段 兵，何太喜，范媛媛，郑 冰
（顺德出入境检验检疫局，广东 顺德 528303）
摘 要：建立用凝胶渗透色谱-超高效液相色谱-串联质谱仪测定茶叶中吡虫啉和啶虫脒残留的方法。样品经乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶液涡旋混匀后超声提取，经凝胶渗透色谱净化后，采用超高效液相色谱-串联质谱仪测定。结果显示，2 种农药在0.5～100 μg/L范围内线性良好，相关系数R 2均大于0.99。吡虫啉和啶虫脒的检出限分别为2.0 μg/kg和1.0 μg/kg，定量限分别为5.0 μg/kg和3.0 μg/kg。吡虫啉和啶虫脒在3 个水平的加标平均回收率为76.94%～91.68%，相对标准偏差为2.67%～7.90%。
关键词：吡虫啉；啶虫脒；凝胶渗透色谱；超高效液相色谱-串联质谱；茶叶
吡虫啉和啶虫脒都属于烟碱类农药，作用于烟酸乙酰胆碱酯酶受体，干扰害虫运动神经系统，对有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等杀虫剂产生抗性的害虫有很好的杀灭效果 [1]。啶虫脒和吡虫啉广泛用于茶叶生产中，主要用于防治茶树小绿叶蝉、飞虱、蓟马等害虫 [2]。但近年来，欧盟的科学家观察到烟碱类农药对蜜蜂的运动神经有严重伤害 [3-5]，因此将限制3 种农药（吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺）在欧洲使用，此外欧食品安全局也正在重新评估吡虫啉和啶虫脒对神经发育和功能的不良影响，正加紧出台对这2 种农药更严格的限制措施 [6]。目前，吡虫啉和啶虫脒的检测方法主要有气相色谱法 [7-8]、液相色谱法 [9-11]以及液相色谱-质谱联用法 [12-21]。农残净化方式大多采用固相萃取 [7-9,11,14-16]或基质分散固相萃取 [12,17-18]，缺点是耗材成本偏高且通用性不强。凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）是基于体积排阻原理，根据分子质量大小进行分离的一种净化手段 [22-25]，能有效将茶叶中的色素以及脂类等大分子干扰物和目标物分离。本实验建立了以凝胶渗透色谱为净化手段，高效液相色-串联质谱联用仪检测茶叶中吡虫啉和啶虫脒的方法。
1.1 材料、试剂与仪器
红茶、绿茶、普洱茶、茉莉花茶和乌龙茶均为实验室检验样品。
啶虫脒、吡虫啉标准品（纯度＞99%） 德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸、乙腈（均为色谱纯）美国Sigma公司；环己烷（色谱纯） 美国Tedia公司；乙酸乙酯（分析纯） 广州化学试剂厂。
Quattro Primier XE三重四极杆质谱联用仪（配电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）） 美国Waters公司；LabTech Autoclean凝胶色谱仪（配Bio-Beads S-X3，20 mm×300 mm净化住） 美国莱伯泰科公司；KQ-100DE超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；Milli-Q纯水系统 美国密理博公司。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液的配制
准确各称取10 mg左右（精确到0.1 mg）啶虫脒和吡虫啉标准品，分别用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，－18 ℃保存。使用时根据需要稀释相应质量浓度的混标，现配现用。
1.2.2 样品的处理
称取5 g样品，精确到0.01 g，置于50 mL有盖离心管，加入20 mL乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶液涡旋1 min混匀，超声提取20 min，6 000 r/min离心5 min，上清液倒入鸡心瓶，沉淀再加入10 mL乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶液重复提取一次，合并提取液后旋转蒸发至干，用乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶液定容至8 mL待GPC净化。
GPC进样量：满环进样（5 mL）；流动相：乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶液；流速：5 mL/min，收集10～17 min馏分。收集馏分旋转蒸干，用乙腈-0.1%甲酸（2∶8，V/V）溶液溶解定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜，高效液相色谱-串联质谱联用仪分析。
1.2.3 液相色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C 18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液（20∶80，V/V）；等度洗脱，流速0.25 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL。
1.2.4 质谱条件
离子源：ESI源；模式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流速：500 L/h；锥孔气流量：100 L/h；离子源温度：110 ℃；毛细管电压：3.0 kV；定量离子、定性离子、裂解电压及碰撞能量参考值见表1。
表1 吡虫啉和啶虫脒的母离子、子离子及相对应的锥孔电压、碰撞能量
Table 1 Precursor ions, product ions, cone voltages and collision energies for imidacloprid and acetamiprid
注： *.定量离子。
电压/V碰撞能量/V吡虫啉256.1175.1 *2218 256.1209.12218啶虫脒223.2126 *2822 223.2902835化合物母离子（m/z）子离子（m/z）锥孔
2.1 前处理条件的优化
基于目标物的极性，本实验考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶液4 种溶剂，按1.2.2节的步骤进行实验，甲醇、乙腈的提取溶液较乙酸乙酯和乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶液的颜色浅，共萃物质少，但经过GPC净化后对收集的馏分进行分析，这4 种溶剂的基质影响和回收率相差不大，考虑到乙腈的毒性较大且GPC的流动相为乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶液，因此本实验采用乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶液作为提取溶剂。
2.2 凝胶色谱条件的优化
茶叶提取液含有色素、茶多酚和脂多糖等大分子干扰物，因此可以选择GPC作为净化手段，采用Bio-Beads S-X3，20 mm×300 mm净化柱，乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶液作为流动相，5 mL/min的流速。样品分析之前，需要确定目标物在GPC上的洗脱规律，将5 mL混合标准溶液（含分析物100 ng，乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶液稀释）过GP C净化，从0 min开始，每2 min收集一次馏分于一支收集管，共收集10 支。然后分别检测各收集管目标物含量以绘出洗脱曲线，结果见图1。从GPC洗脱曲线可以看出，2 种目标物在10～17 min流出，因此本实验收集10～17 min的馏分。
图1 GPC洗脱曲线
Fig.1 GPC elution curve
2.3 方法线性关系和检出限
取5 份空白样品，按1.2.2节进行处理，分别用0.5、1、5、10、50、100 μg/L的2 种农药混合标准溶液各1 mL定容，过滤后上质谱分析，以定量离子响应强度（y）对标准溶液质量浓度（x）绘制标准曲线，结果显示，吡虫啉和啶虫脒在0.5～100 μg/L范围内有良好的线性关系。同时做空白样品加标实验，以每种农药信噪比R SN=3条件下确定为检出限，以R SN=10条件下确定为定量限，结果见表2。
表2 吡虫啉和啶虫脒的线性方程、线性范围、相关系数、检出限、定量限
Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (R
2), limits of detection (LOD,
SN= 3), and limits of quantification (LOQ,
SN= 10) for imidacloprid and acetamiprid
化合物线性方程线性范围/定量限/（μg/kg）吡虫啉y=768.066x＋201.5080.5～1000.996 32.05.0啶虫脒y=867.839x＋256.8570.5～1000.992 11.03.0（μg/L）R 2检出限/（μg/kg）
2.4 回收率和精密度实验结果
表3 茶叶中添加吡虫啉和啶虫脒的回收率及相对标准偏差（n=6）
T
Taabbllee 33 RReeccoovveerriieess aanndd RRSSDDss ooff iimmiiddaacclloopprriidd aanndd aacceettaammiipprriidd ssppiikkeedd into teeaa ((n==66))
添加量/（μg/kg）吡虫啉 啶虫脒平均回收率/%相对标准偏差/%平均回收率/%相对标准偏差/% 5.076.947.9084.063.55 1088.574.5686.703.90 2587.644.3891.682.67
图2 阳性样品和空白样品添加回收TIICC图
Fig.2 Total ion current (TIC) chromatogram of positive sample (A) and spiked sample (B)
本实验选择红茶样品在5、10、25 μg/kg三个水平添加吡虫啉和啶虫脒进行回收率实验，按1.2.2节处理样品，每个水平做6 个平行，计算回收率和相对标准偏差。结果如表3所示。在3 种添加条件下，吡虫啉和啶虫脒的平均回收率范围为76.94%～91.68%，相对标准偏差为2.67%～7.90%。结果比较理想。阳性样品和空白样品添加回收总离子流图（total ion chromatogram，TIC）见图2。
2.5 样品分析
按照本实验方法对实验室出口欧盟的红茶、绿茶、普洱茶、茉莉花茶和乌龙茶样品各10 个批次进行检测，结果表明：在茉莉花茶和普洱茶中未检测出吡虫啉和啶虫脒残留，而红茶、绿茶和乌龙茶则分别有5、5 批次和3 批次中检测出吡虫啉和啶虫脒的残留，但其含量均未超出欧盟规定的吡虫啉低于50 μg/kg和啶虫脒低于100 μg/kg的要求。
本研究了凝胶渗透色谱作为净化手段，建立了茶叶中吡虫啉和啶虫脒残留检测的高效液相色谱-串联质谱的分析方法，该方法前处理相对于固相萃取方法成本较低，同时对干扰基质的净化效果比较理想。该方法也可用于分析茶叶中其他一些脂溶性农药残留的分析。
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Determination of Imidacloprid and Acetamiprid in Tea by Gel Permeation Chromatography-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
DUAN Bing, HE Taixi, FAN Yuanyuan, ZHENG Bing
(Shunde Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shunde 528303, China)
Abstract：A method was developed for the determination of imidacloprid and acetamiprid residues in tea using gel permeation chromatography (GPC)-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Tea samples were extracted with acetonitrile under ultrasonic irradiation and cleaned up with GPC. The elution fractions at retention times between 10 and 17 min were collected for subsequent analysis. The portions collected from GPC were blown to dryness under nitrogen gas stream and then the residue was re-dissolved with acetonitrile-0.1% formic acid. The calibration curves developed were linear in the range of 0.5–100 μg/L with a correlation coefficient higher than 0.99. The limits of detection (LODs) for imidacloprid and acetamiprid were 2.0 and 1.0 μg/kg, and the limits of quantification (LOQs) were 5.0 and 3.0 μg/kg, respectively. The average recoveries of the method at three different spiked levels ranged from 76.94% to 91.68% for imidacloprid and acetamiprid with relative standard deviations (RSDs) from 2.67% to 7.90%.
Key words：imidacloprid; acetamiprid; gel permeation chromatography (GPC); ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); tea
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201604043
中图分类号：O657.63
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）04-0238-04
引文格式：
段兵, 何太喜, 范媛媛, 等. 凝胶渗透色谱-超高效液相色谱-串联质谱测定茶叶中吡虫啉和啶虫脒[J]. 食品科学, 2016, 37(4): 238-241. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604043. http://www.spkx.net.cn
DUAN Bing, HE Taixi, FAN Yuanyuan, et al. Determination of imidacloprid and acetamiprid in tea by gel permeation chromatography-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2016, 37(4): 238-241. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604043. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2015-04-20
作者简介：段兵（1977—），男，硕士，研究方向为食品安全。E-mail：ysdb@hotmail.com