暗纹东方鲀肌肉组织蛋白酶B提取工艺优化

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

摘要：为获得暗纹东方鲀组织蛋白酶B的最佳提取工艺条件，在单因素试验的基础上，通过Plackett-Burman设计对影响组织蛋白酶B活力的因素进行筛选，结果表明：料液比、磷酸盐缓冲液pH值和硫酸铵饱和度这3 个因素显著影响酶活力，然后用响应面分析法确定了主要影响因素的最佳提取条件为：料液比1∶2.1、磷酸盐缓冲液pH 7.0、硫酸铵饱和度99.2%，在此条件下组织蛋白酶B活力的预测值为32.65 U/g，实测值为32.52 U/g，相对误差为0.39%。说明建立的模型切实可行，为进一步研究组织蛋白酶B的提取工艺提供理论依据。

关键词：暗纹东方鲀；组织蛋白酶B；Plackett-Burman设计；响应面分析法

暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）隶属于鲀形目，鲀科，东方鲀属，俗称河鲀、河豚，属江海洄游性鱼类，其味道鲜美，肉质细腻，营养丰富 [1-2]，为“长江三鲜”之一。暗纹东方鲀经过几代淡水养殖，毒性逐渐降低，可供安全食用 [3]，广受国内外消费者的欢迎，具有广阔的市场前景和经济价值。内源蛋白酶是引起蛋白质水解的重要因素 [4]，对食品的风味产生也具有一定贡献 [5]。蛋白质降解主要由组织蛋白酶、钙激活蛋白酶、氨肽酶等内源蛋白酶引起的 [6-8]，其中组织蛋白酶的作用尤为重要，目前已从许多动物肌肉或内脏中分离纯化出多种组织蛋白酶 [9-11]，在众多组织蛋白酶中，组织蛋白酶B是活性较强的一种酶 [12-13]，研究表明组织蛋白酶B能够水解肌球蛋白、肌钙蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白。Hughes等 [14]研究发现，组织蛋白酶B对肌动蛋白有较强的水解作用，能从蛋白质的N端和C端水解得到大量的肽类，这可能对肉类食品的风味形成具有重要的作用，并可专一性地水解荧光底物N-苄氧羰基-L-精氨酰-L-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素（N-Cbz-L-arginine-7-amido-4-methylcoumarin，Z-Arg-Arg-AMC） [15]。目前，已有报道从海参 [16]、鲢鱼 [17]中提取组织蛋白酶B的相关研究，但基本上以单因素试验直接确定最佳酶活性的提取条件，并没有进行进一步的优化。

本实验以暗纹东方鲀为原料，通过单因素试验、Plackett-Burman试验和响应面分析试验，以组织蛋白酶B活力大小为指标，更系统地研究组织蛋白酶B的最佳提取条件，以便建立组织蛋白酶B酶活力与肌肉蛋白质水解及与河豚风味物质形成之间的联系，并为进一步分离纯化组织蛋白酶B奠定基础。

1 材料与方法

酰胺甲基香豆素（7-amido-4-methylcoumarin，A M C）、Z-A r g-A r g-A M C、苯甲基硫酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、半胱氨酸（L-cystine，L-Cys）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）、聚环氧乙烷23月桂醚（polyoxyethylene 23 laurylether，Brij35）、氯乙酸钠美国Sigma公司；其他试剂为国产分析纯。

RF5301-PC荧光分光光度计日本岛津公司；Avanti J-26XP冷冻离心机丹麦福斯集团；T10 basic高速分散机德国IKA公司。

将肌肉样品于4 ℃条件下解冻，去除脂肪、结缔组织，用绞肉机绞碎，取（10.00±0.01） g暗纹东方鲀肌肉，加入一定体积比的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS），在冰浴的条件下高速匀浆5 次（18 000～22 000 r/min，每次10 s，间隔2 s），然后12 000 r/min，4 ℃条件下冷冻离心30 min，用纱布过滤收集上清液，用等体积一定饱和度的(NH 4) 2SO 4盐析过夜后离心（10 000 r/min，30 min，4 ℃），所得沉淀用20 mmol/L pH 6.0的PBS溶解，并对沉淀进行充分透析，透析完成后离心（10 000 r/min，30 min，4 ℃）取上清，用滤纸过滤后再用0.45 μm的滤膜过滤，即得到组织蛋白酶B粗酶液。

肌肉组织蛋白酶B活力的测定参考Greenbaum [9]、Aranishi [15]、Toldra [18]等的方法，并做了适当修改。反应体系由980 μL 0.1% Brij35，500 μL 50 mmol/L PBS（含5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediniteilotetraacctic acid，EDTA）、5 mmol/L L-Cys，pH 6.0），500 μL 20 μmol/L的底物Z-Arg-Arg-AMC和 20 μL酶液组成。在40 ℃条件下水浴2 min，后加入500 μL 20 μmmol/L的底物Z-Arg-Arg-AMC，在40 ℃条件下反应10 min 后，加入2 mL终止液（0.1 mol/L乙酸钠，含0.1 mol/L氯乙酸钠，pH 4. 3）终止反应。利用荧光分光光度计测定其荧光强度，所用的激发波长为370 nm，发射波长为460 nm。同时用AMC取代Z-Arg-Arg-AMC测定1 nmol/L AMC的荧光强度。

酶活力单位（U）定义为在最适反应温度（40 ℃）和pH 6.0条件下，每分钟内水解底物并释放1 nmol AMC产物的酶量（1 nmol AMC/min）。

分别以料液比、缓冲液浓度及pH值、巯基保护剂种类、巯基保护剂的浓度、PMSF浓度、硫酸铵饱和度为影响因素，以组织蛋白酶B酶活力为指标进行单因素试验。

通过对单因素试验进行分析，选择各影响因子的高（＋1）、低（－1）两个水平，并以组织蛋白酶B活力为考察指标，采用Plackett-Burman试验设计筛选组织蛋白酶B活力的影响因子。

对组织蛋白酶B活力的影响因素很多，根据单因素试验和Plackett-Burman试验，采用Box-Behnken原理设计三因素三水平的响应面分析法，根据回归分析确定提取过程的影响因子，以组织蛋白酶B活力为响应值，分析最佳酶活力的提取条件。

2 结果与分析

料液比是影响组织蛋白酶B活力的重要因素，以50 mmol/L pH 5.8 PBS为浸提缓冲液，5 mmol/L L-Cys作为巯基保护剂，0.5 mmol/L PMSF作为蛋白酶抑制剂，硫酸铵饱和度为80%，考察河豚鱼肉与缓冲液的比例（即料液比（m/V）分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8）对组织蛋白酶B活力的影响，结果见图1。

图1 料液比对组织蛋白酶B活力的影响
Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on the activity of cathepsin B

由图1可知，组织蛋白酶B活力随料液比的增大而增大，当料液比达到1∶2时，组织蛋白酶B活力达到最大，随着料液比继续增大，组织蛋白酶B活力显著下降。这是因为随着浸提液体积的增大，提取液与河豚鱼肉的接触面积变大，从而促进河豚肉中的蛋白质成分溶出，之后随着水分子的增多，相互作用加大从而使得蛋白酶不易析出 [19]，使得组织蛋白酶B活力降低，因此选择1∶2为浸提液的最佳添加量。

缓冲液种类、浓度以及pH值是影响组织蛋白酶B活力的重要因素，以料液比为1∶2、5 mmol/L L-Cys作为巯基保护剂，0.5 mmol/L PMSF作为蛋白酶抑制剂，硫酸铵饱和度为80%，以不同的缓冲溶液（50 mmol/L乙酸钠缓冲液、pH 5.8，20 mmol/L乙酸钠缓冲液、pH 5.0，50 mmol/L乙酸钠缓冲液、pH 5.0，20 mmol/L乙酸钠缓冲液、pH 5.8，50 mmol/L PBS、pH 5.0，50 mmol/L PBS、pH 5.8）对组织蛋白酶B活力的影响做单因素试验，结果见图2。

图2 不同缓冲浸提液对组织蛋白酶B活力的影响
Fig.2 Effect of extraction solutions on the activity of cathepsin B

1. 50 mmol/L乙酸钠缓冲液、pH 5.8；2. 20 mmol/L乙酸钠缓冲液、pH 5.0；3. 50 mmol/L乙酸钠缓冲液、pH 5.0；4. 20 mmol/L乙酸钠缓冲液、pH 5.8；5. 50 mmol/L PBS、pH 5.0；6. 50 mmol/L PBS、pH 5.8。

由图2可知，缓冲液的种类、浓度及pH值都会影响组织蛋白酶B的活力，且PBS提取效果均优于乙酸钠缓冲液的提取效果，这与田甲春 [20]研究牦牛肌肉组织蛋白酶B最佳缓冲液结果相反，这可能是由于陆生动物与水生动物的栖息环境不同而导致的。比较PBS的提取效果，发现缓冲液6的提取效果最好，即pH 5.8的50 mmol/L PBS提取组织蛋白酶B的酶活力最高。

组织蛋白酶B属于半胱氨酸蛋白酶，是巯基蛋白酶，含有—SH [4]，故需要巯基保护剂对其巯基进行保护以免影响其酶活力。以料液比为1∶2、50 mmol/L pH 5.8的PBS为浸提缓冲溶液，0.5 mmol/L PMSF作为蛋白酶抑制剂；硫酸铵饱和度为80%，以不同巯基保护剂对组织蛋白酶B活力的影响做单因素试验，以EDTA、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（ethylene glycol bis-tetraacetic acid，EGTA）、DTT和L-Cys 4 种常见的巯基保护剂为单因素，选出最佳巯基保护剂后再进一步优化其浓度，结果见图3、4。

图3 不同巯基保护剂对组织蛋白酶B活力的影响
Fig.3 Effects of different thiolprotectants on the activity of cathepsin B

图4 L-Cys浓度对组织蛋白酶B活力的影响
Fig.4 Effects of different L-Cys concentrations on the activity of cathepsin B

由图3可知，4 种保护剂对酶活力的影响大小依次为L-Cys＞DTT＞EGTA＞EDTA，即添加巯基保护剂L-Cys提取组织蛋白酶B活力最高。确定L-Cys为最佳巯基保护剂后，进一步优化其最佳浓度，分别取L-Cys浓度为1、3、5、7 mmol/L进行浓度优化单因素试验；由图4可知，随着L-Cys浓度的增加，组织蛋白酶B活力逐渐上升，当L-Cys浓度达到5 mmol/L时，组织蛋白酶B活力达到最大，L-Cys浓度继续增大，组织蛋白酶B活力明显下降，这与李树红 [17]研究L-Cys浓度对鲢鱼组织蛋白酶B活力影响的结果一致。最终选择5 mmol/L L-Cys作为巯基保护剂。

PMSF是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，其可抑制丝氨酸蛋白酶的活力 [21]，加入PMSF可以更为精准地测得组织蛋白酶B的活力。以料液比为1∶2、50 mmol/L pH 5.8 PBS为浸提缓冲溶液，5 mmol/L L-Cys作为巯基保护剂，硫酸铵饱和度为80%，取PMSF浓度为0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L对组织蛋白酶B活力的影响做单因素试验，结果见图5。

图5 不同PMSF浓度对组织蛋白酶B活力的影响
Fig.5 Effects of different PMSF concentrations on the activity of cathepsin B

由图5可知，随着PMSF浓度的增加，组织蛋白酶B活力逐渐上升，当PMSF浓度达到0.5 mmol/L时，组织蛋白酶B活力达到最大，PMSF浓度继续增大，组织蛋白酶B活力明显下降，已有研究证明低浓度的PMSF会抑制丝氨酸蛋白酶活性而轻微激活半胱氨酸蛋白酶 [20]，若PMSF浓度过高，其也会抑制半胱氨酸蛋白酶的活性 [22]，推测组织蛋白酶B活性中心除含有半胱氨酸残基外还含有丝氨酸残基 [23]，最后综合考虑选择PMSF浓度为0.5 mmol/L。

在组织蛋白酶B分离纯化的过程中，硫酸铵沉淀是非常重要的一歩，其饱和度会影响组织蛋白酶B活力，以料液比为1∶2、50 mmol/L pH 5.8的PBS为浸提缓冲溶液，5 mmol/L L-Cys作为巯基保护剂，0.5 mmol/L PMSF作为蛋白酶抑制剂，以硫酸铵饱和度（20%、40%、60%、80%、90%、100%）对组织蛋白酶B酶活力的影响做单因素试验，结果见图6。

图6 硫酸铵饱和度对组织蛋白酶B酶活力的影响
Fig.6 Effects of different ammonium sulfate concentrations on the activity of cathepsin B

由图6可知，随着硫酸铵饱和度的增加，组织蛋白酶B酶活力也逐渐增加，硫酸铵饱和度在20%～60%时，由于硫酸铵饱和度低，不能将蛋白沉淀完全，从而导致测得的组织蛋白酶B酶活力很低，当硫酸铵饱和度进一步增大时，组织蛋白酶B酶活力明显增大，到硫酸铵饱和度达到100%时组织蛋白酶B酶活力达到最大，随着硫酸铵饱和度的增加蛋白沉淀更完全。所以最终将硫酸铵饱和度为100%作为盐析的最佳条件。

根据在单因素试验中各影响因子对组织蛋白酶B活力的影响效果，可以确定Plackett-Burman试验的高（＋）、低（－）水平。采用Plackett-Burman原理设计试验对组织蛋白酶B活力影响的6 个因素进行研究，试验设计方案及结果见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计及结果
Table1 Plackett-Burman design with experimental results

采用SPSS 20软件对表1中的数据进行逐步回归分析，得到组织蛋白酶活力的最优方程为：Y＝19.890－1.707A＋3.368C＋5.959F（P＝0.001），具有统计学意义。由主效应分析（表2）可以看出，影响组织蛋白酶B活力的主要因素为料液比、PBS pH值和硫酸铵饱和度，故在下一步响应面的分析中，重点考察这3 个因素的最优水平范围。

表2 Plackett-Burman试验各因素主效应分析（ =0.05)
Table2 Analysis of the major effects of each factor in Plackett-Burman design ( = 0.05)

2.3 响应面试验设计优化暗纹东方鲀肌肉组织蛋白酶B提取工艺

根据上述试验结果，选用料液比、PBS pH值和硫酸铵饱和度这3 个因素作为响应变量，以组织蛋白酶B的酶活力为响应值，运用Design Expert 8.0按照Box-Behnken原理进行响应面设计，以1、0、－1分别代表自变量的3 个水平，具体试验设计方案及结果见表3，方差分析见表4。

表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table3 Box-Behnken design with response values

试验号A 料液比B PBS pH Y 酶活力/（U/g）10（1∶2）1（6.8）1（100）32.85 21（1∶3）0（5.8）128.56 3 1 0 1 24.15 4 1 10（95）23.02 C 硫酸铵饱和度/% 5 31.7 5 6 1 0－1（90）24.62 1 1 0 0－1（4.8）126.05 8－1（1∶1）0－118.94 9－1－1018.45 1000029.77 111－1024.56 120－1－121.18 1301－126.04 1400028.74 1500030.67 7

表4 回归方程方差分析
Table4 Analysis of variance of regression equation

注：P＜0.05表示差异显著。

变异来源方差自由度均方差F值P值模型250.88927.885.430.038 5 A 32.50132.506.340.053 4 B 68.57168.5713.370.014 7 C 54.23154.2310.570.022 7 AB1.7211.720.34 0.587 6 AC25.46125.464.960.076 4 BC0.9310.930.180.687 8 A 255.45155.4510.810.021 8 B 27.3517.351.430.285 0 C 211.79111.792.300.190 0残差25.6555.13失拟项23.7837.938.480.107 3纯误差1.8720.94总离差276.5314

经回归拟合后，得到以组织蛋白酶B酶活力为响应值的回归方程为：Y＝29.73＋2.02A＋2.93B＋2.60C＋0.66AB－2.52AC＋0.48BC－3.88A 2－1.41B 2－1.79C 2，从表4的方差分析结果看，PBS pH值和硫酸铵饱和度这两个因素的P值均小于0.05，表明其对组织蛋白酶B活力的影响是显著的，料液比的P值大于0.05，表明其对组织蛋白酶B活力的影响是不显著的。整体模型的P值小于0.05，表明该二次方程模型是显著的；失拟项比的P值大于0.05，表明其对于绝对误差是不显著的，而不显著的失拟项表明方程模拟较好；决定系数为0.907 2，表明其应变量与全体自变量之间的多元回归关系显著，即说明该回归方程对试验拟合情况较好，试验误差小。

为了观察某两个因素的交互作用对组织蛋白酶B活力的影响，将其他因素保持不变，利用Design-Expert 8.0获得两两因素交互作用的响应曲面和等高线图，从而确定因素的最佳水平范围，等高线的形状反映交互效应的强弱 [24]。响应面图形是响应值对各因素（A、B、C）所构成的三维空间的曲面图，从图7～9可形象地看出各因素交互作用对响应值的影响。比较3 个图可知，硫酸铵饱和度对组织蛋白酶B活力的影响最为显著；而PBS pH值和料液比次之，曲线较为平滑。从3 个因素的两两交互等高线图可以看出，料液比和缓冲液交互作用的等高线图呈圆形，表明其交互作用影响不显著；料液比和硫酸铵饱和度交互作用的等高线图呈椭圆，表明其交互作用影响显著；硫酸铵饱和度和缓冲液pH值交互作用的等高线图呈椭圆，表明其交互作用影响显著。

图7 料液比与浸提缓冲液pH值交互影响的响应面（a）及等高线（b）图
Fig.7 Response surface (a) and contour plots (b) for the effects of solid/ liquid ratio and extraction solution pH on the activity of cathepsin B

图8 料液比与硫酸铵饱和度交互影响的响应面（a）及等高线（b）图
Fig.8 Response surface (a) and contour plots (b) for the effects of solid/ liquid ratio and ammonium sulfate saturation on the activity of cathepsin B

图9 浸提缓冲液pH值与硫酸铵饱和度交互影响的响应面（a）及等高线（bb）图
Fig.9 Response surface (a) and contour plots (b) for the effects of extraction buffer pH and ammonium sulfate saturation on the activity of cathepsin B

通过Design-Expert 8.0软件分析，预测出最佳酶活的提取工艺条件为：料液比1∶2.1，PBS的pH值为7.0，硫酸铵饱和度99.2%，在此条件下，组织蛋白酶B理论酶活力为32.65 U/g。

为了对模型进行验证，在以上最佳条件下，并结合单因素试验条件：PBS浓度50 mmol/L、L-Cys浓度5 mmol/L、PMSF浓度0.5 mmol/L进行验证实验，测得组织蛋白酶B活力平均值为32.52 U/g（n＝3），与理论值相比，相对误差为0.39%，证明响应面分析法得到的组织蛋白酶B最优提取工艺参数真实可靠。

3 结论

本研究通过单因素试验、Plackett-Burman试验和Box-Behnken响应面试验系统地优选，得到暗纹东方鲀组织蛋白酶B最佳提取条件。通过Plackett-Burman试验回归显著分析，发现暗纹东方鲀组织蛋白酶B活力影响显著的因素有料液比、PBS pH值和硫酸铵体积分数；通过Box-Behnken试验及响应面分析获得的最佳工艺参数为：料液比1∶2.1，PBS pH值为7.0，硫酸铵饱和度为99.2%，在此条件下组织蛋白酶B活力的预测值为32.65 U/g，实测值为32.52 U/g，相对误差为0.39%，说明建立的模型切实可行，能很好地预测各因素和组织蛋白酶B活力之间的关系。

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Optimization of Extraction Conditions for Cathepsin B from Takifugu obscures Muscle

LI Lin, WANG Zhengquan, ZHANG Jingjing, MIAO Xiaodan, MA Lei, WANG Xichang, LIU Yuan*
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Abstract：In order to obtain optimal conditions for the extraction of cathepsin B from Takifugu obscures, on the basis of results of single-factor experiments, some extraction parameters affecting cathepsin B activity were firstly evaluated by Plackett-Burman design, and then the main variables were optimized by response surface analysis. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows: material/liquid ratio 1:2.1, phosphate buffer pH 7.0, and ammonium sulfate saturation 99.2%, and these three factors had significant influence on the enzyme activity. Under these conditions, the predicted value of cathepsin B activity was 32.65 U/g and its experimental value was 32.52 U/g, suggesting that the established model is feasible and can provide a theoretical basis for further studies on the extraction process of cathepsin B.

Key words：Takifugu obscures; cathepsin B; Plackett-Burman design; response surface analysis

李琳, 王正全, 张晶晶, 等. 暗纹东方鲀肌肉组织蛋白酶B提取工艺优化[J]. 食品科学, 2016, 37(3): 91-96. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603018. http://www.spkx.net.cn

LI Lin, WANG Zhengquan, ZHANG Jingjing, et al. Optimization of extraction conditions for cathepsin B from Takifugu obscures muscle[J]. Food Science, 2016, 37(3): 91-96. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603018. http://www.spkx.net.cn

基金项目：国家自然科学基金面上项目（31371790；31271900）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD28B01）；上海市科委工程中心建设项目（11DZ2280300）；上海市教委重点学科建设项目（J50704）；

作者简介：李琳（1993—），女，硕士研究生，研究方向为食品营养与品质评价。E-mail：985319795@qq.com

*通信作者：刘源（1979—），男，副教授，博士，研究方向为食品营养与品质评价。E-mail：yliu@shou.edu.cn

暗纹东方鲀肌肉组织蛋白酶B提取工艺优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论