叶黄素及其顺式异构体的快速检测

李大婧 1,2，刘春菊 1,2，肖亚冬 1，庞慧丽 1，刘春泉 1,2, *
（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014；2.国家蔬菜加工技术研发专业分中心，江苏南京 210014）

摘要：为了建立分离度好、分离效率高的叶黄素顺、反异构体检测方法。通过对检测波长、流动相、流动相比例和流速等色谱条件的摸索和优化，确定最佳色谱条件，并采用光谱、高效液相色谱、质谱等方法对叶黄素顺、反异构体进行定性定量分析。结果表明：该方法流动相为二氯甲烷-乙腈-甲醇（20∶30∶50，V/V），流速为1.0 mL/min，叶黄素热异构化样品中各物质在12 min内达到有效分离，无拖尾现象，峰形较好；在叶黄素热异构化样品中鉴定出15-顺式、13/13′-顺式和9/9′-顺式叶黄素顺式异构体及全反式叶黄素，全反式叶黄素在4～260 ng范围内峰面积与进样量呈良好线形性关系，回收率在95%以上，精密度和稳定性相对标准偏差均小于2%。该方法分离度好、准确性高、重现性好。

叶黄素具有抗氧化、抗癌、抗心脑血管疾病等生理功能，尤其是对眼部疾病有很好的防治作用，受到人们的日益关注，是国际公认具有防病、抗病生理功能的重要活性物质 [1-2]。叶黄素作为食品添加剂和营养增补剂被广泛应用于食品、保健品、医药、化妆品、烟草和畜禽类饲料等多个领域。

叶黄素分子结构中含有多个共轭双键结构，在自然界以多种异构体形式存在 [3]。在叶黄素制剂化或食品加工过程中，叶黄素会不可避免地受到加热、空气等影响，发生异构化反应，甚至裂解为环氧化物、含醛基或酮基的衍生物等 [4]。目前很少有人监测在叶黄素提取、制剂过程中顺式异构体的变化，产品的质量难以保障，因此建立叶黄素高效、可行的检测方法对叶黄素异构体的研究和应用具有重要的意义。

高效液相色谱（h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d chromatography，HPLC）方法能够很好地分离样品中的天然色素，具有分离效果好、检测灵敏度高、分离效率高等优点，现在已经成为应用于类胡萝卜素分析中非常活跃的技术之一，也是叶黄素定性定量检测的主要技术。Rodriguez等 [5]运用HPLC结合二级阵列质谱和低场核磁（HPLC-diode array detection-mass spectrometernuclear magnetic resonance，HPLC-DAD-MS-NMR）方法分离和鉴定出叶黄素和玉米黄质异构体；Dachtler等 [6]通过HPLC-MS、HPLC-NMR技术分析了菠菜和肠胃中叶黄素和玉米黄质的立体异构体；陈万勤等 [3]采用冷皂化-HPLC方法测定乳制品中的叶黄素的顺反异构体；李秀霞等 [7]使用反相液谱结合二级阵列和大气压化学电离质谱（HPLC-DAD-atmospheric pressure chemical ionization-MS，HPLC-DAD-APCI-MS）技术对玉米蛋白粉中叶黄素、玉米黄质和隐黄质及其主要顺式异构体进行了分离和鉴定。这些检测方法都存在着检测耗时长、分离效果较差等问题，是限制HPLC技术实现快速检测的瓶颈。因此，建立一种快速、分离度高、准确度高的叶黄素检测方法成为当今亟需解决的问题。

本实验通过对色谱条件的多次优化和筛选，并通过MS、光谱、HPLC等方法对叶黄素顺、反异构体进行定性定量分析，旨在建立一种对叶黄素行之有效的HPLC检测方法，为更好地控制叶黄素产品的质量提供参考。

1 材料与方法

反式叶黄素标准品（97%）美国Fluka公司；棕榈油泰国巴吞油厂有限公司；甲醇、乙腈二氯甲烷（分析纯）美国天地公司；正己烷（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；丙酮（分析纯）南京宁试化学试剂有限公司；氮气（纯度99.99%）南京文达特种气体有限公司。

85-2A数显测速恒温磁力搅拌器江苏金坛市金华仪器厂；D10氮气吹扫仪杭州奥盛仪器有限公司；数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；BS224S电子分析天平北京赛多利斯科学仪器公司；1200 HPLC仪（主要包括在线真空脱气机、四元梯度洗脱泵、柱温箱、DAD）、色谱柱YMC-C 30、6530精确质量数四极杆-飞行时间质谱仪（APCI源）美国Agilent公司。

吸取棕榈油4.6 mL于具塞刻度试管中，在170 ℃条件下，于恒温油浴锅中避光加热。称取10 mg全反式叶黄素晶体于另一支试管中并加入400 μL正己烷，超声溶解30 s，频率为40 kHz。将正己烷-叶黄素溶液注入相应油脂中，制成工作溶液，这一过程需在1 min内完成。热处理2 h时，移取200 μL样品于小试管中，与2 mL丙酮混合均匀后，迅速置于－20 ℃冰箱保存24 h，使油脂中的三酰甘油酯结晶。通过0.45 μm膜过滤于样品瓶中，进行HPLC-MS分析，整个实验过程中，试管敞口不密封，所有操作均在避光条件下完成。

HPLC条件：色谱柱为C 30（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温25 ℃；进样量20 μL；DAD光谱收集范围250～600 nm。

MS条件：离子源为APCI ＋，毛细管电压2 500 V，电晕电流4 μA，干燥气体5 L，气化温度350 ℃，蒸汽温度400 ℃，雾化气体20 psi。

准确称取1 mg全反式叶黄素标准品，用丙酮溶解并定容至25 mL，混匀，制成质量浓度为40 μg/mL的标准溶液。分别取一定量标准液置于5 mL容量瓶中，用丙酮定容并混匀，制成质量浓度为0.2、1、3、5、7、9、11、13 μg/mL的系列标准溶液，采用所建的C 30-HPLC方法检测，每个系列质量浓度重复进样3 次，根据吸收峰面积对相应进样量进行线性回归分析，绘制全反式叶黄素的标准曲线。

首先采用HPLC方法对样品溶液进行检测，然后精密移取6 份已测的样品溶液2 mL，分别加入相同体积的1、3、9 μg/mL叶黄素标准液，制备加标溶液，溶液中叶黄素含量在4～260 ng，之后进行HPLC检测，将测得的峰面积代入标准曲线方程得到样品液中的叶黄素含量，按下式计算加标回收率。

精确移取2 份叶黄素样品溶液，样液中叶黄素含量在4～260 ng之间，按照上述HPLC条件各重复进样6 次，根据峰面积计算样品中相应的叶黄素含量，最终得到叶黄素含量相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

取一份样品液于－18 ℃条件下密封避光保存0、4、8、10 h，根据峰面积计算样品中相应的反式叶黄素含量，进而得到10 h内供试样品中叶黄素含量变化情况。

2 结果与分析

目前，国内外用于叶黄素分析的HPLC流动相主要为水、甲基叔丁基醚、甲醇、乙腈、二氯甲烷。如张艳 [10]、Rodriguez [5]等应用含乙腈、甲醇的流动相分别分离鉴定出叶黄素类化合物、β-胡萝卜素类化合物，Qiu Dan [11]、Chen [12]等采用含二氯甲烷、甲醇的流动相建立了对β-胡萝卜素异构体有效可行的色谱方法，Lee等 [13]则应用二氯甲烷、乙腈参与的流动相分离检测出番茄红素及其异构体。在另外文献报道 [14-15]中，研究者分别使用水-甲醇、水-乙腈为流动相对叶黄素顺、反异构体进行分离，但这两种方法所用时间都较长，分别为70 min和45 min，效率较低。

分析所查阅的国内外分离叶黄素的HPLC法后，首先对文献[6]报道的HPLC法进行了尝试，HPLC分析条件为：柱温25 ℃，流速0.8 mL/min，检测波长450 nm，流动相A为水，流动相B为甲基叔丁基醚，流动相C为甲醇，线性梯度洗脱，A的比例始终为5%，B在8 min内由25%增至47%，之后在19 min内持续增至85%，最终在1 min内由85%降至30%，测定结果见图1a。可知，此方法分离效果很不好，主峰之前的多种物质未达到基线分离。之后多次调整了线性洗脱过程中流动相的配比，但分离效果仍然很不好，与开始图谱相差无几。

图1 不同条件下叶黄素的色谱图
Fig.1 Chromatograms of all-(E)-lutein under different separation conditions

在以上实验的基础上，将线性梯度洗脱调整为等梯度洗脱，流动相水-甲基叔丁基醚-甲醇配比为5∶45∶50（V/V），其他条件不变，分离效果如图1b所示，可看出所用的时间明显缩短，但在主峰上仍存在肩峰。之后将流速由0.8 mL/min调整为0.4 mL/min，检测结果见图1c，与图1b相比，各组分出峰时间延迟，分离效果稍好，但仍未达到基线分离，色谱峰峰形也亟需改善。在流速为0.4 mL/min的基础上，将流动相配比调整为5∶50∶45（V/V），结果如图1d所示，由图1d可知，主峰与前一种物质没有完全分离，而且主峰存在拖尾现象。经过上述调整得出的谱图可知，此方法不能使叶黄素类物质达到基线分离。为使这些物质达到良好的分离度，参照Lakshminarayana等 [8]建立的色谱方法，选取二氯甲烷、乙腈、甲醇为流动相，通过调整流动相比例、温度、流速、洗脱时间等来增加分离度，进而达到最佳分离效果。

遴选出流动相A二氯甲烷、流动相B乙腈、流动相C甲醇后，参照文献[5]中的色谱方法，考察以下流动相配比对样品测定的影响。A-B-C配比（V/V）：a. 20∶60∶20；b. 20∶50∶30；c. 20∶40∶40；d. 20∶30∶50；e. 20∶20∶60，检测结果见图2。由图2可知，在由流动相a逐渐调整至流动相e的过程中，样品中各物质全部洗脱所用的时间是逐渐缩短的，其中流动相a、b未使样品中各组分较好分离，流动相c、e得到的色谱峰对称性稍差，峰形欠满意，流动相d使样品中各物质达到有效分离，拖尾现象有明显改善，峰形较好。

图2 不同流动相配比条件下叶黄素的色谱图
Fig.2 Chromatograms of all-(E)-lutein using different mobile phase compositions

实验比较了0.6、0.8、1.0 mL/min 3 种流速条件下样品中叶黄素的分离情况，结果发现，流速为1.0 mL/min时，样品中不同组分可达到有效分离，而流速为0.6、0.8 mL/min时，各组分出峰时间延后，效率较低，检测成本增加。

改进后的H P L C条件：色谱柱C 3 0（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温25 ℃；检测波长450 nm；时间13 min；流速1.0 mL/min；进样量20 μL；DAD光谱收集范围250～600 nm；流动相为二氯甲烷-乙腈-甲醇（20∶30∶50，V/V）。

分别对叶黄素标准品和叶黄素顺式异构体样品进行检测，C 30-HPLC色谱图分别见图3～5。根据色谱图只能鉴定峰4为全反式叶黄素，为确定色谱图中其他峰的归属，对样品进行MS分析。分析可知图中峰1、2、3、5、6的质谱图与峰4的质谱图类似，它们具有共同的特分子离子峰：[M＋H＋-H 2O](m/z 551)，从而可以判断峰1、2、3、5、6皆为叶黄素异构体。此外，各物质峰的m/z在大于570范围内还含有较多的离子碎片，这可能是由于在制取的叶黄素样品溶液中含有少量的棕榈油。

图4 在170 ℃棕榈油中加热120 min后叶黄素的色谱图
Fig.4 Chromatogram of lutein in palm oil heated at 170 ℃ for 120 min

图5 全反式叶黄素及其顺式异构体质谱图
Fig.5 Mass spectra of all-(E)-lutein and its (Z)-isomers

仅通过质谱图不能鉴定叶黄素异构体的种类，还需要结合这些化合物的紫外-可见光谱特性（图6）、Q值、Ⅲ/Ⅱ等参数及相应的文献值对其进行一一鉴定。

图6 高温异构化得到的全反式叶黄素及其顺式异构体的的光谱图
Fig.6 Spectra of all-(E)-lutein and (Z)-isomers

从图3、4及峰4的光谱特性可确定，峰4为全反式叶黄素。通过以下程序对其顺式异构体进行初步的鉴定：首先，与全反式叶黄素相比，单顺式异构体的最大吸收波长通常有4～6 nm的蓝移，双顺式异构体则有8～12 nm的蓝移 [16]；其次，单顺式异构体在330～340 nm间有顺式吸收，且顺式双键越靠近分子的中心，其顺式吸收越大（通常用Q值来表示顺式吸收峰的强度）；最后，叶黄素和β-胡萝卜素均为类胡萝卜素，都具有共同的异戊二烯结构，故它们相应位置异构体的洗脱顺序具有一致性。据此，根据图6和表1中物质的光谱特性初步鉴定峰1、2、3、5、6为单顺式异构体。

表1 样品中叶黄素异构体的鉴定
Table 1 Identification of all-( )-lutein and its ( )-isomers

注：参考文献[19,20-24]。

峰标号叶黄素异构体吸收峰/nmⅢ/Ⅱ/%Q值m/z测定值测定值文献值测定值文献值测定值文献值115-顺式330,414,442,471329,416,438,46539300.310.50459,491,533,551 213-顺式334,414,440,466330,417,436,46328310.460.44459,533,551 313’-顺式334,418,441,466331,417,438,46541430.450.41521,547,551 4全反式422,448,474423,444,47263650.050.09459,493,533,551 59-顺式333,418,442,470334,420,442,47064670.110.12459,493,551 69’-顺式334,418,442,470332,420,444,47247500.350.14459,551

为进一步确定各个峰的归属，计算整理了各物质的最大吸收波长、Ⅲ/Ⅱ和Q值，并与相关报道进行对照。Koyama等 [17]在分离全反式β-胡萝卜素及其顺式异构体时发现：1）它们最大吸收波长的大小顺序依次为全反式β-胡萝卜素＞15-顺式-β-胡萝卜素＞13-顺式-β-胡萝卜素；2）顺式吸收峰强度依次为15-顺式-β-胡萝卜素＞13-顺式-β-胡萝卜素＞全反式β-胡萝卜素。Aman等 [18]采用DAD-HPLC-APCI-MS和NMR技术对13-顺式、13’-顺式、9-顺式和9’-顺式叶黄素进行鉴定。Bialek-Bylka等 [19]分离鉴定了全反式叶黄素及其顺式异构体，发现它们最大吸收波长的变化规律为全反式叶黄素＞9-顺式/9’-顺式叶黄素＞13-顺式/13’-顺式叶黄素，而顺式峰吸收强度则呈现相反的顺序。将得出的数据与上述文献报道比较后发现结果具有高度的一致性，故可以确定峰1、2、3、5、6分别为15-顺式叶黄素、13-顺式叶黄素、13’-顺式叶黄素、9-顺式叶黄素和9’-顺式叶黄素，它们的结构图见图7。

图7 鉴定出的全反式叶黄素及其异构体的化学结构
Fig.7 Chemical structures of all-(E)-lutein and its isomers identified from sample

分别取质量浓度为0.2、1、3、5、7、9、11、13 μg/mL的反式叶黄素标准液，采用建立的HPLC法检测，每个系列质量浓度进样3次，以进样量（ng）为横坐标、相应的吸收峰面积为纵坐标进行线性回归分析，得到反式叶黄素的标准曲线回归方程为Y=9.420 7X－10.127 7（R 2=0.999 7）。反式叶黄素溶液质量浓度在0.2～13 μg/mL范围内（即含量在4～260 ng之间），其峰面积和进样量呈良好的线性关系。在3倍信噪比的条件下，使用二极管阵列检测器的最低检出限为2.4 ng。

计算得到的加标回收率良好，均在95%以上，其RSD小于3.1%，结果如表2所示。

表2 加标回收率和RSD（ =6）
Table 2 Recoveries and relative standard deviations ( = 6) from spiked sample

叶黄素含量/ng序号含量加标量加标样品含量回收量178.591087.739.5495.402.53 278.5930107.3828.7995.972.94 378.5990165.1186.5296.133.07回收率/%RSD/%样品

叶黄素样品溶液中叶黄素含量RSD分别为0.94%、1.05%和0.57%，均小于2%，结果表明此方法的精密度很高。

在－18 ℃条件下密封避光保存10 h内样品溶液中叶黄素含量RSD为1.39%，小于2%，结果表明在此条件下保存10 h内样品溶液稳定性良好。

3 结论

建立了C 30-HPLC-DAD-APCI-MS高效、快速检测叶黄素异构体方法，叶黄素热异构化样品中各物质在12 min内达到有效分离；准确地对全反式叶黄素及其异构体进行定性定量分析，确定出5 种叶黄素类化合物：15-顺式、13-顺式、13’-顺式、9-顺式、9’-顺式；绘制出全反式叶黄素的标准曲线Y=9.420 7X－10.127 7（R 2=0.999 7），全反式叶黄素溶液质量浓度在0.2 ～13 μg/mL范围内（即含量在4～260 ng之间）峰面积和进样量呈良好的线性关系。该方法操作简单、灵敏度高，可用于监测加工、贮藏过程中叶黄素的顺、反异构化反应进程。

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LI Dajing 1,2, LIU Chunju 1,2, XIAO Yadong 1, PANG Huili 1, LIU Chunquan 1,2, *
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. National Vegetable Processing Technology R&D Sub-centers, Nanjing 210014, China)

Abstract：This study aimed to establish a rapid method for the determination of lutein stereoisomers by high performance liquid chromatography-diode array detection (HPLC-DAD) combined with atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (APCI-MS). Using a mobile phase composed of dichloromethane, acetonitrile and carbinol (20:30:50, V/V) at a fl ow rate of 1.0 mL/min, lutein and its stereoisomers were separated effectively with good shape and without tailing phenomenon. Lutein generated 15-, 13,13’- and 9,9’-mono-cis-lutein during thermal isomerization as identifi ed based on the maximum absorption wavelength, Q value, mass spectral characteristics and relevant literature data. Peak area and injection amount of lutein showed a good linear relationship in the range of 4–260 ng. The recovery rate was higher than 95%, and the relative standard deviations (RSDs) of both precision and stability were lower than 2%. The method has the advantage of good separation, high accuracy and repeatability.

李大婧, 刘春菊, 肖亚冬, 等. 叶黄素及其顺式异构体的快速检测[J]. 食品科学, 2016, 37(4): 206-211. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201604037. http://www.spkx.net.cn

LI Dajing, LIU Chunju, XIAO Yadong, et al. A method for rapid determination of lutein and its stereoisomers[J]. Food Science, 2016, 37(4): 206-211. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604037. http://www.spkx.net.cn

基金项目：江苏省农业科学院基本科研业务专项（ZX（15）1008）

作者简介：李大婧（1976—），女，研究员，博士，主要从事果蔬加工与综合利用研究。E-mail：lidajing@163.com

*通信作者：刘春泉（1959—），男，研究员，硕士，主要从事农产品精深加工与产业化开发研究。E-mail：liuchunquan2009@163.com

叶黄素及其顺式异构体的快速检测

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论