图1 醋酸杆菌和葡糖醋杆菌耐醋酸的分子机制示意图[[3333]]
Fig.1 Schematic representation of molecular mechanisms for acetic acid resistance of Acetobacter and Gluconacetobacter[33]
张志燕1,2，马海乐1,*，杨艳华2
（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江苏大学生命科学研究院，江苏 镇江 212013）
摘 要：蛋白质组学技术是后基因组学时代的重要研究手段。近年来，在食品工业微生物领域，其中在对食醋生产中起主要作用的醋酸菌研究中，蛋白质组学技术已得到了广泛应用。本文简述了蛋白质组学的概念及研究的主要技术，同时综述了蛋白质组学在醋酸菌研究中的应用，展望了醋酸菌蛋白质组学在食醋工业中的应用发展前景。
关键词：蛋白质组；醋酸菌；二维凝胶电泳；质谱技术
引文格式：
张志燕,马海乐,杨艳华.蛋白质组学及其在醋酸菌研究中的应用[J].食品科学,2016,37(5):259-264.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605045.http://www.spkx.net.cn
ZHANG Zhiyan,MA Haile,YANG Yanhua.Advances in proteomics and its application in acetic acid bacteria research[J].Food Science,2016,37(5):259-264.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605045.http://www.spkx.net.cn
随着人类基因组测序工作的完成，生命科学研究已进入后基因组学时代，蛋白质组学（proteomics）作为后基因组时代研究的主要内容，已经成为国际上研究的前沿和热点。在蛋白质组学研究中，借助二维电泳等技术和生物信息学工具，能够鉴定大量功能蛋白，并挖掘新的功能未知蛋白，这对了解蛋白质及蛋白质互作机制、开发具有应用潜力的新菌种等具有极其重要的意义。由于二维电泳技术的日趋完善及生物信息学的快速发展，蛋白质组学迅猛发展，并被越来越多地应用于包括食品微生物在内的工业微生物研究领域中，如乳酸菌、芽孢杆菌、酿酒酵母等微生物的蛋白质组研究均取得了较大进展[1-3]。醋酸菌是严格好氧的革兰氏阴性菌，具有氧化酒精为醋酸的能力，广泛应用于食品、饮料等工业上，在食醋工业生产上尤为重要，是醋酸发酵过程中的关键菌株。
“蛋白质组（proteome）”一词最早由Marc Wilkins 于1994年在意大利锡耶纳（Siena）举办的一次双向电泳（two dimensional electrophoresis，2-DE）会议上提出，1995年首次在文献中公开使用“proteome”一词，它是指一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全部蛋白质[4]。蛋白质组学是以蛋白质组作为研究对象，大规模、系统地对蛋白质的特性、结构和功能进行研究，具体包括蛋白质的主要结构（成熟、翻译后修饰等）、拓扑结构、互作网络（蛋白质之间的相互作用）、功能、调控和转运等，进而对其组成以及调控的生命规律进行整体水平上的研究，对生物体生命活动的本质进行全面地揭示[5]。
蛋白质组学研究的内容主要有两个方面，即表达蛋白质组学和功能蛋白质组学。表达蛋白质组学（expression proteomics）又称组成蛋白质组学（constitution proteomics），主要对蛋白质组表达模式进行研究。蛋白质组学的本质就是大规模的、系统性的研究蛋白质组，即采用高通量的蛋白质分离、鉴定技术以检测特定条件下某一细胞或组织中的所有蛋白质，并构建蛋白质组数据库。功能蛋白质组学（functional proteomics）又称比较蛋白质组学（comparative proteomics），是对蛋白质组功能模式的研究，着重于通过比较2个或多个样本之间的差异蛋白质谱，来寻找、筛选导致差异蛋白质谱产生的因素，即研究不同时期、不同环境下蛋白质组成的变化。通过差异蛋白质组学研究，可挖掘蛋白质间相互作用与协调关系，并可进一步鉴定蛋白质结构与功能的相关性，以及基因结构与蛋白质结构和功能的相关性。在建立蛋白质相互作用图谱的基础上，人们可进一步通过阻断蛋白质相互作用研究细胞的功能[6]。功能蛋白质组学研究更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。
2.1蛋白质样品的制备
蛋白质组研究的第一步是制备蛋白质样品，这也是最关键的步骤之一。样品制备的好坏直接决定能否成功获得清晰的二维凝胶电泳图谱。制备样品时需遵循以下原则：制备方法简单，具有可重复性；裂解细胞或组织的方法应减少蛋白质降解与修饰；避免反复冻融样品；尽量去除样品中非蛋白杂质和干扰蛋白；在样品溶液中加入尿素后，加热温度不超过37 ℃，防止蛋白质氨甲酰化修饰而引起蛋白质pI值的偏移；提高样品的溶解度[7]。尿素和硫脲是常用的变性剂，通过破坏氢键使蛋白质更加伸展，完全暴露蛋白疏水中心，使样品蛋白质易于溶解。表面活性剂如去污剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Triton X-100和NP-40、3-（3-（胆酰胺丙级）二甲氨基）丙磺酸内盐（3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonio)propanesulfonate，CHAPS）等，用来保证蛋白质完全溶解，防止经变性剂处理而暴露的蛋白质疏水基团间相互作用而聚集。还原剂如二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT），有抗氧化作用，使蛋白质分子间和分子内的二硫键解离，使蛋白质完全处于还原状态。
2.2蛋白质样品的分离
从蛋白质组学研究的技术来看，当前蛋白质样品的分离方法主要有两大类：一类是基于传统的二维凝胶电泳分离技术；另一类是将混 合蛋白样品酶解，经过合适的色谱分离技术进行分离。
2.2.1 二维凝胶电泳
2-DE技术是蛋白质组学研究中应用最广泛的分离技术，尤其是在比较蛋白质组学中。2-DE是指蛋白质样品经等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（poly-acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）进行二次分离，其原理是根据等电点和分子质量的不同对蛋白质进行分离。2-DE技术通量高，可同时分离检测3 000～5 000 个蛋白质（甚至10 000 个）；此外，该技术分辨率也较高，固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）胶条能够分辨等电点相差为0.01的不同蛋白。随着技术的改进和生物质谱技术灵敏度的提高，2-DE技术的应用更为广泛。然而，2-DE仍面临许多技术瓶颈，该技术对疏水性、极酸或极碱性、极高或极低分子质量以及低丰度蛋白质的分离较为困难；小规模和自动化程度低的蛋白质分离，也使得利用2-DE难以获得高分辨率、高重复性的二维图谱；此外，2-DE操作相对费时、费力[8]。
2.2.2 二维荧光差异凝胶电泳
为了解决2-DE存在的缺陷，1997年Unlu等[9]首次提出了二维荧光差异凝胶电泳（two dimension fluorescence difference gel eleltrophoresis，2D-DIGE）。随后，Amersham公司把DIGE技术作为公司的核心蛋白质组技术，不断地探索开发，使DIGE成为更加优化的技术并将其市场化[10]。2D-DIGE是一种基于荧光标记的定量蛋白质组学技术，利用多重荧光分析，同时在一块凝胶上进行电泳，实现2 种以上样品的分离和比较分析，目前主要用于比较蛋白质组的研究[11]。2D-DIGE技术比传统的2-DE技术具有更高的灵敏性和动力学范围，且不需要在电泳后进行固定或脱色过程，从而减少了蛋白质特别是低丰度蛋白质的损失[12]。虽然2D-DIGE技术发展积累的时间不长，但2D-DIGE技术具有快速、精确、可重复、实验误差小等特点，因此近几年在生物学各个领域（微生物、植物、动物等）得到了广泛的应用[13-15]。然而较难分离检测极端分子质量的蛋白质，等电点极酸或极碱性的蛋白质，特别是昂贵的价格，是2D-DIGE技术仍将面临的挑战。
2.2.3 多维色谱技术
对于复杂的蛋白质组样品而言，特别是具有极端分子质量或pH值、具有磷酸化蛋白或糖蛋白的蛋白样品，2-DE不能满足分离要求，多维色谱分离系统则在技术上弥补了二维的不足。多维色谱技术（multidimensionalchromatography，MDC）是2 种或2 种以上具有不同分离原理特性的液相分离方法的优化和组合，根据Giddings[16]的理论，该技术通过减少峰重叠，有效提高了系统对样本的分辨率和峰容量，为样品提供更多的数据信息。MDC的基本原理是按照样品中各个组分性质（分子质量、分子大小、疏水性、等电点等）的差异进行组合分离。多维色谱的组合必须满足两个条件：1）各维色谱的分离机制应完全不同；2）高维分离速率大于低维[17]。由于多维色谱分离速度快、重现性好、自动化程度高，是当前蛋白质组学研究中主要应用的色谱分离方法[18-20]。目前常用的MDC系统有二维离子交换-反相分离系统（two-dimensional cation exchange and reverse-phase liquid chromatography，2D-SCX-RPLC）、二维亲水作用-反相分离系统（two-dimensional hydrophilic interaction liquid chromatography and reverse-phase liquid chromatography system，2D-HILIC-RPLC）、二维反向-反向分离系统（two-dimensional reverse-phase liquid chromatography，2D-RPLC-RPLC）、多维体积排阻-反相分离系统（multidimensional size exclusion chromatography and reversephase liquid chromatography，多维SEC-RPLC）等。
2.3蛋白质样品的质谱鉴定
蛋白质样品的鉴定是蛋白质组学研究的核心任务。鉴定蛋白质的方法很多，其中质谱技术（mass spectrometry，MS）因其高通量、高灵敏度、精确性强等特点，已经逐步取代了传统的蛋白质鉴定方法，如Edman降解法、氨基酸分析法等[21]。MS的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间的质荷比（m/z）的差异来分离并确定分子质量。MS鉴定主要有两种方法：一种是基于肽质量指纹图谱（peptide mass fi nger printing，PMF）鉴定蛋白质，该技术适用于已知全基因组序列的物种；另一种是基于多级质谱的蛋白质鉴定。
2.3.1 基于肽质量指纹图谱
PMF是指蛋白质被特异性酶解后产生特定的肽段序列，通过质谱对肽段混合物进行质量分析，再结合数据库检索对蛋白质进行鉴定：如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）或电喷雾电离质谱（electro spray ionization-mass spectroscopy，ESI-MS）。MALDI和ESI是在蛋白质组学中使用最广泛的电离方法[22]。由于每个蛋白质具有不同的氨基酸序列，因此不同的蛋白质所得肽段序列具有指纹特征。将实验获得的PMF与蛋白质数据库中理论的PMF比较，即可鉴定出蛋白质。
PMF技术是一种高效快速的鉴定蛋白质的方法，特别是应用于自动化的MALDI-TOF/MS中，但是它也存在一些不足。PMF技术受样品的总量、纯度、蛋白修饰方式以及数据库完善程度等方面限制，所以一般需要与其他方法结合使用才能达到分析目的。
2.3.2 基于多级质谱
多级质谱（MS/MS）是一种被广泛使用可代替PMF的方法。由MS/MS产生的来自于肽段序列中连续氨基酸的一系列碎片离子，可以作为一个肽段的指纹印迹，用这个方法不需要检测出蛋白质中的每一段多肽序列，只需要鉴定蛋白质2 个或2 个以上的肽段就足以鉴定该种蛋白质。这种方法使得搜索鉴定未完成基因组测序的蛋白质成为可能，也可以分析来自更复杂混合物的蛋白质[23]。MS/MS鉴定已经成为一种功能强大且稳定的蛋白质组分析技术，为蛋白质组学的研究提供了必要的技术手段[24-26]。多级质谱的代表方法有高效液相色谱/电喷雾电离质谱联用（liquid chromatography-electrospray ionisationtandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）、二维高效液相色谱/串联质谱连用（two-dimensional-liquid chromatographytandem mass spectrometry，2D-LC-MS/MS）。
肽段碎片指纹图谱（peptide fragment fi ngerprinting，PFF）是用特异性的酶酶解蛋白质，经分离得到的肽段在质谱中被选择及破碎后得到的MS/MS谱图，与来自于蛋白质理论酶解产物的MS/MS谱图相关联，得出与理论谱图匹配最好的肽段序列，作为待分析的肽段进行鉴定。PFF技术精度高、分析时间短、可同时处理多个样品。不足之处是肽段中氨基酸残基单元的质谱学特性目前仍不清楚。
2.4蛋白质样品的生物信息学分析
生物信息学（bioinformatics）是伴随着生命科学的研究，以计算机为工具对生物信息进行收集、整理、储存、检索和分析的一门新兴交叉学科[6]。生物信息学由三部分组成，分别是计算机网络、数据库和应用软件[27]。应用生物信息学可以发现一些蛋白质相关的功能信息，包括预测蛋白质的结 构和功能、基因及其同源体的识别、蛋白质在某一特定通路中的定位及其功能。蛋白质组信息学研究内容主要有以下几个方面：蛋白质序列比较分析；蛋白质结构与功能的预测；蛋白质-蛋白质相互作用及作用途径的研究。目前常用的蛋白质组数据库有：1）蛋白质序列数据库，如SwissPort、NCBInr、PIR、EMBL等；2）蛋白结构数据库，如PDB、SCOP、CATH等；3）蛋白质功能数据库，如GO、GOG、KEGG等。
2.5蛋白质组学存在的问题
尽管蛋白质组学方法发展迅速并逐渐成熟，但是仍存在一些问题需要解决：1）不能分离和检测到蛋白质组中所有的蛋白质，尤其是低丰度蛋白质、翻译后修饰蛋白、疏水性蛋白和高分子质量蛋白的分离分析尤其困难；2）在蛋白质组分离方法学上，2-DE仍是目前最流行和较可靠的技术，然而重复性有待提高；3）当前的蛋白质组学是相对定量，而非绝对定量，与相对定量相比，绝对定量更有意义，绝对定量分析可以比较不同的实验结果，甚至有可能比较不同实验室的实验结果；4）对于没有完成基因组测序的生物体，研究者无法鉴定出其感兴趣的蛋白；5）不能实时监测蛋白质组发生的变化；6）数据的解释，即从蛋白质组分析实验产生的大量数据中提取有用的信息，仍然是一个主要问题，有许多质谱图不能用于鉴定，可能的原因有很多，如谱图质量不高，搜索参数设置不正确，肽段带有修饰或突变，或者质谱图质量很好，但是数据库中没有可以匹配的肽段，或数据库中的序列有误；7）从蛋白质鉴定来说，数据库依赖性强，价格昂贵，存在一定的假阳性结果。这些存在的问题，都需要进一步的改进和完善。
微生物基因组相对较小，这使其成为蛋白质组学研究的首选模式生物；高通量的蛋白质组学方法也为微生物学家提供了新的选择。利用蛋白质组学的研究方法，人们解决了蛋白质结构和功能、蛋白质的相互作用、细胞代谢机制、胁迫应答机制等诸多问题。近些年，蛋白质组学研究在食品工业微生物中被广泛应用，如芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、链霉菌等[28-31]。作为食醋生产中起主要作用的醋酸菌，近些年也有研究。
醋酸菌是严格好氧的革兰氏阴性菌，具有特有的乙醇和乙酸耐受特性。醋酸菌包括13 个属，其中醋酸杆菌属（Acetobacter）和葡糖杆菌属（Gluconacetobacter）能够通过乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）将乙醇转化为醋酸[32]。近年来，科学家们利用蛋白质组学方法研究了醋酸菌高耐酸性的分子机制，以及醋酸菌蛋白质组成与调控的活动规律，尝试全面揭示醋酸菌生命活动的本质[33-35]。1997年，Lasko等[36]首次利用2-DE技术，比较了醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）和氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）在有无乙酸条件下生长的蛋白质表达差异，发现有8 个与醋酸应激相关的蛋白质在乙酸胁迫下过量表达，其中3 个蛋白质在2 种菌中都存在。随后，利用差异蛋白质组学技术，Steiner等[37]研究了在批次培养或连续培养中A.aceti对高浓度醋酸适应的分子机制，发现至少有50 个蛋白质可被乙酸进行特异性诱导；这些蛋白质主要是醋酸适应蛋白（acetete adaptation proteins，Aaps）、醋酸诱导蛋白和一般的应激蛋白。在此基础上，对被诱导蛋白质的N端氨基酸残基进行序列分析，结果表明质膜相关的过程对醋酸适应很重要。这些研究表明，基于2-DE的蛋白质组策略可有效阐明醋酸菌的耐酸分子机制，然而上述研究并未对差异蛋白进行质谱鉴定。Nakano等[38-39]分别于2004年和2006年鉴定了A.aceti菌株中对醋酸最敏感的蛋白质—顺乌头酸酶和假定ABC转运蛋白，从而证明它们与醋酸抗性有关。2008年，Lery等[40]对固氮醋杆菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）的蛋白表达谱进行研究，鉴定了583 个蛋白，进而利用蛋白功能分类和京都基因及基因组全库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）途径对这些蛋白进行分析，从而揭示了醋酸菌的代谢基础和代谢调控机制。同年，Lery等[41]对不同生长时期和不同培养条件下（无机氮化合物水平）G.diazotrophicus的差异蛋白质组进行研究，发现传感器蛋白KdpD（sensor protein KdpD）和ATP合成酶δ链（ATP synthase delta chain，AtpD）在G.diazotrophicus细胞指数生长期的高酸性条件下，参与维持细胞内pH值动态平衡，表明G.diazotrophicus细胞在指数生长期的高耐酸性，是由一组特殊的蛋白质介导；另外在生长平台期，即低氮、低碳、高酸性环境下，G.diazotrophicus细胞主要是通过激活一些转运蛋白和转移酶来维持细胞的正常生理活性，进一步阐明了醋酸菌耐酸性相关的分子机制。
2010年对G.diazotrophicus的研究结果表明，36 个差异蛋白与碳水化合物和能量代谢、折叠、分类和降解过程、以及转录和翻译过程相关[42]。最近，Andrés-Barrao 等[34]对Acetobacter pasteuianus在醋酸发酵过程中蛋白质组进行研究，鉴定了53个蛋白质，比较发现这些蛋白质与蛋白质的折叠、压力反应、氧化还原过程、代谢过程、蛋白质生物合成和翻译，以及膜修饰蛋白相关。施结燕[43]通过对醋酸菌耐高酸性的差异蛋白质组学的研究，鉴定了26 个与醋酸菌耐高醋酸有关的蛋白，进一步阐明醋酸菌的耐酸性分子机制。本实验室应用蛋白质组学方法完成了从镇江香醋醋醅中分离的A.pasteuianus HSZ3-21的蛋白表达谱，并且鉴定出258 个蛋白质[35]。通过基因聚类（gene ontology，GO）分析和蛋白相邻类的聚簇（clusters of orthologous groups of proteins，GOG）蛋白功能分类等生物信息学分析发现，258 个蛋白可以分为四大组19 类蛋白质，其中大部分蛋白质与代谢过程、细胞过程和信号转导相关；一些蛋白质与A.pasteuianus的耐酸性、耐热性以及应激反应相关。这项研究不仅解释了A.pasteuianus蛋白质的组成和功能，且发现了一些可能参与某些调控机制的蛋白质，为进一步提高镇江香醋品质提供了参考。
在食醋工业方面，通过对醋酸菌以往的研究以及结合近十几年对醋酸菌的蛋白质组学分析，揭示了醋酸菌耐酸性相关的几种分子机制。醋酸在细胞内部的循环可能是：1）通过三羧酸循环（tricarboxylic acid，TCA）循环代谢；2）由假定的ABC转运蛋白进行转运；3）由质子动力依赖外排泵泵出胞外；从而降低细胞内的醋酸浓度。其中，ADH和ALDH像TCA循环中的酶一样，会产生能量来维持假定ABC转运蛋白的功能；具有耐低pH值的细胞内胞浆酶可以通过应激蛋白如GroES和GroEL防止其变性，而磷脂酰胆碱可能也参与了耐醋酸性质的形成过程（图1）[33]。
图1 醋酸杆菌和葡糖醋杆菌耐醋酸的分子机制示意图[[3333]]
Fig.1 Schematic representation of molecular mechanisms for acetic acid resistance of Acetobacter and Gluconacetobacter[33]
乙醇氧化反应机制，包括膜结合的ADH和ALDH；醋酸同化相关机制，包括基因aarA、aarC和乌头酸酶基因；一个假定的ABC转运蛋白，可能作为乙酸的输出者。这些发现为食醋发酵培育高耐酸性的菌株提供了线索。
通过对醋酸菌耐酸的分子机制、蛋白质组成及调控机制的更深入的了解，蛋白质组学将对醋酸菌的代谢机制及醋酸菌的开发和应用起到积极的促进作用，为进一步提高醋酸菌的耐高酸性提供理论基础，从而为选育和改造优良菌种提供了理论依据，并为发酵食醋产业中高浓度醋酸的生产奠定了基础。
近年来，蛋白质组学技术已经被广泛应用到生命科学的各个领域，包括微生物、动物和植物等，涉及了生物体蛋白的各种研究，如蛋白质结构和功能，相互作用，代谢机制等，这些研究为生物应用研究的快速发展提供了理论基础。以目前技术突破的速度，在接下来的10 a中，微生物蛋白质组学研究将使人们更全面了解微生物随着细胞增长和环境变化的分子和动力学机制[44-46]。
建立醋酸菌蛋白质组数据库对研究菌株生长发育机理，耐酸、耐高温等代谢及调控机制以及菌种的改良有着重要意义。通过对醋酸菌蛋白质组的分析，有利于发现和醋酸菌耐酸、耐热等特性相关的基因，从而加快醋酸菌种的改良，进一步改善食醋工业的醋酸产量。因此蛋白质组的研究，将为醋酸菌在食醋工业上提供更广阔的应用前景。
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ZHANG Zhiyan1,2,MA Haile1,*,YANG Yanhua2
(1.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China; 2.Institute of Life Sciences,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)
Abstract:Proteomic techniques,the most important research tools in the post-genomic era,have been widely applied to research useful microbes such as acetic acid bacteria(AAB)for the food industry.The present paper outlines the concept of proteomics and reviews proteomic techniques and their application in AAB research.Moreover,future applications of AAB proteomics in the vinegar industry are prospected as well.
Key words:proteomics; acetic acid bacteria; two dimensional electrophoresis(2-DE); mass spectrometry(MS)
中图分类号：TS201.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）05-0259-06
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605045
*通信作者：马海乐（1963—），男，教授，博士，研究方向为功能食品。E-mail：mhl@ujs.edu.cn
作者简介：张志燕（1977—），女，助理研究员，博士研究生，研究方向为微生物发酵和食品生物技术。E-mail：zyz@ujs.edu.cn
基金项目：江苏大学高级人才科研启动基金项目（05JDG030）
收稿日期：2015-04-15