，溶液里还有未溶解的酪蛋白颗粒。张书义 [26]曾报道再制干酪加工过程中若乳化盐使用量过多，则酪蛋白凝聚成“布丁样”浓厚、硬质的组织状态，这一过程就叫“乳化过度”。这意味着乳化盐的使用量过多或过少均达不到酪蛋白正常溶胶的目的。因此在酪蛋白的溶胶过程中找出适合的乳化盐添加量尤为重要。本实验综合考虑到酪蛋白的正常溶胶和乳化盐的节约两方面，将17.5×10 －3mol/L初选为发酵前最低乳化盐浓度，将其换算成溶胶每克酶凝干酪素所需最低乳化盐的质量，可得知最低乳化盐添加比例为：m（酶凝干酪素）∶m（五聚磷酸钠）∶V（水）=1 g∶25 mg∶2.5 mL。
2.3.3 乳化盐对酶凝干酪素微观结构的影响
为直观地观察乳化盐对酶凝干酪素微观结构的影响，以及最低乳化盐添加量的作用下酶凝干酪素的溶胶状态与全部乳化盐含量的作用下酶凝干酪素的“乳化过度”状态，使用SEM对比观察零盐添加量（m（酶凝干酪素）∶m（五聚磷酸钠）∶V（水）=1 g∶0 mg∶2.5 mL）、发酵时最低乳化盐添加量（m（酶凝干酪素）∶m（五聚磷酸钠）∶V（水）=1 g∶25 mg∶2.5 mL）以及全部乳化盐添加量（m（酶凝干酪素）∶m（五聚磷酸钠）∶V（水）= 1 g∶140 mg∶2.5 mL）处理后酶凝干酪素的微观结构。全部乳化盐添加量的确定，是模拟干酪加工过程中所需要的全部乳化盐添加量，约为模拟干酪成品质量的3%。
图3 不同乳化盐添加量处理酶凝干酪素的微观结构
Fig.3 Microstructure of rennet casein with and without the addition of emulsifying salts
由图3可知，零盐添加量的酶凝干酪素在较低的放大倍数（×200）下就能明显看出粗大颗粒且形状不规则，粒子之间未结合而间隙大。最低乳化盐添加量的酶凝干酪素和全部乳化盐添加量的酶凝干酪素在较高的放大倍数（×1 000）下也呈现出无颗粒感的细腻的组织状态。这说明在乳化盐的作用下酶凝干酪素颗粒溶解，形成溶胶。其中，图3B组织黏结而不紧，呈现出“良好”的乳化状态，而图3C组织黏结紧密、坚实，呈现出“过度”的乳化状态。该观察结果进一步证实了最低乳化盐添加量的筛选实验结果。
2.4 乳酸发酵对模拟干酪品质的影响
2.4.1 对感官品质的影响
为探讨对混合原料的乳酸发酵是否改善模拟干酪的感官品质，将发酵模拟干酪和普通模拟干酪进行比较。由表4可知，发酵模拟干酪和普通模拟干酪在外观及质地评定分数方面两者之间均差异不显著（P＞0.05），但在风味评定分数和感官评定总分上两者之间均有显著差异（P＜0.01）。说明2 种模拟干酪在外观及质地上几乎没有差别，但在风味上两者之间具有本质的差别，从而导致2 种模拟干酪感官品质的明显差异。风味缺陷是仿制干酪的最大天然缺陷 [27]，仿制干酪的风味很难和天然干酪相媲美 [11,27]。发酵模拟干酪在风味上具有清淡的奶香味，鼻腔中有后香，且无异味，克服了普通模拟干酪所固有的风味缺陷。一方面原因可能是由于乳酸菌产生的氨基氧化酶和分解硫化物的酶类将酶凝干酪素的臭源——吲哚化合物氧化成无毒、无臭的物质 [16]，另一方面可能是通过乳酸发酵而产生的芳香物质掩盖了酶凝干酪素的异臭 [17]所致。
表4 发酵模拟干酪与普通模拟干酪的感官评分结果
Table4 Sensory evaluation of imitation cheese with and without fermentaattiioonn
注：同列小写字母不同表示差异极显著（P＜0.01）。
样品外观 质地 风味 总分普通模拟干酪27.8±1.0 a26.9±0.8 a25.9±0.7 a80.6±1.9 a发酵模拟干酪27.1±0.8 a27.2±0.7 a36.2±0.9 b90.5±2.0 b
2.4.2 对微观结构的影响
干酪的微观结构是形成干酪功能特性（硬度、弹性、拉丝性、溶化性、涂抹性等）的内因，因此微观结构是研究与区别干酪的重要手段之一 [27]。为了推断混合原料的乳酸发酵对模拟干酪功能特性的影响，本实验利用扫描电镜对比观察发酵模拟干酪与普通模拟干酪的微观结构，结果如图4所示，发酵模拟干酪的微观结构与普通模拟干酪的微观结构之间无明显的差异，但比普通模拟干酪的气孔相对少一些。李晓东等 [11]研究表明，在模拟干酪加工中，搅拌时会混入空气，在装模成型时，若挤压力不够，干酪会有很多气孔。本实验2 种模拟干酪微观结构中有不同数量的气孔出现，可能也是由此原因导致的。这一结果符合表4所示的2 种模拟干酪质地无明显差异的结果，同时也意味着对混合原料的发酵不会影响模拟干酪原有的功能特性。
图4 发酵模拟干酪（A）与普通模拟干酪（B）的微观结构（×1 000）
Fig.4 Microstructure of imitaattiioonn cheese with (A) and without (B) fermentation (×1 000)
5 种乳化盐中五聚磷酸钠的蛋白质溶解能力最强，因此将该乳化盐作为酶凝干酪素的发酵用乳化盐。发酵时最低乳化盐添加比例为m（酶凝干酪素）：m（五聚磷酸钠）∶V（水）=1 g∶25 mg∶2.5 mL。发酵温度不会使室温下已溶胶的酶凝干酪素重新被沉淀，但乳酸发酵会使pH值下降，导致部分酶凝干酪素溶胶质重新沉淀，因此在发酵过程中要适时采取中和措施，防止溶胶质的大量沉淀及乳酸菌活性的减弱。发酵模拟干酪具有与普通模拟干酪具有相似的外观与质地，但在风味上克服了普通模拟干酪固有的风味缺陷。可见采用乳酸发酵法改善模拟干酪的品质具有一定的可行性。为进一步明确乳酸发酵克服模拟干酪风味缺陷的作用机理，有必要对发酵混合物的气味物质进行更为深入的研究。
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Effects of Sol Properties and Fermentation of Rennet Casein on Quality of Imitation Cheese
JIN Zelin, JIN Taihua*
(College of Life Science, Linyi University, Linyi 276005, China)
Abstract：In order to improve the quality of imitation cheese, the effects of emulsifying salts, temperature and pH on sol properties of rennet casein were explored, the minimum amount of emulsifying salt added before lactic acid fermentation was determined, and the sensory quality and microstructure of the resulting cheese were analyzed. The results indicated that the effect of five emulsifying salts on sol properties of rennet casein followed the decreasing order: sodium pentapolyphosphate > sodium hexametaphosphate > JOHA PZ 7 > trisodium citrate dehydrate > tetrasodium pyrophosphate. In the range of 25–42 ℃, the solubility of rennet casein rapidly increased with an increase in temperature, whereas the increase was slower as the temperature continued to increase to 85 ℃. As the pH increased from 5.5 to 11.5, the solubility significantly increased. The minimum amount of emulsifying salt added to re nnet casein was a rennet case in:sodium pentapolyphosphate:water ratio of 1 g:25 mg:2.5 mL. The fermented imitation cheese scored much higher than the ordinary one (unfermented) in sensory scores for both flavor and overall quality. Therefore, the imitation cheese obtained in this study not only had desirable appearance and texture characteristics, but also overcame the intrinsic flavor defects of ordinary imitation cheese.
Key words：rennet casein; sol properties; lactic acid fermentation; imitation cheese; microstructure
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201603016
中图分类号：TS252.53
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）03-0081-06
引文格式：
金泽林, 金太花. 酶凝干酪素溶胶性及发酵对模拟干酪品质的影响[J]. 食品科学, 2016, 37(3): 81-86. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603016. http://www.spkx.net.cn
JIN Zelin, JIN Taihua. Effects of sol properties and fermentation of rennet casein on quality of imitation cheese[J]. Food Science, 2016, 37(3): 81-86. (in Chinese with English abstract) DOI: 10.7506/spkx1002-6630-201603016. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2015-03-18
基金项目：临沂大学博士科研启动基金项目（LYDX2013BS069）
作者简介：金泽林（1974—），男，讲师，博士，研究方向为乳制品加工。E-mail：zelinjin@163.com
*通信作者：金太花（1973—），女，讲师，博士，研究方向为乳制品加工。E-mail：taihuajin@163.com