废啤酒酵母菌对苹果汁中展青霉素的吸附作用

杜 杰1,郭彩霞2,*
(1.山西大学体育学院,山西 太原 030006;2.山西大学生命科学学院,山西 太原 030006)

摘 要:以啤酒厂废弃啤酒酵母菌为吸附剂,研究其对苹果汁中展青霉素的吸附效果和机理。结果表明,废啤酒酵母菌表面具有大量吸附展青霉素的基团,吸附时间、温度、pH值和展青霉素初始质量浓度是影响吸附的重要因素,吸附过程在20 h达到平衡,pH值为4.0时,继续增加pH值,吸附率变化不大;随着温度的升高,废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附率呈上升趋势;展青霉素的吸附率随着展青霉素初始质量浓度的增加而降低,且达到平衡时间变短。模型分析结果表明,Langmuir等温吸附模型可以有效模拟废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附过程,废啤酒酵母菌对展青霉素的最大吸附量在4、25、37 ℃分别为3.70、5.05、5.99 μg/g。废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附过程符合一级动力学模型,属于自发的吸热过程。

关键词:展青霉素;废啤酒酵母菌;吸附

引文格式:

杜杰,郭彩霞.废啤酒酵母菌对苹果汁中展青霉素的吸附作用[J].食品科学,2016,37(5):56-61.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605011.http://www.spkx.net.cn

DU Jie,GUO Caixia.Adsorption of patulin from apple juice by waste beer yeast[J].Food Science,2016,37(5):56-61.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605011.http://www.spkx.net.cn

展青霉素(patulin)又叫棒曲霉素,是一种由青霉属、曲霉属及丝衣霉属中多种微生物产生的真菌毒素,具有广泛的生理及细胞毒性[1-2]。苹果和苹果制品受展青霉素污染最为严重,展青霉素在苹果汁中稳定时间最长,80 ℃加热10~20 min有50%残留,果汁在60~90 ℃条件下巴氏杀菌处理10 s仅仅能降低18.8%展青霉素的含量[3],故引入苹果浓缩汁中的机率很大,人类饮食中的展青霉素主要来源于被霉菌污染的苹果和苹果汁[4-5],展青霉素已成为判断苹果汁质量安全性的一个重要指标[6]。因此,2004年,美国食品药品管理局(U.S.Food and DrugAdministration,FDA)规定浓缩苹果汁和苹果凊汁中展青霉素的限量标准为50 μg/L[7]

目前,对于展青霉素的控制方法,主要有物理方法、化学方法以及生物方法。其中,物理方法主要采用拣选、清洗、澄清、过滤、吸附、电磁辐射、微波处理以及紫外照射等措施对原料果及受展青霉素污染的苹果汁进行处理[8-12]。这些方法虽然能够有效降低展青霉素的含量,但不能完全杜绝。澄清、过滤等方法在去除展青霉素的同时,会引起果汁感官品质和理化性质的变化;而电磁辐射、微波处理以及紫外照射等手段,剂量低不足以完全降解展青霉素,剂量过高会引起果汁营养成分的损失。常用的化学去除方法有氨化作用、高锰酸钾氧化法、硫化处理、添加有机酸和维生素以及臭氧处理法等措施[13-17]。同样,这些方法在一定程度上能够实现对展青霉素的降解,但存在效果不稳定,化学物质与展青霉素反应机理和反应后的降解产物不确定等缺点。而且在食品中添加化学添加剂是不被提倡的,在一定程度上影响了食品的天然性。生物控制方法主要有生物降解和生物吸附两种。目前,对于展青霉素的降解,主要是酵母菌,而其余微生物如乳酸菌等未见报道。研究表明,酵母菌对展青霉素的降解有非常好的效果[18-19],但这一方法仅局限于发酵产品中。生物吸附作为一种新兴的展青霉素处理技术,其成本低廉、吸附特异性强、对目标物去除效率高、且来源丰富,是一种发展前景十分广阔的新兴方法。已有研究表明,死体微生物吸附剂对苹果汁中展青霉素具有很好的吸附效果[20-22]。本研究利用啤酒发酵过程中产生的废弃啤酒酵母菌作为吸附剂,在研究了吸附时间、pH值、温度、展青霉素初始质量浓度等影响因素的基础上,对吸附等温线、热力学和动力学作了进一步的研究,为废啤酒酵母菌对展青霉素吸附性能和吸附机理的深入研究奠定基础,也为开发新型廉价高效吸附材料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

废啤酒酵母菌由山西朔州燕京啤酒厂提供;苹果汁由市售新鲜苹果直接压榨过滤而成,经高效液相色谱测定未含有展青霉素。

展青霉素标准品(纯度≥99%)、甲醇(色谱级)、乙腈(色谱级) 美国Sigma公司;乙酸乙酯、无水硫酸钠、碳酸钠等。

1.2仪器与设备

LC-2010AHT高效液相色谱仪、UV-2550紫外分光光度计 日本岛津公司;PM180R冷冻离心机 德国SIM公司;NICOLET AVATAR傅里叶红外光谱仪 美国Nicolet公司;RE-2000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城仪器厂。

1.3方法

1.3.1 废啤酒酵母菌的制备及表征

将从啤酒厂获得的废啤酒酵母菌泥进行高压蒸汽灭菌15 min,经3 600×g离心10 min收集菌体,并用蒸馏水清洗3 次,于60 ℃烘箱中干燥至恒质量,经粉碎80 目过筛后,置于干燥器中备用。

将吸附前后的废啤酒酵母菌烘干,研磨成粉状,加入质量分数1%的溴化钾充分研磨混合,保持干燥,压片,利用傅里叶变换红外光谱仪测定红外吸附光谱图。

1.3.2 吸附实验

分别在50 mL含有一定质量浓度展青霉素的苹果汁(pH 4.0)中添加1.0 g废啤酒酵母菌,随后将苹果汁置于恒温摇床中处理,转速为120 r/min,处理时间为24 h,温度为25 ℃。对照组为没有添加废啤酒酵母的苹果汁,每个处理设3 次重复。处理结束之后使用高速冷冻离心机(3 600×g,15 min,4 ℃)对苹果汁进行离心,使废啤酒酵母菌沉淀并与苹果汁分离,收集上层苹果汁进行提取及检测展青霉素的含量。展青霉素吸附率的计算公式如下:

式中:R为t时间时吸附剂对展青霉素的吸附率/%;ρ0为苹果汁中展青霉素的初始质量浓度/(μg/L);ρt为吸附t时间后苹果汁中剩余展青霉素的质量浓度/(μg/L)。

1.3.3 吸附时间对废啤酒酵母菌吸附苹果汁中展青霉素的影响

称取废啤酒酵母菌干粉1.0 g,添加到50 mL含有100 μg/L展青霉素的苹果汁(pH 4.0)中。将装有苹果汁的三角瓶置于恒温摇床中处理,摇床转速为120 r/min,处理温度为25 ℃。处理时间分别设置为 0、1、5、10、20、30、40 h。分别在规定的时间内将样品取出,冷冻离心(3 600×g,4 ℃)收集上清液,提取纯化后检测其中展青霉素的含量。每个处理设3 次重复。

1.3.4 pH值对废啤酒酵母菌吸附苹果汁中展青霉素的影响

称取废啤酒酵母菌干粉1.0 g添加到50 mL含有100 μg/L展青霉素的苹果汁中,调节pH值分别为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5,将装有苹果汁的三角瓶置于恒温摇床中处理,摇床转速为120 r/min,处理温度为25 ℃,处理时间为30 h。在规定的时间内将样品取出,冷冻离心(3 600×g,4 ℃)收集上清液,提取纯化后检测其中展青霉素的含量。每个处理设3 次重复。

1.3.5 温度对废啤酒酵母菌吸附苹果汁中展青霉素的影响

通过改变所处环境的温度来考察温度对废啤酒酵母菌干粉吸附展青霉素的影响。将添加1.0 g废啤酒酵母菌干粉的展青霉素苹果汁溶液(50 mL,100 μg/L,pH 4.0)分别置于4、25、37 ℃条件下进行恒温摇床处理,摇床转速为120 r/min,处理时间分别设置为0、1、5、10、20、30、40 h。在规定时间内将苹果汁样品取出,冷冻离心(3 600×g,4 ℃)收集上清液,提取纯化后检测其中展青霉素的含量。每个处理设3 次重复。

1.3.6 展青霉素初始质量浓度对废啤酒酵母菌吸附苹果汁中展青霉素的影响

配制苹果汁中展青霉素的初始质量浓度分别为10、50、100、200、300 μg/L。将1.0 g废啤酒酵母菌干粉分别添加于不同展青霉素初始质量浓度的苹果汁中(50 mL,pH 4.0),同样将苹果汁置于恒温摇床中培养,摇床转速为120 r/min,处理温度为25 ℃。处理时间分别设置为0、1、5、10、20、30、40 h。在规定时间内将苹果汁样品取出,冷冻离心(3 600×g,4 ℃)收集上清液,提取纯化后检测其中展青霉素的含量。每个处理设3 次重复。

1.3.7 苹果汁中展青霉素的提取及测定

依据美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)标准[23],将吸附前后的苹果汁中展青霉素进行提取、净化及检测操作。样品中展青霉素含量利用高效液相色谱仪检测,色谱条件为:紫外检测器,检测波长276 nm;色谱柱为ODS C18反相柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水(10∶90,V/V);流速:1.0 mL/min;进样量:20μL;柱温:30 ℃。

1.3.8 等温吸附模型

等温吸附方程是在恒温的固液体系中,固体吸附剂和溶液达到平衡吸附动态,用以描述吸附量与溶液平衡浓度之间关系的方 程式。本研究中废啤酒酵母菌吸附展青霉素的吸附过程,采用Langmuir和Freundlich方程来线性表征吸附量qe(μg/g)和苹果汁中展青霉素的平衡质量浓度ρe(μg/L)之间的关系。

1.3.8.1 Langmuir等温吸附模型

Langmuir等温模型描述固体吸附剂对吸附质是单分子层吸附,表面上吸附位点分布均匀。

Langmuir方程式:

方程变形后Langmuir方程为线性形式:

式中:qm为吸附剂的最大吸附量/(μg/g);Kc为Langmuir常数/μg-1

1.3.8.2 Freundlich等温吸附模型

Freundlich等温模型用来描述吸附剂表面不均匀的非均相吸附体。

Freundlich方程式:

将方程两端取对数,方程变形为线性形式:

式中:Kf为吸附常数/g-1;n为吸附常数。

1.3.9 吸附热力学模型

Gibbs计算方程:

上述两方程合并后变形,得到线性方程为:

式中:Kc为吸附平衡常数;R为气体常数,8.314 J/(mol•K);T为绝对温度/K;ΔG°为吸附自由能/(kJ/mol);ΔH°为吸附焓变/(kJ/mol);ΔS°为吸附熵变/(J/(mol•K))。

1.3.10 吸附动力学模型

为研究废啤酒酵母菌吸附展青霉素过程的动力学机制,将得到的数据采用一级动力学和二级动力学方程进行拟合解释。

1.3.1 0.1一级动力学模型

Lagergren一级动力学方程为:

式中:qt为t时间时吸附剂对 展青霉素的吸附量/(μg/g);k1为一级动力学常数/min-1

将t=0,qt=0和t=t,qt=qt代入方程积分再取对数后,方程变形为:

1.3.1 0.2二级动力学模型

Lagergren二级动力学方程为:

式中:k2为二级动力学常数/(g/(μg·min))。方程变形后,线性方程为:

2 结果与分析

2.1废啤酒酵母菌的表征

图1为废啤酒酵母菌吸附苹果汁中展青霉素的红外光谱 图,按照文献[24]对吸收光谱进行归属,对于吸附前废啤酒酵母菌(图1A),在3 419.50、2 926.24、2 855.94、1 742.66、1 650.19、1 543.96、1 460.53、 1 376.53、1 050.28、655.37 cm-1处均有吸收峰。在3 419.50 cm-1处附近有一个强而宽的吸收峰,可归结于O—H键和N—H键的伸缩振动吸收;在2 926.24 cm-1和2 855.94 cm-1处出现了—CH2伸缩振动的吸收峰;在1 742.66 cm-1处的吸收峰是C=O键的振动吸收;在1 650.19 cm-1处出现的吸收峰属于蛋白质酰胺Ⅰ带中C=O键的伸缩振动和C—N键的弯曲振动;在1 543.96 cm-1处出现的吸收峰可归属于蛋白质酰胺Ⅱ带中N—H键的弯曲振动和C—N键的伸缩振动;在1 460.53cm-1处的吸收峰为C—H键引起的不对称弯曲振动或是来自于糖醛酸C—OH的伸缩振动;在1 376.53cm-1处的吸收峰属于蛋白质酰胺Ⅲ带C—N键和N—H键的混合振动峰;在1 050.28 cm-1处的吸收峰是归属于多糖骨架振动引起的C=O键伸缩振动吸收;655.37 cm-1的吸收峰为酵母菌的特征吸收峰。在废啤酒酵母吸附展青霉素后(图1B),1 650.19、1 050.28 cm-1处吸收峰发生位移,分别移到1 635.62、1 076.34 cm-1;1 376.53 cm-1处的吸收峰几乎消失。这说明羰基C=O键,氨基—NH键以及糖类物质中的C—OH在吸附过程中起到了一定作用。

图1 吸附前后废啤酒酵母菌红外光谱
Fig.1 FTIR spectra of waste beer yeast before and after biosorption

2.2吸附时间对吸附展青霉素的影响

吸附时间是影响展青霉素吸附的一个重要因素,本实验选取不同的吸附时间点取样测定展青霉素的吸附率,结果如图2所示。

图2 不同吸附时间对苹果汁中展青霉素的吸附效果
Fig.2 Effect of adsorption time on the adsorption efficiency of patulin in apple juice

由图2可知,在废啤酒酵母菌的作用下,随着吸附时间的增加,展青霉素的吸附率增加,吸附5 h后,其展青霉素的吸附率可达到39.61%,之后展青霉素的吸附率缓慢上升,直到20 h达到吸附平衡,吸附率可达64.33%。随后展青霉素的吸附率变化不太明显。这可能是因为在吸附开始时,吸附位点比较充足,溶液中展青霉素能够迅速与位点结合,随着吸附时间的增加,吸附位点变少,吸附开始变得缓慢,最后当吸附位点饱和时,吸附不再进行。

2.3pH值对吸附展青霉素的影响

据报道,展青霉素在酸性条件(pH 2.5~5.5)下较稳定,不易分解[25]。而废啤酒酵母菌对展青霉素的生物吸附很有可能是从多方面产生作用的,比如表面吸附,物质螯合等。因此,苹果汁本身的pH值对失活酵母吸附棒曲霉素起着至关重要的影响。图3显示了不同pH值对展青霉素吸附的影响。从图中可以看出,废啤酒酵母菌对苹果汁中展青霉素的吸附率随pH值的增加不断升高。当pH 2.5~3.0时,废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附率较低,且变化不大;之后,随着pH值的升高,展青霉素吸附不断增加,当pH值升高到4.0时,继续增加pH值,吸附率变化不大。pH值对废啤酒酵母菌吸附展青霉素的不同吸附效果可能是因为溶液中pH值的变化影响了废啤酒酵母表面的功能集团的电离,进而影响了菌体对展青霉素吸附能力的变化。

图3 不同pH值对苹果汁中展青霉素的吸附效果
Fig.3 Effect of pH on the adsorption efficiency of patulin in apple juice

2.4温度对吸附展青霉素的影响

当温度分别为4、25、37 ℃时,使用相同剂量的废啤酒酵母菌对初始质量浓度相同的展青霉素进行处理,考察温度对展青霉素吸附的影响,结果如图4所示。不同温度对于展青霉素在废啤酒酵母菌上的生物吸附有显著的影响(P<0.05)。随着温度的升高,废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附能力增加,说明该吸附过程是吸热过程,低温不利于展青霉素的吸附。而25 ℃和37 ℃条件下展青霉素的吸附率差异不是特别大,从实际生产的经济方面考虑,废啤酒酵母菌对展青霉素的生物吸附适宜在常温下进行。

图4 温度对苹果汁中展青霉素吸附的影响
Fig.4 Effect of temperature on the adsorption efficiency of patulin in apple juice

2.5展青霉素初始质量浓度对吸附展青霉素的影响

使用相同剂量的废啤酒酵母菌对初始质量浓度不相同的展青霉素进行处理,考察展青霉素初始质量浓度对展青霉素吸附的影响,结果如图5所示。随着展青霉素初始质量浓度的增加,废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附率明显降低,相反地,随着展青霉素初始质量浓度的升高,废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附量呈上升趋势,并且展青霉素质量浓度越高,其达到吸附平衡的时间越短。另外,废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附平衡量是随着展青霉素初始质量浓度的增加而增加的,直至达到吸附饱和状态。这种变化趋势,主要是因为苹果汁中的废啤酒酵母菌添加量一定,即吸附位点的总量一定,随着展青霉素初始质量浓度增大,被结合掉的吸附位点也增多,当吸附达到一定质量浓度时,溶液中已有的吸附位点基本结合完 全,即使再增加展青霉素初始的质量浓度,吸附剂对展青霉素的吸附总量也无法有太大改变。

图5 展青霉素初始质量浓度对苹果汁中展青霉素吸附的影响
Fig.5 Effect of initial patulin concentration on the adsorption efficiency of patulin in apple juice

2.6吸附等温线

在4、25、37℃3个不同温度下,将废啤酒酵母菌吸附展青霉素平衡时的数据分别采用Langmuir和Freundlich等温吸附模型进行拟合,结果如表1所示。Langmuir等温吸附模型的R2大于Freundlich等温吸附模型的R2,这说明采用Langmuir等温吸附模型更适合对数据进行模拟。采用Langmuir等温吸附模型拟合得到的参数中,Kc用来表示废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附稳定性,模型拟合得到的Kc值(1.034、1.122、1.147μg-1)都很小,表明这种吸附的稳定性很强。由Langmuir等温吸附模型拟合得到的理论最大吸附量qm(3.70、5.05、5.99μg/g)随着温度的升高而增加,说明废啤酒酵母菌吸附展青霉素的过程是一个单层吸热的过程。

表1 废啤酒酵母菌吸附展青霉素的等温吸附参数
Table 1 Adsorption isotherm parameters of waste beer yeast for patulin

温度/℃ Langmuir常数 Freundlich常数Kc/μg-1qm/(μg/g) R2 Kf/g-1 n R24 1.034 3.70 0.962 6.41 2.67 0.902 25 1.122 5.05 0.995 2.47 2.47 0.953 37 1.147 5.99 0.993 1.95 2.40 0.970

2.7热力学模型

由Langmuir等温吸附模型拟合得到的参数Kc,再根据热力学模型拟合出废啤酒酵母菌对展青霉素吸附的热力学参数,结果如表2所示。

表2 吸附热力学参数
Table 2 Thermodynamic parameters for patulin adsorption

热力学常数 4 ℃ 25 ℃ 37 ℃ΔG°/(J/mol)  -79.2  -286.5  -354.9 ΔH°/(kJ/mol) 2.293 ΔS°/(J/(mol·K)) 8.588

在不同温度下废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附自由能(ΔG°)均为负值,说明该吸附过程是自发进行的;吸附焓(ΔH°)为正值表明吸附过程是吸热过程,温度的升高有利于吸附的进行;而吸附熵(ΔS°)为正值,表明在吸附过程中增加了固相液相表面之间的无序性。

2.8动力学模型

对不同温度条件下得到的废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附动力学数据进行拟合,结果如表3所示。在不同温度下模拟得到的动力学模型,相比较而言,一级动力学模型具有较高的相关系数R2,且根据一级动力学方程计算得到的平衡吸附量比二级动力学方程计算出的平衡吸附量更接近实验得到的平衡吸附量qe。这表明采用一级动力学模型能够很好的模拟整个吸附过程,展青霉素是从液体溶液中转移到吸附剂表面的。

表3 一级动力学模型和二级动力学模型参数
Table 3 Parameters of adsorption kinetic equations

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3 结 论

红外分析结果表明,废啤酒酵母菌表面含有大量的功能基团,这些基团参与了废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附过程,而且羰基C=O键,氨基—NH键以及糖类物质中的C—OH在吸附过程中起到了主要作用。研究不同吸附条件对废啤酒酵母菌吸附展青霉素的影响。结果表明:随着吸附时间的增加,展青霉素的吸附率增加,吸附在20 h达到吸附平衡;随着pH值的升高,展青霉素吸附不断增加,当pH值升高到4.0时,继续增加pH值,吸附率变化不大;随着温度的升高,废啤酒酵母菌对展青霉素的吸附率呈上升趋势。在4、25、37 ℃条件下,废啤酒酵母菌吸附展青霉素均可以用Langmuir和Freundlich等温吸附模型来拟合,但相比较而言,Langmuir等温吸附模型的R2大于Freundlich等温吸附模型,这说明采用Langmuir等温吸附模型更适合对数据进行模拟。根据Langmuir等温吸附方程,废啤酒酵母菌对展青霉素的最大吸附量分别为3.70、5.05、5.99 μg/g。由吸附热力学结果可知,该吸附过程为自发的吸热过程。在吸附过程中固相液相表面之间的无序性增加了。废啤酒酵母菌吸附展青霉素的吸附动力学行为研究表明,吸附过程符合一级动力学模型,展青霉素是从液体溶液中转移到吸附剂表面的。

综上所述,废弃的啤酒酵母菌对吸附苹果汁中展青霉素而言是一种高效廉价的生物吸附剂。与传统展青霉素去除方法相比较,利用废啤酒酵母菌去除苹果汁中展青霉素的方法,不仅具有原料来源丰富、成本低、易操作、吸附效率高的优点;还可保护环境,充分利用环境资源,具有很好的研究意义和应用前景。

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Adsorption of Patulin from Apple Juice by Waste Beer Yeast

DU Jie1,GUO Caixia2,*
(1.School of Physical Education,Shanxi University,Taiyuan 030006,China; 2.College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

Abstract:Adsorption of patulin from apple juice by using waste beer yeast was investigated in this work.The results showed that a large number of function groups able t o adsorb patulin existed on the surface of waste beer yeast cells.Temperature,incubation time,pH and initial patulin concentration were important parameters affecting adsorption effi ciency.The adsorption reached equilibrium after 2 h.With increasing pH,the adsorption ratio reached a plateau at pH 4.0.Patulin adsorption ratio increased with increasing temperature,and decreased with increasing initial concentration of patulin,shortening the equilibration time.The adsorption equilibrium could be described by the Langmuir model.The maximum uptake capacities(qmax)obtained by the Langmuir model were 3.70,5.05 and 5.99 μg/g at 4,25 and 37 ℃,respectively.The adsorption kinetics of patulin by waste beer yeast was best descr ibed using a fi rst-order kinetic model.The adsorption process was spontaneous and endothermic in nature.

Key words:patulin; waste beer yeast; adsorption

中图分类号:TS201.6

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)05-0056-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605011

*通信作者:郭彩霞(1984—),女,讲师,博士,研究方向为食品安全与生物技术。E-mail:guocx@sxu.edu.cn

作者简介:杜杰(1985—),男,讲师,博士,研究方向为运动与营养安全。E-mail:sdwushu@sxu.edu.cn

基金项目:山西省基础研究计划项目(2015021139)

收稿日期:2015-04-26