3 种脂环酸芽孢杆菌分离培养基的性能评价

何天文 1,卢勉飞 1,蔡芷荷 1,周梅连 1,吴清平 2,*

(1.广东环凯微生物科技有限公司,广东 广州 510663;2.广东省微生物研究所,广东 广州 510070)

摘 要:目的:比较3 个厂家的K培养基、酵母粉淀粉葡萄糖(yeast extract starch glucose medium,YSG)培养基和耐酸耐热芽孢菌(Alicycloba cillus)培养基(Bacillus acidoterrestris medium,BAT)对脂环酸芽孢杆菌的检测效果。方法:选用标准菌株、分离株及实际样品对3 个厂家(广东环凯微生物科技有限公司(简称HK,下同)、厂家Ⅰ和厂家Ⅱ)的K培养基、YSG培养基和BAT培养基进行生长菌落数及分离效果的评估。结果:酸土脂环酸芽孢杆菌标准株和脂环酸芽孢杆菌分离株4-2在K、YSG和BAT 3 种培养基上生长的菌落数(3 个厂家培养基上的 菌落数平均数)均无显著性差异(P>0.05);酸热脂环酸芽孢杆菌标准株和脂环酸芽孢杆菌分离株5-3在K培养基上不生长,在YSG培养基和BAT培养基上生长良好,其菌落平均数统计学上无显著性差异(P>0.05);对实际样品中酸土脂环酸芽孢杆菌的分离,3 个厂家的同种培养基分离率和符合率相当;对实际样品中酸热脂环酸芽孢杆菌的分离,在YSG和BAT培养基上,HK和厂家Ⅱ的分离率和符合率相当,优于厂家Ⅰ。结论:K培养基不适合所有脂环芽孢杆菌,但 分离酸土脂环酸芽孢杆菌效果很好,YSG培养基和BAT培养基适合所有脂环酸芽孢杆菌。HK和厂家Ⅱ的培养基优于厂家Ⅰ。

关键词:脂环酸酸芽孢杆菌;培养基;性能评价

微生物是使苹果汁等果汁发生混浊、沉淀和腐败 变质的主要因素 [1],特别是在低酸度下仍能长期存活的脂环酸芽孢杆菌,对其进行控制和快速检测已成为令苹果汁生产厂家困扰的问题 [2-3]。脂环酸芽孢杆菌是Wisotzkey等 [4]通过对酸热脂环芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius) [5]、环庚烷芽孢杆菌(B. acidoterrestris)和酸土芽孢杆菌(B. cycloheptanicus) [6]进行16S rDNA基因序列分析,以及对其细胞膜中都含有ω-环状脂肪酸 [7-8]的特点分析,把这3 种菌从芽孢杆菌属中划分出来,成立为一个新属。该属中的酸土脂环酸芽孢杆菌和酸热脂环酸芽孢杆菌容易引起果汁腐败,并产生异味。腐败初期,产品并不会出现明显的涨包或酸败,但是万亿分之一浓度的该菌代谢产物就会使果汁口感风味变劣,产生混浊乃至形成白色沉淀等 [3,9]

Darland等 [5]在1971年发明了耐酸耐热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius thermophilic agar medium,BAT)培养基。在1984年Gerny等 [10]等利用BAT培养基从腐败的苹果汁中分离出第一株脂环酸芽孢杆菌 [10]。然而Bevilacqua等 [11]认为BAT培养基适用果汁中脂环酸芽孢杆菌分离。1998年,Walls等 [12]首先利用K培养基从苹果汁中分离出脂环酸芽孢杆菌。Matsubara等 [13]利用酵母粉淀粉葡萄糖(yeast extract starch glucose,YSG)琼脂培养基分离酸热脂环酸芽孢杆菌,有研究认为,适用芙蓉花干中脂环酸芽孢杆菌分离,日本NDM公司使用YSG培养基,用于酸性饮料中脂环酸芽孢杆菌检验 [14]。随后这3种培养基均被列入国际果汁生产商联合会(International Federation of Fruit Juice Producers,IFU)标准方法12《果汁中脂环酸芽孢菌的检测》 [15]。各学者对这3 种培养基对脂环酸芽孢杆菌检测效果持不同观点。本研究通过对在这3 种培养基上生长的菌落数和对样品中目标菌的分离效果来比较培养基的性能,旨在为广大检验工作者选择合适的培养基提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基及试剂

酸土脂环酸芽孢杆菌ATCC49025、酸热脂环酸芽孢杆菌ATCC27009、脂环酸酸芽孢杆菌分离株4-2、脂环酸酸芽孢杆菌分离株5-3 广东环凯微生物科技有限公司。

K培养基、YSG培养基、BAT培养基、糖醇生化鉴定试剂、革兰氏染色液 广东环凯微生物科技有限公司(简称HK)。

浓缩橙汁、浓缩苹果汁、浓缩葡萄汁样品 广州卜蜂莲花超市。所有试样均按照无菌采样原则采集,采样后置4~8 ℃条件下保存。

1.2 仪器与设备

全自动菌落分析仪、电热恒温培养箱、恒温水浴箱广东环凯微生物科技有限公司;螺旋接种仪 瑞士SIB公司。

1.3 方法

1.3.1 实验菌株的生长比较

培养基的制备:K培养基、YSG培养基、BAT培养基分别按其使用说明书制备成平板,备用。使用前将其置于45 ℃培养箱中,直至培养基表面的水滴消失。

实验菌悬液的制备:将酸土脂环酸芽孢杆菌ATCC49025、酸热脂环酸芽孢杆菌ATCC27009、脂环酸酸芽孢杆菌分离株4-1和脂环酸酸芽孢杆菌分离株5-3接种于YSG培养基,于(45±1) ℃条件下培养72 h后,挑取菌苔悬浮于无菌生理盐水中,制备在含活菌数约为1×10 -4~1×10 -5CFU/mL的菌悬液中,备用。

实验菌悬液的接种:取上述两种菌悬液0.1 mL,用全自动螺旋接种仪分别接种至3 个厂家的K培养基、YSG培养基、BAT培养基平板上,于(45±1) ℃条件下培养72 h后,进行菌落计数。

1.3.2 样品分离

参考文献:[16],与标准菌株一起进行比较分析方法。

1.3.2.1 阳性对照样品处理

各取50 mL样品至两个三角瓶,于121 ℃条件下灭菌15 min后,一瓶加入适量的酸土脂环酸芽孢杆菌ATCC49025,另一瓶加入酸热脂环酸芽孢杆菌ATCC27009,另取相同体积的同一样品于一个相同的瓶中做温度控制用,在温度控制瓶中插入温度计。把两个瓶都放入到水浴箱中(水浴箱中的水面应高于瓶中的样品)。70 ℃条件下开始计时,20 min后,迅速将样品冰浴。

1.3.2.2 实验样品处理

取50 mL样品于一个无菌瓶中,不接种,后续操作与1.3.2.1节同。

1.3.2.3 阳性对照样品和实验样品的接种

将经过热处理的样品加入无菌生理盐水稀释,稀释倍数约10 倍左右。用0.45 μm的滤膜过滤后把滤膜放到K培养基、YSG培养基、BAT培养基上,(45±1) ℃条件下培养3~5 d。

1.3.2.4 可疑菌株分离

在接种样品的3 个厂家的K培养基、YSG培养基、BAT培养基平板上分别挑取与阳性对照样品特征相似的菌落,为可疑菌株,对应的样品为可疑阳性样品。分离率计算公式如下。

1.3.2.5 生化鉴定

分别将从上述培养基平板上所挑取的可疑菌株,转接至YSG培养基上,于(45±1) ℃条件下培养72 h后,刮取YSG培养基上的菌苔进行革兰氏染色,涂片镜检、耐酸耐热生长实验,并参照陈世琼等 [17]方法进行包括甘油、阿拉伯糖、松三糖、松二糖、木糖醇、棉子糖、葡萄糖酸盐、肌醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、水杨苷、七叶苷、苦杏仁苷、甘露糖、鼠李糖、山梨醇、半乳糖19 种糖醇生化鉴定。典型生化特征见表1 [17]

表1 典型生化特征
Table1 Typical biochemical characteristics of Alicyclobaciilllluuss

注:+.阳性;-.阴性。下同。

酸热脂环酸芽孢杆菌革兰氏 染色++蔗糖--pH 2~6生长实验++乳糖++80 ℃,13 min条件下耐热实验++麦芽糖++甘油++纤维二糖++阿拉伯糖--水杨苷-+松三糖-+七叶苷++松二糖++苦杏仁苷--木糖醇+-甘露糖--棉子糖+-鼠李糖++葡萄糖酸盐++山梨醇+-肌醇+-半乳糖-+项目酸土脂环酸芽孢杆菌酸热脂环酸芽孢杆菌项目酸土脂环酸芽孢杆菌

符合以上所有生化反应特征的可疑菌株确认为阳性菌株,对应样品为阳性样品。阳性菌株符合率计算见下式。

1.4 数据分析

所有实验数据均采用SPSS 19.0软件分析,数据结果以±s表示。

2 结果与分析

2.1 菌株在3 种培养基上的生长情况比较由表2可知,酸土脂环酸芽孢杆菌ATCC49025和脂环酸芽孢杆菌分离株4-2在K培养基、YSG培养基和BAT培养基3 种培养基上生长的菌落数(3 个厂家培养基上的菌落数平 均数,下同)均无显著性差异(P>0.05);酸热脂环酸芽孢杆菌ATCC27009和脂环酸芽孢杆菌分离株5-3

表2 实验菌株在各培养基上的菌落数
Table2 Colony counts of reference strains and isolates of Alicyclobaciilllluuss in different media lg(CFU/mL)

注:—.未检测出;*.其他厂家与HK在同类培养基间比较差异显著(P<0.05)。

菌株K培养基YSG培养基BAT培养基HK厂家I厂家II HK厂家I厂家II HK厂家I厂家II酸土脂环酸芽孢杆菌ATCC490251.919±0.010 1.646±0.020 *1.888±0.0071.991±0.015 1.668±0.024 *1.922±0.0121.962±0.013 1.630±0.030 *1.897±0.013酸热脂环酸芽孢杆菌ATCC27009——1.949±0.012 1.394±0.049 *1.913±0.0131.898±0.013 1.304±0.038 *1.870±0.015脂环酸芽孢杆菌分离株4-22.190±0.050 1.786±0.025 *2.170±0.0092.292±0.007 1.842±0.018 *2.296±0.0062.263±0.008 1.816±0.022 *2.226±0.008脂环酸芽孢杆菌分离 株5-3——2.042±0.010 1.462±0.029 *2.005±0.0111.970±0.013 1.387±0.044 *1.963±0.015

在K培养基上不生长,在YSG培养基和BAT培养基上生长菌落平均数无显著性差异(P>0.05),表明K培养基不适合酸热脂环酸芽孢杆菌ATCC27009和脂环酸芽孢杆菌分离株5-3的生长。4 株实验菌株在3 个厂家的K培养基、

YSG培养基、BAT培养基的生长菌落平均数也有差异,总体上HK和厂家Ⅱ相当,均优于厂家Ⅰ,经统计学分析有显著差异(P<0.05)。

2.2 样品分离实验结果

2.2.1 酸土脂环酸芽孢杆菌

表3 3 种培养基分离酸土脂环酸芽孢杆菌的结果
Table3 Separation of A. acidoterrestris from three media

样品K培养基YSG培养基BAT培养基HK厂家I厂家IIHK厂家I厂家IIHK厂家I厂家II标准菌株特征 黄白色,菌落较大,边缘不整齐,不透明浓缩苹果汁+++++++++浓缩橙汁+++++++++浓缩葡萄汁+++++++++可疑株特征黄白色,菌落较大,边缘不整齐,不透明浓缩苹果汁(3 份)111222221浓缩橙汁(4 份)222334334浓缩葡萄汁(3 份)000233111合计(10 份)333789666鉴定确认阳性样333333333分离率/%303030303030303030符合率/%100100100433833505050

标准菌株与可疑菌株在培养基上生长菌落特征相同,均为黄白色,菌落较大,边缘不整齐,不透明,如表3所示,3 个厂家的K培养基均从10 份样品中分离出3 份可疑阳性样品,分离的可疑菌株最后经生化反应确认为阳性样为3 份,分离率均为30%,符合率均为100%,说明3 个厂家的K培养基分离酸土脂环酸芽孢杆菌的分离率相当,且特异性均较高;HK、厂家Ⅰ、厂家Ⅱ的YSG培养基分别从10 份样品中分离出7、8、9 份可疑阳性样品,分离的可疑菌株最后经生化反应确认阳性样品为3 份,分离率为30%,符合率分别为43%、38%、33%,说明3 个厂家的分离率基本相当,但HK的特异性比其他两个厂家稍高;3 个厂家的BAT培养基均从10 份样品中分离出6 份可疑阳性样品,分离的可疑菌株最后经生化反应确认,阳性样品均为3 份,分离率均为30%,符合率均为50%,说明3 个厂家BAT培养基分离酸土脂环酸芽孢杆菌的分离率与特异性相当。

2.2.2 酸热脂环酸芽孢杆菌

标准菌株在K培养基上生长受抑制,样品在K培养基上也没有发现与酸热脂环酸芽孢杆菌标准菌菌落特征相似的可疑菌落,表明3 个厂家的K培养基均不适合分离酸热脂环酸芽孢杆菌。样品在YSG培养基和BAT培养基上有与标准株特征一致的可疑株,HK、厂家Ⅰ、厂家Ⅱ的YSG培养基分别从10 份样品中分离出5、3、5 份可疑样品,分离的可疑菌株最后经生化反应确认阳性样品分别为2、1、2 份,分离率分别为20%、10%、20%,符合率分别为40%、33%、40%;厂家Ⅰ的BAT培养基没有从样品中分离出可疑菌落,HK和厂家Ⅱ分别分离出2、3 份可疑样品,分离的可疑菌株最后经生化反应确认样品均为1 份,分离率均为10%,符合率分别为50%和33%。结果表明YSG培养基和BAT培养基能适合酸热脂环酸芽孢杆菌的分离,但不同厂家分离效果有差异,分离率HK和厂家Ⅱ相当,优于厂家Ⅰ,但符合率HK最高。结果见表4。

表4 3 种培养基分离酸热脂环酸芽孢杆菌的结果
Table4 Separation of A. acidocaldarius from three media

注:/.没有符合生化反应阳性的样品。

样品K培养基YSG培养基BAT培养基HK厂家I厂家IIHK厂家I厂家IIHK厂家I厂家II标准菌株特征黄白色,菌落较小,边缘整齐,不透明浓缩苹果汁--- ++++++浓缩橙汁---++++++浓缩葡萄汁---++++++可疑特征黄白色,菌落较小,边缘整齐,不透明浓缩苹果汁(3 份)000212101浓缩橙汁(4 份)000222102浓缩葡萄汁(3 份)000101000合计(10 份)000535203确认分离株000212101分离率/%00020102010010符合率/%///40334050/33

3 讨论与结论

美国库克实验室检测脂环酸芽孢杆菌时选用的培养基是K培养基,按库克实验室的配制方法,将10 mL经过滤除菌的12.5% L-苹果酸溶液加至于121 ℃灭菌25 min的K培养基中,搅拌均匀,使其pH值达到3.7±0.1,其配制方法简单,操作过程中不易受污染,被广泛用于分离浓缩果汁中的脂环酸芽孢杆菌。Walls等 [12]对K培养基、橙血清琼脂、马铃薯葡糖糖琼脂比较,发现在不同温度下,K培养基生长的脂环酸芽孢杆菌均是最好。薛晚利等 [18]也利用K培养基从浓缩苹果汁中分离脂环酸芽孢杆菌。但是均没有说明是脂环酸芽孢杆菌属中哪个种,本实验结果显示酸热脂环酸芽孢杆菌在K培养基上生长很差,说明K培养基不适合所有脂环酸芽孢杆在K培养基上的生长,同时发现因其对脂环酸芽孢杆菌有一定的抑制,因此分离酸土脂环芽孢杆菌时,特异性很高。Chang Susen等 [19]对K培养基进行改进,添加了糖和钙离子等研发成SK培养基,并证明其比K培养基更有利于分离脂环酸芽孢杆菌。YSG培养基是日本NDM公司检测脂环酸芽孢杆菌使用的培养基。根据其配制方法,将YSG液体培养基和琼脂各加一半蒸馏水,于121 ℃条件下分开灭菌15 min。然后YSG液体培养基用盐酸或硫酸调节其pH值至3.7±0.1,并与琼脂溶液混合。但是IFU中的YSG培养基配制方法与日本NDM公司不同,其方法与配制BAT培养基相似,于121 ℃条件下灭菌15 min后用盐酸或硫酸调节pH值。本实验选用的是日本NDM公司的方法,因为其更有利控制最终pH值。因为实验证明培养基的最终pH值对脂环酸芽孢杆菌的检测很关键,其最终pH值高于4.2时抑制耐热菌凝结芽孢杆菌生长的效果差,而pH值过低会影响脂环酸芽孢杆菌的生长。BAT培养基是IFU最早推荐检测脂环酸芽孢杆菌的培养基。BAT培养基也是灭菌后用盐酸或硫酸调节其pH值至4.0±0.1。此培养基的琼脂粉是与配方中的其他原料一起混匀后制备成干粉培养基的,受存储环境的影响,当培养基pH值下降至5.0以下时,由于过度酸性,灭菌后培养基的凝胶强度会产生下降或不凝固的现象,因此该干粉培养基储存条件更苛刻。本实验结果显示,YSG培养基与BAT培养基的检测效果相当。然而Murray等 [20]对6 株酸土脂环酸芽孢杆菌、3 株酸热脂环酸芽孢杆菌和1 株庚烷脂环酸芽孢杆菌实验,认为BAT培养基回收孢子优于YSG培养基。本实验结果显示,不同厂家生产的相同培养基之所以存在差异,是与培养基使用的原料和配制方法有关,且薛晚利等 [18]也持相同观点。

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Performance Evaluation of Three Media for Alicyclobacillus Iso lation

HE Tianwen 1, LU Mianfei 1, CAI Zhihe 1, ZHOU Meilian 1, WU Qingping 2,*
(1. Guangdong Huankai Microbial Sci.&Tech.Co. Ltd., Guangzhou 510663, China; 2. Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China)

Abstract:Objective: To evaluate the efficacy of three media, K agar, yeast extract starch glucose (YSG) medium and Bacillus acidoterrestris (BAT) agar medium each from three manufacturers (Guangdong huankai, manufacturer II and manufacturer I), in detecting Alicyclobacillus. Methods: The colony growth of standard strains and the separation of Alicyclobacillus isolates from real samples were evaluated using the three media. Results: The number of colonies of Alicyclobacillus acidoterrestris reference culture and Alicyclobacillus isolate 4-2 in K medium, YSG medium and BAT medium did not significantly diff er (P > 0.05). Similarly, there was no significant difference in the number of colonies of A. acidoterrestris reference culture and Alicyclobacillus isolate 5-3 in YSG medium and BAT medium (P > 0.05), but neither could grow in K medium. The separation and consistency rates of three media from three manufacturers for isolating A. acidoterrestris in samples w ere similar. The separa tion and consistency rates of YSG medium for isolating A. acidocaldarius in samples were similar to those of BAT medium from HK and manufacturer II, which were better than those from manufacturer I. Conclusion: K medium was more effective for isolating A. acidoterrestris, but it was not suitable for isolating all Alicyclobacillus iso lates. YSG medium and BAT medium were suitable for isolating all Alicyclobacillus isolates. The media from HK and manufacturer II had superior performance than those from manufacturer I.

Key words:Alicyclobacillus; culture media; performance evaluation

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603032

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)03-0175-05

引文格式:

何天文, 卢勉飞, 蔡芷荷, 等. 3 种脂环酸芽孢杆菌分离培养基的性能评价[J]. 食品科学, 2016, 37(3): 175-179. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603032. http://www.spkx.net.cn

HE Tianwen, LU Mianfei, CAI Zhihe, et al. Performance evaluation of three media for Alicyclobacillus iso lation[J]. Food Science, 2016, 37(3): 175-179. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603032. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2014-12-13

基金项目:广州市科技基金项目(2014Y2-00148)

作者简介:何天文(1983—),男,工程师,本科,主要从事微生物快速检测技术研究。E-mail:hetianwe.n@163.com

*通信作者:吴清平(1962—),男,研究员,博士,主要从事微生物快速检测技术研究。E-mail:wuqp203@163.com