稠李花色苷酶法制备及对H2O2诱导大鼠胰岛素瘤细胞损伤的保护作用

刘 晓,曹向宇,李其久,孙宇航,杨思敏,于 慧,王纬宇,刘剑利*
(辽宁大学生命科学院,辽宁 沈阳 110036)

摘 要:目的:探究纤维素酶酶法制备稠李花色苷的最佳条件,并研究制备的稠李花色苷对H2O2诱导的大鼠胰岛素瘤(Ins-1)细胞损伤的保护作用。方法:通过单因素试验和正交试验,优化得到酶法制备稠李花色苷的最佳条件;稠李花色苷处理大鼠Ins-1细胞,进行形态学观察、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]细胞活力实验、2’,7’-二氢二氯荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichloro dihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)荧光探针法检测细胞内活性氧实验研究稠李花色苷对H2O2诱导损伤的Ins-1细胞保护作用。结果:纤维素酶法提取稠李花色苷的最佳条件为:温度60 ℃、纤维素酶添加量9 mg/g、料液比1∶35 (g/mL)、pH 3.5,此条件下稠李花色苷得率为(0.956±0.027) mg/g;形态学观察及MTT细胞活力实验显示,稠李花色苷对H2O2诱导损伤的Ins-1细胞具有较强的保护作用,DCFH-DA法检测细胞内活性氧实验说明,稠李花色苷能够显著地清除Ins-1细胞内的活性氧。结论:纤维素酶法制备稠李花色苷是一种有效的方法,制备的稠李花色苷对H2O2诱导的大鼠Ins-1细胞损伤具有较强的保护作用。

关键词:花色苷;酶法;氧化损伤;保护;大鼠胰岛素瘤(Ins-1)细胞

刘晓, 曹向宇, 李其久, 等. 稠李花色苷酶法制备及对H2O2诱导大鼠胰岛素瘤细胞损伤的保护作用[J]. 食品科学, 2016, 37(6): 7-12. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606002. http://www.spkx.net.cn

LIU Xiao, CAO Xiangyu, LI Qijiu, et al. Enzymatic preparation of anthocyanins from Padus racemosa fruits and protection against Ins-1 cell damage induced by H2O2[J]. Food Science, 2016, 37(6): 7-12. (in Chinese with English abstract)

随着生活水平的提高,健康饮食问题越来越受到人们的关注,特别是应用越来越广泛的色素,更是成为功能食品研究中的焦点。作为一种天然色素,花色苷由于其具有的安全、无毒等特性已被广泛的应用到食品、保健品、药品、化妆品等行业[1]。花色苷最早是Marguart于1835年提出,现在已成为同类物质的总称[2],其为由花青素与糖以糖苷键的形式结合而成的一类化合物[3]。由于花色苷具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血糖等作用,现在日益成为国内外研究的热点[4-7]。而稠李作为一种在东北地区普遍生长的观赏性植物,具有广泛的应用基础和前景。但是,目前国内外对稠李花色苷的研究较少,也主要集中在其纯化及体外抗氧化活性的研究[8]

按照世界卫生组织(World Health Organization,WHO)2015年发布的统计报道,2012年,估计糖尿病直接造成150万 例死亡,2014年,全球18 岁以上的成年人中糖尿病的患病率估计为9%[9],预计2030年糖尿病将成为第七位主要死因[10]。2型糖尿病(diabetes mellitus,T2DM)以不断加重的胰岛β细胞凋亡和胰岛素分泌下降为主要特征,显著和持续的高血糖造成的糖毒性是引起或加重胰岛β细胞功能减退的重要原因之一[11]。进一步研究发现高血糖浓度可以通过葡萄糖自氧化、蛋白酶C激活、氨基己糖代谢、氧化磷酸化等生物化学途径产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),从而诱发氧化应激[12],氧化应激的重要靶点之一即为胰岛β细胞。与其他组织细胞相比,胰岛β细胞含有抗H2O2氧化酶水平较低,应对自由基产生过多与清除障碍导致的细胞氧化-抗氧化系统失衡的能力较低,更易受到氧化应激损伤[13],因而,保护胰岛β细胞免于氧化应激损伤,进而预防和治疗糖尿病越来越受到重视[14]。本实验采用酶法制备稠李花色苷,并根据形态学观察、细胞活力实验和对细胞内ROS的检测实验来研究稠李花色苷对H2O2诱导损伤的大鼠胰岛素瘤(Ins-1)细胞保护作用,以期为稠李花色苷抑制胰岛细胞凋亡和功能减退作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

稠李果实在辽宁大学内采集并冷冻保存,经辽宁大学生命科学院孙军副教授鉴定为蔷薇科稠李属稠李(Padus racemosa);大鼠胰岛素瘤(Ins-1)细胞由中国医科大学盛京医院提供;纤维素酶、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC)上海沪试化工有限公司;2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydr ofluorescein diacetate,DCFH-DA) 美国Sigma公司;二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO) 国药集团化学试剂有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT] 上海起发实验试剂有限公司;氯化钾、H2O2、无水乙醇、醋酸钠、盐酸、丙酮等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BS223S电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;JW-3021HR高速冷冻离心机 安徽嘉文仪器装备有限公司;DZKW-D-6数显电热恒温水浴锅 上海申光仪器仪表有限公司;OLYMPUS DP73荧光倒置显微镜普赫光电(上海)科技有限公司;721N可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;CHRIST冷冻干燥机 北京鑫盛鸿阳科技有限公司;RE-52CS-2型旋转蒸发仪 上海虹昕电子仪器仪表有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台 苏州净化设备有限公司;Sunrise全自动酶标仪 瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 花色苷得率的测定

参照邓素芳等[15]的方法,花色苷得率按以下公式计算:

式中:C为花色苷得率;A0、A1分别为pH 1.0、4.5时花色苷在520 nm波长处的吸光度;V为提取溶液总体积/mL;n为比色稀释倍数;M为矢车菊-3-葡萄糖苷的相对分子质量;ε为矢车菊-3-葡萄糖苷的消光系数26 900;m为稠李果实质量/g。

1.3.2 酶法制备稠李花色苷

参照鲍诚等[16]的方法,略有改进,研究不同酶解温度、酶添加量、料液比、pH值对纤维素酶提取花色苷的影响。

1.3.2.1 酶法制备稠李花色苷的单因素试验

称取一定量的冷冻干燥之后的稠李果实粉末,按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)的比例,分别在pH 2、3、4、5、6的缓冲溶液中加入1、2、4、8、16 mg/g的纤维素酶,并分别在30、40、50、60、70 ℃条件下水浴反应60 min,4 000 r/min离心15 min,分离取上清液,进行比色。

1.3.2.2 酶法制备稠李花色苷的正交试验

根据单因素试验的最佳结果,以料液比1∶30(g/mL)、pH 3、酶解温度60 ℃、酶添加量8 mg/g作为中心组合试验因素,按L9(34)正交表对酶法提取稠李花色苷的工艺进行研究,确定最佳工艺参数,并在最佳工艺条件下进行验证实验。

1.3.3 稠李花色苷的纯化

参照刘剑利等[8]的方法,用AB-8大孔树脂对稠李花色苷进行纯化。

1.3.4 对H2O2诱导Ins-1细胞损伤的保护作用

1.3.4.1 稠李花色苷对H2O2诱导的Ins-1细胞的损伤模型形态学观察

将细胞接种到96孔板内,在37 ℃的体积分数5% 的CO2培养箱中培养24 h,然后,设置3 个实验组,分别为正常对照组,H2O2处理组和花色苷处理组,其中H2O2处理组加入0.5 mmol/L的H2O2,花色苷处理组加入0.5 mmol/L的H2O2和50 μg/mL的稠李花色苷,继续培养24 h后,在显微镜下观察细胞形态。

1.3.4.2 稠李花色苷对H2O2诱导Ins-1细胞损伤模型的细胞存活率影响

参照文献[17],将Ins-1细胞接种到96孔板中,每孔200 μL,培养24 h后,向其中加入纯化后的花色苷。实验分为阳性对照组、H2O2处理组、阴性对照组和花色苷处理组,其中阳性对照组加入200 μg/mL的NAC,花色苷处理组分别加入0.5 mmol/L的H2O2和12.5、25、50、100、200 μg/mL的稠李花色苷,处理1 h后,H2O2处理组加入0.5 mmol/L的H2O2,继续培养4 h,MTT法检测细胞活力。

1.3.4.3 稠李花色苷对H2O2诱导损伤的Ins-1细胞内ROS的影响

参考刘剑利等[8]方法,将Ins-1细胞进行种板,24 h后用0.5 mmol/L的H2O2处理,花色苷组0.5 mmol/L的H2O2和0.05 mg/mL的花色苷处理Ins-1细胞,除去细胞培养液,用磷酸盐缓冲液进行淋洗,加入20 μmmol/L的DCFHDA,温育30 min后再次淋洗,加入0.5 mL甲醇后,于-20 ℃固定30 min,再次淋洗,加入4 ℃预冷的丙酮0.5 mL,进行固定,每5 min一次用磷酸盐缓冲液进行淋洗3 次后,进行封片观察,检测稠李花色苷对H2O2诱导损伤的Ins-1细胞内ROS的影响。

1.4 数据分析

实验重复3 次,结果取±s,并用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 稠李花色苷含量的测定

根据计算公式,稠李花色苷的最终得率为(0.956±0.027) mg/g,与超声波提取稠李花色苷的得率相比较[18],提取率提高约15.18%。

2.2 单因素试验结果

图1 酶解温度对稠李花色苷得率的影响
Fig.1 Effects of hydrolysis temperature on the extraction yield of Padus racemos anthocyanins

2.2.1 酶解温度对酶法制备稠李花色苷得率的影响由图1可以得出,在一定温度范围内,稠李花色苷的得率随着温度的升高而升高,当温度到达60 ℃时,花色苷得率达到最大值,之后,花色苷得率反而降低。这可能是因为酶活性受到温度影响,在适宜的温度环境中,酶的活性会随着温度的升高而增加,因而得率也随之增加;当达到最适温度后,随着温度升高酶活性降低,因此,稠李花色苷的得率下降[19]

2.2.2 酶添加量对酶法制备稠李花色苷得率的影响

图2 酶添加量对稠李花色苷得率的影响
Fig.2 Effects of enzyme dosage on the extraction yield of Padus racemos anthocyanins

由图2可知,在一定酶添加量的范围内,稠李花色苷得率随着酶添加量的增加而增加,在当酶添加量达到8 mg/g时,花色苷得率达到最大值,继续增加酶添加量,花色苷得率反而降低。原因可能是:酶添加量小于最佳值时,酶解反应没有完全,底物较多,酶与底物未能充分接触,部分细胞壁未能破坏,花色苷释放较少。当酶添加量为最佳值时,酶解反应较彻底,稠李花色苷得率较高[20]

图3 料液比对稠李花色苷得率的影响
Fig.3 Effects of solid/liquid ratio on the extraction yield of Padus racemos anthocyanins

2.2.3 料液比对酶法制备稠李花色苷得率的影响由图3可知,在一定范围内,稠李花色苷的得率随着提取液用量的增加而增加,当料液比达到1∶30(g/mL)时,花色苷得率达到最大值,之后随着提取液用量的增加,花色苷得率反而下降。这可能是由于:在一定的范围内,当酶添加量固定时,随着提取液用量的增加,酶与底物充分接触,纤维素酶对细胞壁充分降解,使细胞组织迅速破坏,花色苷得以释放。但是随着提取液用量的增加,酶的浓度随之减少,酶与底物不能充分接触,酶解反应速率随着降低[21]

2.2.4 酶解pH值对酶法制备稠李花色苷得率的影响

图4 酶解pH值对稠李花色苷得率的影响
Fig.4 Effects of hydrolysis pH on the extraction yield of Padus racemos anthocyanins

由图4可知,随着提取液pH值的增大,稠李花色苷得率呈现先增大后减小的趋势,其中在pH值为3时花色苷的得率达到最大。可能是因为pH值影响酶的活性,在最适pH值条件下,酶解反应达到最大速度,而高于或低于最适pH值,都会降低酶活性,随之,稠李花色苷得率也会下降[3]

2.3 正交试验结果

通过对正交试验的结果进行方差分析(表1、2),得到4 种因素对花色苷得率的影响均极显著,正交试验结果表明,各因素对稠李花色苷得率的影响程度依次为料液比>pH值>酶添加量>酶解温度,其最佳工艺为A2B3C3D3,即酶解温度60 ℃、酶添加量9 mg/g、料液比1∶35(g/mL)、pH 3.5。

根据得到的最佳工艺条件进行验证实验,稠李花色苷的得率为(0.956±0.027) mg/g,比正交试验中各试验组得率都高,证明酶解温度60 ℃、酶添加量9 mg/g、料液比1∶35(g/mL)、pH 3.5是纤维素酶法制备稠李花色苷的最佳条件。

表1 正交试验设计及结果
Table 1 Orthogonal array design with experimental results

试验号 A酶解温度/℃B酶添加量/ (mg/g)C料液比(g/mL) D pH  花色苷得率/(mg/g)1  55 7 1∶25  2.5  0.656±0.012 2  55 8 1∶30  3.0  0.797±0.023 3  55 9 1∶35  3.5  0.932±0.009 4  60 7 1∶30  3.5  0.812±0.015 5  60 8 1∶35  2.5  0.874±0.015 6  60 9 1∶25  3.0  0.761±0.011 7  65 7 1∶35  3.0  0.911±0.013 8  65 8 1∶25  3.5  0.735±0.012 9  65 9 1∶30  2.5  0.789±0.015 k1 0.795  0.793  0.717  0.773 k2 0.816  0.802  0.799  0.823 k3 0.812  0.827  0.906  0.826 R  0.021  0.034  0.189  0.053

表2 正交试验结果方差分析
Table 2 Analysis of variance of the orthogonal array design

注:**.差异极显著,P<0.01。

方差来源  平方和  自由度  均方 F值 P值A酶解温度 0.003  2  0.001  6.969  <0.01** B酶添加量 0.006  2  0.003  13.920 <0.01** C料液比 0.165  2  0.082  398.723 <0.01** D pH 0.017  2  0.009  42.272 <0.01**

2.4 稠李花色苷对H2O2诱导Ins-1细胞损伤的保护作用

2.4.1 稠李花色苷对H2O2诱导的Ins-1细胞的损伤模型形态学观察

图5 稠李花色苷对HH2O2诱导损伤Ins-1细胞形态学的影响
Fig.5 Morphological observation of the protective effect of Padus racemos anthocyanins on H2O2-induced damage in Ins-1 cells

A.正常对照组;B. 0.5 mmol/L H2O2处理组;C. 50 μg/mL花色苷处理组。

从图5可以看出,正常组的细胞贴壁状态良好,边缘清晰,大小均匀,贴壁细胞数目较多(图5A),而经过H2O2处理后,明显出现细胞变圆收缩,体积变小,折光性变低,贴壁不良等状况(图5B),但是,在50 μg/mL的稠李花色苷处理组中,细胞形态具有明显的改变,同时细胞数目也具有一定的恢复,说明稠李花色苷具有良好的保护H2O2诱导损伤Ins-1细胞的作用。

2.4.2 稠李花色苷对H2O2诱导Ins-1细胞损伤模型的细胞存活率影响

图6 稠李花色苷对HH2O2诱导的Ins-1细胞的损伤模型的细胞存活率影响
Fig.6 Effect of Padus racemos anthocyanins on viability of Ins-1 cells with damage induced by H2O2

+.存在;—.不存在;##.与阴性对照组相比差异显著,P<0.01;**.与H2O2组相比差异显著,P<0.01。

从图6可以看出,稠李花色苷能够有效地保护H2O2诱导的Ins-1细胞损伤,当加入H2O2后,细胞的存活率变为48.78%,与正常对照组相比差异极显著(P<0.01),而经过稠李花色苷处理后,细胞存活率随着花色苷质量浓度的升高而上升,且呈现较好的线性关系,在质量浓度为200 μg/mL时细胞的存活率为86.64%,与H2O2组相比差异极显著(P<0.01)。阳性对照药NAC同样表现出抗氧化损伤的效果,在200 μg/mL质量浓度条件下其细胞存活率为80.7%。王婧茹等[22]通过MTT实验得到,氧化损伤模型组Ins-1 β细胞活力显著下降至(53.6±3.2)%,1 mmol/L的番石榴酸处理后Ins-1 β细胞活力升高至(65±4.0)%。

2.4.3 稠李花色苷对H2O2损伤的Ins-1细胞内ROS的影响

图7 稠李花色苷对H2O2损伤的Ins-1细胞内ROS的影响
Fig.7 Effect of Padus racemosa anthocyanins on ROS activity in Ins-1 cells

A.正常Ins-1细胞;B. 0.5 mmol/L H2O2处理Ins-1细胞;C. 0.5 mmol/L H2O2、0.05 mg/mL花色苷处理Ins-1细胞。

从图7可以得出,与正常组的Ins-1细胞相比,H2O2处理组的Ins-1细胞的荧光强度显著增强(图7B),说明H2O2组具有较高的细胞内ROS水平。当加入0.05 mg/mL的稠李花色苷进行处理后,荧光强度显著降低(图7C),说明稠李花色苷能够显著降低Ins-1细胞的ROS水平。在前期实验中,本研究组已得出稠李花色苷能够降低神经细胞N2A内的ROS水平,杨莉等[23]通过竹节参根茎粉对SH-SY5Y细胞进行细胞内ROS检测,得到H2O2组细胞内ROS含量与竹节参根茎粉处理组细胞内ROS含量差异极显著,Ullah等[24]通过荧光的ROS实验同样证明花色苷可降低细胞内的ROS水平,但其确切的作用机制还有待进一步研究。

3 结 论

本研究通过单因素和正交试验最终确定了酶法制备稠李花色苷的最佳条件为酶解温度60 ℃、酶添加量9 mg/g、料液比1∶35(g/mL)、pH 3.5,此条件下其得率为(0.956±0.027) mg/g;通过形态学观察及MTT细胞活力实验证明稠李花色苷在H2O2诱导损伤的Ins-1细胞中具有较强的保护作用,同时,清除ROS的DCFH-DA实验也证明其能够显著地清除细胞内的ROS。朱文赫等[25]使用越橘花色苷处理血管内皮细胞,同样得到越橘花色苷具有保护作用;林丽等[26]通过实验得到黑果枸杞花色苷对氧化低密度脂蛋白所损伤的人脐静脉内皮细胞具有保护作用,其机制可能与抗氧化作用有关。以上结果表明酶法制备稠李花色苷是一种有效的方法,制备的稠李花色苷经纯化后具有较好地保护H2O2诱导的Ins-1细胞损伤的作用,但其确切的机制还有待进一步研究;本实验采用Ins-1进行有关细胞水平的实验,这就为后期研究稠李花色苷是否在动物体内具有降血糖的功效以及是否由于氧化应激导致血糖降低的机制研究提供了一定的实验依据。

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Enzymatic Preparation of Anthocyanins from Padus racemosa Fruits and Protection against Ins-1 Cell Damage Induced by H2O2

LIU Xiao, CAO Xiangyu, LI Qijiu, SUN Yuhang, YANG Simin, YU Hui, WANG Weiyu, LIU Jianli*
(Liaoning University Academy of Science, Shenyang 110036, China)

Abstract: Purpose: To optimize the extraction conditions for anthocyanins from Padus racemosa fruits by cellulose hydrolysis, and to detect the protective effect of the extracted anthocyanins on H2O2-induced damage in Ins-1 cells. Methods: The optimization was performed by single factor and orthogonal array experiments. The protective effect of Padus racemosa anthocyanins on Ins-1 cells were examined by morphological observation, MTT assay and DCFH-DA fluorescent probe method. Results: The optimal extraction conditions were achieved by carrying out cellulose hydrolysis at 60 ℃, pH 3.5 and an enzyme dosage of 9 mg/g with a solid/liquid ratio of 1:35 (g/mL). Under these conditions, the yield of Padus racemosa anthocyanins was (0.956 ± 0.027) mg/g. Padus racemosa anthocyanins protected Ins-1 cells from damage induced by H2O2as indicated by morphological observation and MTT assay, and strongly scavenged reactive oxygen species in the DCFHDA fluorescent assay. Conclusions: Enzymatic hydrolysis is an effective method for extracting anthocyanins from Padus racemosa, and the extracted anthocyanins strongly protect against H2O2-induced damage in Ins-1 cells.

Key words: anthocyanin; enzyme; oxidative damage; protection; rat insulinoma (Ins-1) cell

中图分类号:TS264.4

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)06-0007-06引文格式:

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606002 10.7506/spkx1002-6630-201606002. http://www.spkx.net.cn

*通信作者:刘剑利(1980—),男,副教授,博士,研究方向为食品生物技术。E-mail:liujianli119@163.com

作者简介:刘晓(1990—),男,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。E-mail:liuxiao7879@163.com

基金项目:国家自然科学基金科学部主任基金项目(31240005);辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目(LJQ2013002);辽宁省高等学校科学研究一般项目(L2014007);辽宁省科技厅农业攻关计划项目(2011211001);辽宁大学博士科研启动项目

收稿日期:2015-06-10