图1 4 种半抗原衍生物结构式图
Fig.1 Structures of hapten derivatives
赖 丹，郑盛武，赵肃清*
（广东工业大学轻工化工学院，广东 广州 510006）
摘 要：以4-硝基邻苯二甲酸为原料，衍生合成4 种结构类似物，并分别通过重氮化法和活泼酯法与载体蛋白牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）偶联制得人工抗原。利用紫外光谱扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroporesis，SDS-PAGE）检测鉴定人工抗原，并用4 种与BSA偶联的人工抗原作免疫原免疫新西兰大白兔。利用酶联免疫吸附实验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测抗体灵敏度和特异性。经紫外光谱和SDS-PAGE证实人工抗原偶联成功，经免疫分析法检测抗体效价，4-氨基邻苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-aminophthalate-BSA，DBAP-BSA）抗体效价达到1∶64 000，4-戊二单酰邻苯二甲酸二丁酯-BSA（dibutyl 4-carboxylphthalte-BSA，DBCP-BSA）、4-氨基邻苯二甲酸二异丁酯-BSA（diisobutyl 4-aminophthalate-BSA，DiBAP-BSA）和4-氨基邻苯二甲酸二环己酯-BSA（dicyclohexyl 4-aminophthalate-BSA，DCHAP-BSA）抗体效价均达到1∶128 000。DBAP-BSA、DBCP-BSA、DiBAP-BSA和DCHAP-BSA分别对邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、DBP、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate，DiBP）和邻苯二甲酸二环己酯（dicyclohexyl phthalate，DCHP）4 种抗体的IC50值为0.305、0.268、0.104、0.247 μg/mL。四者之间交叉反应率低，反应特异性较好。
关键词：邻苯二甲酸酯；人工抗原；抗体
引文格式：
赖丹,郑盛武,赵肃清.4 种邻苯二甲酸酯塑化剂人工抗原的合成及免疫检测[J].食品科学,2016,37(5):114-120.
LAI Dan,ZHENG Shengwu,ZHAO Suqing.Synthesis of artificial antigens for immunoassay of four phthalate esters[J].Food Science,2016,37(5):114-120.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605021.http://www.spkx.net.cn
邻苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）又称钛酸酯、塑化剂，该类化合物一般为无色油状黏稠液体，易溶于有机溶剂，难溶于水，凝固点低，常温不易挥发[1]。邻苯二甲酸酯是重要的有机化工产品，目前在工业上主要用作聚氯乙烯等橡胶材料的增塑剂和软化剂，使用量约占全部增塑剂消费量的70%左右[2]。邻苯二甲酸酯与产品基质间通过氢键和范德华力结合，容易随着时间的推移，慢慢从塑料中迁移到周围环境，特别是在高温环境下更易向牛奶、肉类等含油脂性食品中迁移[3]。研究表明，PAEs是一种具有生殖毒性和遗传毒性的环境激素，对人体有致畸形、致癌、致突变等影响[4]。Pogribny 等[5]研究发现，给饲养中的雄性大鼠喂食邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（diethylhexyl phthalate，DEHP）后，会导致大鼠体内过氧化物酶体的增生，新陈代谢改变等，诱导肿瘤形成和肝细胞发生癌变。O’brien等[6]对聚丙烯（polypropylene，PP）塑料中邻苯二甲酸酯向橄榄油中的迁移进行研究发现，随着温度的升高邻苯二甲酸酯的迁移量增大，时间延长迁移也逐渐增加。
目前对邻苯二甲酸酯的检测方法主要有气相色谱（gas chromatography，GC）[7]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[8]、气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[9]和液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS）[10]等。但这些方法需要昂贵的仪器，复杂的操作，样品前处理复杂，不适用于大量样品的快速检测[11]。国内外有关免疫分析方法检测邻苯二甲酸酯的报道较少。免疫分析法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点，可以满足简单、快速、灵敏检测邻苯二甲酸酯的要求[12]。国外研究者利用免疫分析法主要侧重于邻苯二甲酸酯塑化剂对动物体毒理性质的研究。如Shea[13]研究了DEHP和邻苯二甲酸二异壬酯（diisononyl phthalate，DINP）对儿童健康的影响。国内工作者利用免疫分析法主要侧重于塑化剂抗原抗体的制备及样品中塑化剂含量的测定。如Wei Chenxi等[14]采用将半抗原直接包被于聚苯乙烯微量滴定板上的酶联免疫吸附实验方法来检测邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）。目前还未有从塑化剂的空间结构来探讨对抗体灵敏度的影响的研究。
本研究以4-硝基邻苯二甲酸为原料，通过酯化、还原反应改造衍生，合成了4 种不同结构的半抗原衍生物，分别经过重氮化法和活性酯法与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和卵清蛋白（ovalbumin，OVA）偶联反应，合成8 种人工抗原，为进一步建立免疫分析方法检测邻苯二甲酸酯塑化剂提供可靠的免疫原。
1.1材料与试剂
4-硝基邻苯二甲酸（纯度≥99%） 百灵威化学试剂有限公司；亚硝酸钠、盐酸 天津大茂化学试剂有限公司；二环乙基碳二亚胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、牛血清白蛋白（BSA，98.6%）、卵清蛋白（OVA，98%）、弗氏完全佐剂与不完全佐剂 美国Sigma公司；羊抗兔IgG-HRP二抗 武汉博士德生物工程有限公司；脱脂奶粉、四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB） 广州威佳生物科技有限公司；SPF级雌性新西兰大白兔 广东省医学实验动物中心；96孔可拆酶标板 厦门市云鹏科技发展有限公司。
包被缓冲液（0.1 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液）：Na2CO30.75 g、NaHCO31.46 g，加蒸馏水至500 mL；封闭液：含质量分数为3%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer，PBS）；洗涤缓冲液（PBS containing 0.05% Tween 20，PBST）：含0.05%吐温-20 的0.01 mol/L pH 7.4的PBS溶液；抗体稀释液：含质量分数为1%脱脂奶粉的PBS溶液；底物缓冲液（pH 5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液）：0.2 mol/L Na2HPO425.7 mL、0.1 mol/L柠檬酸24.3 mL、蒸馏水50 mL；底物缓冲液10 mL：10 mg TMB溶于5 mL无水乙醇；终止液（2 mol/L H2SO4）：10.9 mL 98%的浓硫酸加89.1 mL蒸馏水。
1.2仪器与设备
TU-1901紫外-可见分光光度仪 北京谱析通用仪器有限责任公司；RT-2100C型酶标仪 雷杜生命科学股份有限公司；AUY220电子天平 日本岛津公司；DF-101S型磁力加热搅拌器 江苏省金坛市正基仪器有限公司；DYY-6C电泳仪 北京六一仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 半抗原衍生物的合成
称取20 g（0.095 mol）4-硝基邻苯二甲酸，加入26 mL正丁醇，搅拌下加入3.3 mL浓H2SO4催化，120 ℃搅拌回流7 h后，蒸馏除去未反应的正丁醇和生成的水。趁热倒入冰水中，油状粗品用质量分数为10% Na2CO3洗涤至水层无色（pH值为7～8）后，分离出油状物，用无水乙醇溶解除去不溶物，加热后除去少量乙醇，趁热置冰箱中冷却，得到黄色油状液体。同理合成异丁酯和二环己酯时，只需将正丁醇用异丁醇和环己醇代替即可。
利用H2还原硝基，钯碳催化反应，得到产物4-氨基邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl 4-aminophthalate，DBAP）、4-氨基邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl 4-aminophthalate，DiBAP）和4-氨基邻苯二甲酸二环己酯（dicyclohexyl 4-aminophthalate，DCHAP）。再将部分DBAP与戊二酸酐反应，经分离提纯后得到黄色油状液体4-戊二单酰邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl 4-carboxylphthalte，DBCP）。4 种半抗原衍生物的结构式如图1所示。
图1 4 种半抗原衍生物结构式图
Fig.1 Structures of hapten derivatives
1.3.2 人工抗原的合成
参照参考文献[15]，将DBAP、DiBAP和DCHAP利用重氮化法分别与载体蛋白BSA偶联。参照参考文献[16]，将DBCP与BSA利用DCC法进行偶联。由此得到免疫原偶联物DBAP-BSA、DiBAP-BSA、DCHAP-BSA和DBCP-BSA。
包被抗原的制备步骤与上同，只是用OVA代替BSA作载体蛋白。
1.3.3 4 种分子与BSA偶联物的鉴定
1.3.3.1 紫外分光光度计法鉴定
利用PBS调零，分别将稀释到一定浓度的半抗原衍生物、BSA、OVA、4 种免疫原和4 种包被原在200～600 nm波长范围内进行紫外吸收光谱扫描。并以紫外分光光度法估算偶联物的结合比[17]。
1.3.3.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroporesis，SDS-PAGE）鉴定[18-19]
配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，取10 μL样品溶液与上样缓冲液的混合液上样。浓缩胶电压60 V，待指示剂移动到分离胶后，将电压升至120 V，待指示剂接近分离胶下端边缘后关闭电源。用考马斯亮蓝R-250染色20 min，用乙酸-甲醇水溶液脱色，直至背景脱净，期间换液数次。
1.3.4 动物免疫
以BSA偶联物作免疫原，用PBS（pH 7.4）溶液稀释至1 mg/mL，稀释液与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，对8 只成年健康雌性新西兰大白兔进行背部多点注射和肌肉注射。用DBAP-BSA免疫1号和2号兔子，DBCP-BSA免疫3号和4号兔子，DiBAP-BSA免疫5号和6号兔子，DCHAP-BSA免疫7号和8号兔子。3 周后再次免疫改用等量的弗氏不完全佐剂，以后每隔两周免疫一次，免疫后第7～10天耳缘静脉取血。
1.3.5 间接竞争酶联免疫吸附实验（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA）条件的优化
为建立高性能的icELISA分析法，本实验对免疫分析实验中部分重要反应条件进行了优化，主要有包被抗原、抗体、二抗的反应浓度，包被抗原的包被时间，抗原抗体反应时间，二抗反应时间，缓冲溶液的pH值以及离子强度等。
1.3.6 血清抗体的间接ELISA（indirect ELISA，iELISA）检测
采用i ELISA检测血清的效价，当阳性血清的OD450 nm值≥阴性对照孔的2.1 倍并且阳性血清的OD450 nm值大于0.1时，此时血清的稀释倍数即为血清的效价。采用条件优化后的icELISA[20]检测抗体灵敏度。以标准品质量浓度的自然对数为横坐标，B/B0为纵坐标，建立竞争抑制曲线。
1.3.7 交叉反应
与半抗原有着共同结构的其他物质也有可能与抗体反应结合，造成假阳性的现象，从而干扰实验结果。为解决这个问题，可以通过抗体与抗原类似物交叉反应的大小来表征该酶联免疫反应的特异性。采用icELISA法测定8 种塑化剂结构类似物IC50的浓度，计算各类似物与多克隆抗体的交叉反应率[21-22]。
2.1人工抗原的紫外光谱鉴定
经紫外-可见分光光度计扫描，得到半抗原衍生物、载体蛋白和人工抗原的紫外光谱图，结果见图2。偶联的每个人工抗原的特征吸收峰均有位移和峰增强的现象，与相应的半抗原衍生物和蛋白的特征吸收峰既有区别又有联系，由此可以说明人工抗原偶联成功。根据紫外分光光度法估算人工抗原的偶联比分别为DBAPBSA（15∶1）、DBAP-OVA（19∶1）、DBCP-BSA （14∶1）、DBCP-OVA（19∶1）、DiBAP-BSA （16∶1）、DiBAP-OVA（21∶1）、DCHAP-BSA （16∶1）、DCHAP-OVA（19∶1）。
图2 人工抗原紫外光谱分析鉴定
Fig.2 Ultraviolet scanning of artificial antigens
2.2SDS-PAGE分析鉴定
人工抗原及蛋白的SDS-PAGE结果如图3所示，人工抗原的条带均与载体蛋白的不同，相比于载体蛋白的条带发生滞后的现象，这说明人工抗原的分子质量均比载体蛋白的分子质量大。由此可推断，半抗原衍生物与载体蛋白偶联成功。
图3 人工抗原的SDS-PAGEE结果
Fig.3 SDS-PAGE patterns of artificial antigens
2.3icELISA实验条件优化结果分析
4 种包被抗原经方阵滴定法确定最佳包被质量浓度除DCHAP-OVA为1 μg/mL外，其他均为2 μg/mL，DBAP-BSA、DBCP-BSA、DiBAP-BSA、DCHAP-BSA血清稀释度分别为1∶4 000、1∶32 000、1∶8 000、1∶6 000。二抗加入量的优化如图4所示，二抗的稀释度除DBAP-BSA （1∶3 000）外，其他均为1∶4 000时最佳。包被抗原包被时间经优化后均为37 ℃反应1 h较好。抗原抗体反应时间的优化结果见图4，DBAP-BSA为3 h，DiBAP-BSA为2.5 h，DBCP-BSA和DCHAP-BSA均为2 h。由二抗反应时间的优化结果得知均为3 h最佳。缓冲溶液的pH值均为7.5，即反应在中性条件下进行较好，如图4所示。PBS缓冲溶液的浓度均为0.01 mol/L较好。
图4 icELISA中重要反应条件的优化
Fig.4 Optimization of important icELISA conditions
2.4血清效价检测
对每只兔子进行5 次免疫后耳缘静脉取血，经过离心得到抗血清，采用间接ELISA法检测抗体效价，结果见表1。注射DBAP-BSA抗原的两只兔子血清效价均达到1∶64 000，而注射DBCP-BSA、DiBAP-BSA和DCHAP-BSA抗原的6 只兔子的血清效价均达到1∶128 000。
表1 血清效价测定结果（n=3）
Table 1 Detection results of serum titers(n = 3)
2.5抑制曲线的绘制
根据上述优化的实验条件，利用icELISA法测定加入一系列不同质量浓度的标准品溶液后的OD450 nm值，标准品分别为DBP、DBP、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate，DiBP）和邻苯二甲酸二环己酯（dicyclohexyl phthalate，DCHP），测定半抑制浓度（IC50），绘制线性工作曲线，结果如图5所示，4 种抗体的IC50值分别为：DBAP-BSA（0.305 μg/mL）、D B C P - B S A（0 .2 6 8 μ g/m L）、D i BA P - B S A （0.104 μg/mL）、DCHAP-BSA（0.247 μg/mL）。最低检测限分别为：DBAP-BSA（52.9 ng/mL）、DBCP-BSA （35.5 ng/mL）、DiBAP-BSA（8.7 ng/mL）、DCHAP-BSA（11.9 ng/mL）。最佳工作范围分别为：DBAP-BSA（81.960～1 138.037 ng/mL）、DBCPBSA（55.720～832.945 ng/mL）、DiBAP-BSA （16.753～857.328 ng/m L）、DCHAP-BSA （63.997～1 222.221 ng/mL）。
图5 4 种抗体的线性工作曲线
Fig.5 Linear working curves
2.6交叉反应结果
通过交叉反应检测抗体特异性，其交叉反应率见表2。4 种抗体除与相应的标准品反应外，其他的塑化剂结构类似物与对应抗体的交叉反应率均小于5%。可能是由于DBP和DBAP有着共同的结构，即苯环均连接了两个丁酯，这个结构起着抗原决定簇的功能，所以两者均容易被抗体DBAP-BSA和DBCP-BSA识别，以至于DBP与抗体DBAP-BSA的交叉反应率为90.5%，DBAP与抗体DBCP-BSA的交叉反应率为82.6%，两者与其他结构类似物的交叉反应率均小于5%。由此说明得到的4 种抗体的特异性较好。
表2 塑化剂抗体与相关化合物的交叉反应率
Table 2 Cross-reactivity of the antibodies against related compounds %
注：DMP.邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate）；DEP.邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate）；BBP.邻苯二甲酸丁苄酯（butyl benzyl phthalate）；DNOP.邻苯二甲酸二正辛酯（di-n-octylo-phthalate）。
邻苯二甲酸酯类塑化剂是重要的化工原料，广泛应用于生活中。因其具有生殖毒性和遗传毒性，对人类健康造成严重危害。尤其在“台湾塑化剂事件”[23]和“白酒塑化剂食品安全风波”[24]后，我国对塑化剂指标也进行了严格监管。目前，酶联免疫分析方法已被广泛应用于PAEs的快速检测，而要建立高灵敏的ELISA法关键在于制备特异性强的抗体。归根结底，即使用的人工抗原应充分暴露出半抗原的表征结构[25-27]。
本实验分别合成了DBAP、DBCP、DiBAP和DCHAP 这4 种半抗原衍生物结构类似物，利用偶联制得相应的人工抗原对新西兰大白兔进行免疫，得到4 种抗体，并对ELISA实验条件进行反应优化，可知：1）DBAP-BSA抗体的最低检测限（52.9 ng/mL）最大，但与Xu Fei等[28]的研究结果64.5 ng/mL比较相近。由此说明实验所获得的4 种抗体具有可行性。2）DBAP-BSA抗体效价低于其他3 种抗体，其血清稀释度最小，二抗使用量略高，抗原抗体反应时间最长，最后得到的IC50值最大，其次是DBCP-BSA和DCHAP-BSA抗体，DiBAP-BSA抗体IC50最小。从结构上分析可能原因：具有支链结构的抗原更容易得到特异性强的抗体；DBCP特征结构的空间位阻大，所以DCHAP-BSA抗体的IC50值比DiBAP-BSA抗体大；DBCP具有5 个碳的伸长臂，比DBAP更好地将特征结构暴露，所以DBCP-BSA抗体的特异性比DBAP-BSA抗体强。本研究合成的4 种塑化剂结构类似物，对下一步抗体的制备及免疫分析检测提供了可靠的免疫原。
参考文献：
[1]万文博,李劭彤,李巧玲.高效液相色谱法测定食用油中塑化剂的含量[J].中国食品添加剂,2014(2):220-224.DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2014.02.033.
[2]巩玉红.邻苯二甲酸酯类增塑剂的应用及危害[J].山东化工,2011,40(5):93-95.DOI:10.3969/j.issn.1008-021X.2011.05.034.
[3]郭永梅.邻苯二甲酸酯的毒性及相关限制法规[J].广州化学,2012,37(2):75-79.DOI:10.3969/j.issn.1009-220X.2012.02.013.
[4]WITTASSEK M,ANGERER J,KOLOSSA-GEHRING M,et al.Fetal exposure to phthalates:a pilot study[J].International Journal of Hygiene and Environmental Health,2009,212(5):492-498.DOI:10.1016/j.ijheh.2009.04.001.
[5]POGRIBNY I P,TRYN DYAK V P,BOUREIKO A,et al.Mechanisms of peroxisome proliferator-induced DNA hypomethylation in rat liver[J].Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis,2008,644(1/2):17-23.DOI:10.1016/j.mrfmmm.2008.06.009.
[6]O’BRIEN A,GOODSON A,COOPER I.Polymer additive migration to foods:a direct comparison of experimental data and values calculated from migration models for high density polyethylene(HDPE)[J].Food Additives and Contaminants,1999,16(9):367-380.DOI:10.1080/026520399283858.
[7]庞世敏,袁敏,赵桂兰,等.气相色谱法测定邻苯二甲酸酯类增塑剂的研究[J].华南师范大学学报(自然科学版),2010,11(4):70-74.DOI:10.6054/j.jscnun.2010.11.013.
[8]WANG Ling,JIANG Guibin,CAI Yaqi,et al.Cloud point extraction coupled with HPLC-UV for the determination of phthalate esters in environmental water samples[J].Journal of Environmental Sciences,2007,19(7):874-878.DOI:10.1016/s1001-0742(07)60145-4.
[9]方丽,林泽鹏,林晨,等.气质联用法测定食品包装材料中22种邻苯二甲酸酯残留方法的探讨[J].食品工业,2015,36(1):291-296.
[10]卓黎阳.超高效液相色谱-串联四极杆质谱测定酒中15种邻苯二甲酸酯[J].分析试验室,2013,32(9):68-73.DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2013.0242.
[11]许龙,章英,朱立鑫,等.双酚A单克隆抗体的制备及酶联免疫分析方法的建立[J].食品科学,2015,36(20):202-206.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201520039.
[12]赵伟,魏晨曦,夏莹,等.苯甲酸人工抗原的合成与免疫效价的测定[J].食品科学,2009,30(3):163-166.DOI:10.3321/j.issn:1002-663 0.2009.03.036.
[13]SHEA K M.Pediatric exposure and potential toxicity of phthalate plasticizers[J].Pediatrics,2003,111(6):1467-1474.DOI:10.1542/PEDS.111.6.1467.
[14]WEI Chenxi,DING Shumao,YOU Huihui,et al.An immunoassay for dibutyl phthalate based on direct hapten linkage to the polystyrene surface of microtiter plates[J].PLoS ONE,2011,6(12):e29196.DOI:10.1371/jour nal.pone.0029196.
[15]ZHANG Mingcui,WANG Qionge,ZHUANG Huisheng.A novel competitive fluorescence immunoassay for the determination of dibutyl phth alate[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2006,386(5):1401-1406.DOI:10.1007/s00216-006-0703-z.
[16]LEI Hongtao,SHEN Yudong,SONG Liju n,et al.Hapten synthesis and antibody production for the development of a melamine immunoassay[J].Analytica Chimica Acta,2010,665(1):84-90.DOI:10.1016/j.aca.2010.03.007.
[17]庄惠生,李玉科,张明翠.环境荷尔蒙邻苯二甲酸二甲酯的人工全抗原合成与表征[J].化学试剂,2005,27(9):559-560.DOI:10.3969/j.issn.0258-3283.2005.09.014.
[18]KAMPS-HOLTAZPPLE C,CARLIN R J,SHEFFIELD C,et al.Analysis of hapten-carrier protein conjugates by nondenaturing gel electrophoresis[J].Journal of Immunological Methods,1993,164(2):245-253.DOI:10.1016/0022-1759(93)90317-Z.
[19]高艳利,杨思文,樊凯奇,等.SDS-PAGE电泳技术分析蛋白质的研究[J].辽宁化工,2007,36(7):460-463.DOI:10.3969/j.issn.1004-0935.2007.07.010.
[20]ZHOU Jianqing,ZHAO Suqing,ZHANG Jun,et al.An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for bisphenol-A based on the synthesis of a poly-L-lysine-hapten conjugate as a coating antigen[J].Analytical Methods,2013,5(6):1-8.DOI:10.1039/c3ay26220k.
[21]AHN K C,WATANABE T,GEE S J,et al.Hapten and antibody pro duction for a sensitive immunoassay determining a human urinary metabolite of the pyrethroid insecticide permethrin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(15):4583-4594.DOI:10.1021/jf049646r.
[22]ZHUANG Zhenhong,QUE Shanjin,GAO Yueming,et al.Artificial antigen synthesis and the development of polyclonal antibody-based immunoassay for citreoviridin determination[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2014,30(1):343-349.DOI:10.1007/s11274-013-1431-0.
[23]杨涛.台湾塑化剂风暴对饮料及饮料包装行业的影响[J].塑料包装,2011,21(4):35-39.DOI:10.3969/j.issn.1006-9828.2011.04.009.
[24]郑校先,俞剑燊,冉宇舟,等.白酒“塑化剂”食品安全风波分析及白酒包装材料问题[J].酿酒科技,2013(10):62-64.DOI:10.13746/j.njkj.2013.10.047.
[25]宋娟,王榕妹,王悦秋,等.半抗原的设计、修饰及人工抗原的制备[J].分析化学,2010,38(8):1211-121.DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.01211.
[26]王建华,张冲.小分子抗原人工合成进展[J].应用化学,2011,28(4):367-375.DOI:10.3724/SP.J.1095.2011.00364.
[27]徐加发,成义祥,沈萍萍.半抗原设计合成研究进展[J].江苏农业学报,2009,25(5):1178-1182.DOI:10.3969/j.issn.1000-4440.2009.05.045.
[28]XU Fei,WANG Wenjun,JIANG Haiyang,et al.Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of dibutyl phthalate in white wine,compared with GC-MS[J].Food Analytical Methods,2014,7(8):1619-1626.DOI:10.1007/s12161-014-9797-7.
LAI Dan,ZHENG Shengwu,ZHAO Suqing*
(School of Chemical Engineering and Light Industry,Guangdong University of Technology,Guangzhou 510006,China)
Abstract:Four hapten derivatives were obtained from 4-nitrophthalic acid through esterification and reduction.In order to prepare artificial antigens,the hapten derivatives were coupled with the carrier proteins bovine serum albumin(bovine serum albumin,BSA)and ovalbumin(OVA)by diazotization method and activated ester method respectively.The successful synthesis of artificial antigens was identified by ultraviolet spectroscopy(UV)and sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electroporesis(SDS-PAGE).New Zealand white rabbits were injected with each of the four artificial antigens coupled with BSA.The sensitivity and specificity of antibodies were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The results showed that the titer of DBAP-BSA(dibutyl 4-aminophthalate-BSA)antibody was 1:64 000 and the titers of all three other antibodies were 1:128 000.The IC50values of DBAP-BSA,DBCP-BSA(dibutyl 4-carboxylphthalte-BSA),DiBAP-BSA(diisobutyl 4-aminophthalate-BSA)and DCHAP-BSA(dicyclohexyl 4-aminophthalate-BSA)against DBP(dibutyl phthalate),DBP,DiBP and DCHP were 0.305,0.268,0.104 and 0.247 mg/mL,respectively.The cross-reactivity with each other was small.Therefore,the antibodies had high sensitivity and specificity.The successful synthesis of four hapten derivatives made it possible to prepare po lyclonal antibodies and establish immunoassay.
Key words:phthalic acid ester; artificial antigen; antibody
中图分类号：TQ32
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）05-0114-07
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605021 10.7506/spkx1002-6630-201605021.http://www.spkx.net.cn
*通信作者：赵肃清（1969—），男，教授，博士，研究方向为抗体制备及免疫分析。E-mail：sqzhao@gdut.edu.cn
作者简介：赖丹（1988—），女，硕士研究生，研究方向为生物化学。E-mail：laidan820@163.com
基金项目：国家自然科学基金面上项目（41271340）；广东省自然科学基金项目（2013040013021；S2013030013338）
收稿日期：2015-04-01