图1 质量浓度对胞外多糖溶液表观黏度的影响
Fig.1 Effect of EPS concentration on the visco sity of EPS solution
陈志娜1，杨希娟2，师俊玲3,*
（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.青海省农林科学院，青海 西宁 810000；3.西北工业大学生命科学 学院，陕西 西安 710072）
摘 要：以西藏灵菇发酵乳中分离纯化所得胞外多糖为研究对象，对其流变学特性进行了系统研究。结果表明，该胞外多糖的水溶液表现为典型的非牛顿假塑性流体特性，且其流动行为受胞外多糖的质量浓度、pH值、温度、离子种类和浓度的影响，具体表现为：胞外多糖溶液的黏度随胞外多糖质量浓度的升高而增加，质量浓度越高剪切稀释现象越明显；pH 4.0和pH 10.0时胞外多糖溶液黏度明显低于pH 7.0。Na＋可使胞外多糖溶液的黏度显著增大，且Na＋浓度越高，溶液黏度越大；Ca2＋可使胞外多糖溶液的黏度明显下降，但其下降幅度与Ca2＋浓度无关；温度在10～85 ℃范围内胞外多糖溶液的黏度变化很小，有很好的耐温性。加入10 mg/mL的该胞外多糖能够明显增加脱脂乳的黏度。
关键词：西藏灵菇；胞外多糖；流变学特性；稳态分析；动态振荡剪切分析
引文格式：
陈志娜,杨希娟,师俊玲.西藏灵菇发酵乳胞外多糖的流变学特性[J].食品科学,2016,37(5):1-5.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605001.http://www.spkx.net.cn
CHEN Zhina,YANG Xijuan,SHI Junling.Rheological properties of exopolysaccharide produced by Tibetan kefir[J].Food Sc ience,2016,37(5):1-5.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605001.http://www.spkx.net.cn
西藏灵菇，类似于目前很流行 的开菲尔粒（ kefir），是由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌多种微生物共生形成的一种不规则的粒状混合物[1-2]，在其生长繁殖过程中可分泌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）[3]。研究发现，kefir胞外多糖具有免疫调节[4]、抗菌性[5]和抗肿瘤[6]等功能。近年来，多糖作为稠化剂、稳定剂、乳化剂在食品工业的应用越来越广泛[7-9]，这些都归功于其优良的流变学特性。从西藏灵菇中分离所得乳酸菌所产胞外多糖的特性，包括其结构、生理活性及理化性质等已有所报道[10-13]，但是，有关西藏灵菇菌粒复合体所产胞外多糖的特性，特别是对其流变学特性的研究尚未见报道。
本课 题组在前期研究中，对西藏灵菇发酵乳中的胞外多糖进行了分离纯化，分析得知其单糖组成为葡萄糖和半乳糖，整个多糖具有良好的抗氧化活性，并对2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（2,2’-azobis(2-aminopropane)dihyrochloride，AAPH）诱导的蛋白损伤具有一定的保护作用[14]。本实验在前期研究的基础上，重点研究了该胞外多糖的流变学特性，考察了质量浓度、pH值、体系温度及盐离子对其表观黏度的影响，研究了其对脱脂乳黏度的提升作用，以期为其在乳制品加工中的实际应用提供理论指导。
1.1菌株、材料与培养基
西藏灵菇菌株（TK01）采集于西藏，保藏于西北农林科技大学食品科学与工程学院食品生物加工与安全实验室。
新鲜牛乳，采购于西北农林科技大学畜牧养殖场。
脱脂牛乳培养基：鲜牛乳在4 000 r/min离心10 min去脂后，每100 mL分装于250 mL的锥形瓶中，105 ℃条件下灭菌20 min，备用。
1.2仪器与设备
ZX7M-AR1000流变仪 美国TA公司；R-210旋转蒸发仪 瑞士Büchi公司；HC-3018R高速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司；FD-1C-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；BT25S电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
1.3方法
1.3.1 西藏灵菇发酵乳中胞外多糖的提取
将西藏灵菇菌接种到脱脂牛乳培养基中，25 ℃静置培养24 h后，无菌条件下滤去西藏灵菇菌，剩余的发酵液于100 ℃条件下加热10 min，溶解黏附在细胞表面的多糖[11]，过滤后过夜醇沉。Sevag法[15]去蛋白后，冷冻干燥得到白色蓬松状西藏灵菇胞外多糖。
1.3.2 质量浓度对胞外多糖溶液流变学特性的影响
用去离子水配制质量浓度分别为5、10、20 mg/mL的胞外多糖溶液，测定不同质量浓度胞外多糖溶液的表观黏度。测定条件为：温度25 ℃，椎板（40 mm，1o），测定模式为稳态剪切测定，数据获取模式为连续读取；以剪切速率为自变量，变化范围为1～100 s－1，扫描完成时间为10 min，变量扫描范围设定为线性。
1.3.3 体系pH值对胞外多糖溶液流变学特性的影响
用HCl或Na OH溶液调节多糖溶液（质量浓度为10 mg/mL）的pH值分别至4.0、7.0、10.0。用流变仪测定酸碱度对胞外多糖溶液表观黏度的影响，测定条件与1.3.2节相同。
1.3.4 离子种类和浓度对胞外多糖溶液流变学特性的影响
取质量浓度为10 mg/mL的胞外多糖溶液，分别加入NaCl和CaCl2，使溶液中的钠离子和钙离子浓度分别为0.1、0.4 mol/L。用流变仪测定盐离子对胞外多糖溶液表观黏度的影响，测定条件与1.3.2节相同。
1.3.5 体系温度对胞外多糖溶液流变学特性的影响
取质量浓度为10 mg/mL的多糖溶液，用流变仪测定体系温度对胞外多糖溶液表观黏度的影响。测定条件：椎板（40 mm，1o），测定模式为稳态剪切测定，数据获得模式为温度梯度升高，温度扫描范围为10～85 ℃，自变量为剪切速率，范围为1～100 s－1。
1.3.6 胞外多糖溶液的动态振荡剪切实验
用去离子水配制质量浓度分别为5、10、20 mg/mL的胞外多糖溶液，分别测定其表观黏度在不同剪切振荡频率下的变化。测定条件：温度25 ℃，椎板（40 mm，1o），测定模式为振荡，数据获取模式为连续读取，以剪切振荡频率为自变量，范围为（0～10 Hz），扫描完成时间为10 min。
1.3.7 胞外多糖对脱脂乳流变学特性的影响
用去离子水配制质量浓度为100 mg/mL的脱脂乳溶液，将胞外多糖以10 mg/mL加入脱脂乳溶液中，同时以不添加胞外多糖的脱脂乳作对照。测定两种脱脂乳溶液在剪切速率变化时溶液黏度的变化。测定条件为：温度25 ℃，椎板（40 mm，1o），测定模式为稳态剪切测定，数据获取模式为连续读取，以剪切速率为自变量，范围为（0～300 s－1），扫描完成时间为10 min，变量扫描范围设定为线性。
2.1质量浓度对胞外多糖溶液流变学特性的影响
图1 质量浓度对胞外多糖溶液表观黏度的影响
Fig.1 Effect of EPS concentration on the visco sity of EPS solution
由图1可知，在所用剪切速率范围（0～100 s－1）内，胞外多糖溶 液的表观黏度随着胞外多糖溶液质量浓度的增大而增加。这是因为胞外多糖质量浓度的增加加强了多糖链之间的相互作用，部分多糖分子相互联结，导致聚合程度增加[16]。其中，当剪切速率较低时，不同质量浓度的胞外多糖溶液均表现为典型的非牛顿流体特性：即溶液黏度随着剪切速率的增加而减小的假塑性和剪切稀释的流动特征。剪切速率较高时，不同质量浓度的胞外多糖溶液随着剪切速率的增加表现为恒定的理想牛顿流体行为。这一特性与已报道的融合菌株G23胞外多糖的流动行为相似[17]。Adeli[18]和Vardhanabhuti[19]等认为，多糖链的取向效应导致了剪切稀释现象的产生：剪切速率增加时，长而无序链的聚合物大分子的流动方向越来越趋于一致，从而使其彼此间的交互作用减弱。剪切稀释特性在乳品加工中具有重要的意义： 在搅拌过程中，随着搅拌速率的增加，乳品的表观黏度下降；而当搅拌速率减慢直至停止时，乳品的黏度增加[20]，这更有利于凝固性发酵乳的加工生产。
根据已有报道，理想牛顿流体行为在纯溶剂或小分子物质溶液中非常普遍[21]，而多糖则因为分子质量较大以及延展构象，所以多表现出非牛顿流体的剪切稀释现象[22]。但是也有文献报道，一些大分子多糖也表现出牛顿流体行为[23-24]。例如，Kale等[25]对不同来源的阿拉伯木聚糖的流变学性质的研究发现，玉米麸皮多糖和switchgrass高粱麸皮多糖虽然在分子质量上差别很大，但是在高质量浓度时，两者都没有表现出剪切稀释现象；同时，sumac高粱麸皮多糖和玉米麸皮多糖的分子质量虽然相近，但是它们在高质量浓度时却表现出不一样的流动特性。因此，聚合物流动行为的切变依赖性可能不仅与其分子质量有关，还与其精细结构和构象有关。
2.2体系pH值对胞外多糖溶液流变学特性的影响
Medina-Torres等[26]研究发现，pH值可以改变聚合物分子的构象而导致其溶液黏度发生改变。图2显示，溶液的pH值发生变化时，能够显著改变胞外多糖的表观黏度：低pH值和高pH值都会使胞外多糖溶液的表观黏度明显下降。Chen等[27]研究发现，青海菜水溶性黏液的黏度在pH 5.0～9.0的范围内，随pH值的增大而呈现逐渐升高趋势。他们认为，黏液中的酸性多糖基团的电荷密度会随着pH值的增加而增多，从而促进第三电黏效应，进而导致黏液黏度的增加。Xiu Aihui等[28]对索拉胶溶液的流变学研究发现，该溶液的黏度能够在pH 6.0～12.0的范围内保持恒定，但是超过这一范围的pH值都会导致其黏度下降。本实 验所得胞外多糖在pH 4.0和pH 10.0时的黏度明显低于pH 7.0，这可能是因为该多糖在酸性或碱性环境下，导致了氢键断裂，促进了多糖的分解，从而降低了其表观黏度[29]。
图2 pH值对胞外多糖溶液表观黏度的影响
Fig.2 Effect of pH on the viscosity of EPS solution
2.3盐离子对胞外多糖溶液流变学特性的影响
图3 盐离子对胞外多糖溶液表观黏度的影响
Fig.3 Effect of salt ions on the viscosity of EPS solution
盐离子对多糖溶液表观黏度的影响是评价其流变学特性的重要因素。由图3可知，离子的类型和浓度对所得胞外多糖溶液的流变学特性都会产生显著影响。Na＋的添加会使多糖溶液的表观黏度显著增加；并且其黏度随着Na＋添加浓度增大而增加。而Ca2＋的添加则会使胞外多糖溶液的表观黏度产生明显下降，但Ca2＋浓度的变化对其黏度的影响不大。在0.4 mol/L的Na＋和Ca2＋存在下，所得多糖溶液仍然能够保持明显的假塑性流体特征。
从理论分析，无机盐离子可以通过屏蔽聚合物链上的带点基团之间的静电排斥而影响聚合电解质[30]，最终导致两种不同的结果：分子扩张的减少引起的黏度下降和分子间的缔合引起的黏度增加。本实验结果表明，NaCl的加入减少了多糖分子的电荷，促使了可溶性分子配合物的产生，从而导致黏度增加[19]；而CaCl2的加入则导致了多糖分子的紧密构象，改变了大分子的流体力学尺寸，从而引起黏度降低[31-32]。
2.4体系温度对胞外多糖流变学特性的影响
图4 温度对胞外多糖溶液表观黏度的影响
Fig.4 Effect of temperature on the viscosity of EPS solution
由图4可知，10 mg/mL的胞外多糖溶液的表观黏度在10～85 ℃的温度范围内表现为：随着温度升高而略有下降，但总体比较稳定。这说明，该胞外多糖溶液具有很好的热稳定性，能够适应不同温度的加热处理。根据已有报道，温度对胶体黏度的影响与 胶体的种类有关：黄原胶可以在很高的温度范围内保持黏度不变[33-34]，而半乳甘露聚糖的黏度随着温度从20 ℃到80 ℃下降50%[35]，而本实验所用多糖的黏度能够在一定的温度范围内保持相对稳定。说明其形成的胶体与已有研究报道稍微有所不同。
2.5胞外多糖溶液的动态振荡剪切实验结果
图5 不同质量浓度的胞外多糖溶液的储能模量（G’）与损耗模量（G’’）随频率变化规律
Fig.5 Frequency dependence of storage(G’)and loss(G’’)modulus of EPS solution with different concentrations
图5为不同质量浓度的胞外多糖溶液的动态振荡剪切实验结果。随着剪切振荡频率的增加3 个不同质量浓度的多糖溶液的储能模量（G’）和损耗模量（G’’）都表现出连续升高。在低频率条件下，G’’高于G’；当频率达到一定值时，G’’曲线与G’曲线相交，交点处频率称为交叉频率，通常被定义为弹性行为或凝胶状态的开始[36]。剪切振荡频率低于交叉频率时（G’’＞G’），多糖溶液主要表现为液体黏性性质；剪切振荡频率高于交叉频率时（G’’＜G’），多糖溶液主要表现为固体弹性性质[17,37]。本实验结果表明，随着多糖质量浓度的增加，溶液的交叉频率有所降低，这说明随着多糖质量浓度的增加，多糖溶液的胶体化程度增大，更多地表现为固体弹性性质。类似的结果也在其他研究中有所报道：Sengkhamparn等[37]对不同浓度的秋葵HBSS果胶水溶液的研究发现，果胶溶液的交叉频率随着果胶浓度的增加而降低；Gorret等[38]在P.acidipropionici产多糖溶液的流变学性质研究中也得到了相类似的结果。
2.6胞外多糖对脱脂乳溶液流变学特性的影响
图6 胞外多糖对脱脂乳表观黏度的影响
Fig.6 Effect of EPS addition on the viscosity of skim milk
图6为胞外多糖对脱脂乳溶液表观黏度的影响，添加了10 mg/mL胞外多糖的脱脂乳溶液的表观黏度显著高于未添加胞外多糖的脱脂乳溶液。而且，两种溶液的表观黏度均在0～50 s－1内随着剪切速率的增大而快速下降，表现为明显的剪切稀释作用。Ruas-Madiedo等[39]的研究发现，乳酸菌所产胞外多糖可以作为质地改良剂，明显地提高乳制品的黏度，还能够通过乳中的蛋白质胶粒相互作用而增强蛋白网络的刚性和稳定性。本实验所用多糖在乳液中的研究结果与此类似，说明其在乳制品中有很好的应用潜力。
本研究结果表明：西藏灵菇胞外多糖溶液表现为典型的非牛顿假塑性流体特性，具有很好的耐温性，碱性或酸性条件下，其表观黏度在会显著下降；Na＋可以增强其表观黏度，而Ca2＋会降低其表观黏度。西藏灵菇胞外多糖能够明显增加脱脂乳的黏度，表现出很好的应用潜力。
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CHEN Zhina1,YANG Xijuan2,SHI Junling3,*
(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Xining 810000,China; 3.School of Life Sciences,Northwestern Polytechnical University,Xi’an 710072,China)
Abstract:In this study,the rheological properties of exopolysaccharide(EPS)produced by Tibetan kefir were evaluated.The results showed that the aqueous EPS solution was a typical non-Newtonian pseudoplastic fluid,and its flow behavior was affected by concentration,pH,temperature,cation type and concentration.Specifically,the viscosity of EPS solution increased with its increasing concentration and the shear thinning phenomenon was more obvious.The viscosity of EPS solution at pH 10.0 or pH 4.0 was obviously lower than that at pH 7.0.The addition of Na+significantly increased the viscosity of EPS solution in a concentration-dependent fashion.However,the viscosity of EPS solution was greatly decreased when Ca2+was added.The viscosity of EPS solution little changed with good temperature resistance at 10–85 ℃.The viscosity of skim milk was significantly increased by adding 10 mg/mL of the EPS.
Key words:Tibetan kefir; exopolysaccharide; rheological properties; steady-state analysis; dynamic oscillatory shear analysis
中图分类号：TS252.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）05-0001-05
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605001
*通信作者：师俊玲（1972—），女，教授，博士，主要从事食品生物技术研究。E-mail：sjlshi2004@aliyun.com
作者简介：陈志娜（1988—），女，博士研究生，主要从事食品生物技术研究。E-mail：chenzhina0625@163.com
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31260395）
收稿日期：2015-04-16