响应面试验优化超声辅助提取金银花叶黄酮工艺及其抗氧化活性

罗 磊,张冰洁,朱文学,刘云宏,王雅琪,董金龙
(河南科技大学食品与生物工程学院,河南省食品原料工程技术研究中心,河南 洛阳 471023)

摘 要:为提高金银花叶中黄酮类化合物的提取率,在乙醇体积分数、提取温度、液料比和超声功率4 个单因素试验的基础上,通过二次通用旋转组合设计试验优化金银花叶黄酮的超声辅助提取工艺条件,并对其体外抗氧化活性进行研究。结果表明,在乙醇体积分数60%、液料比65∶1(mL/g)、提取温度46 ℃、超声功率250 W的条件下金银花叶黄酮提取率最高,可达15.67%,与模型预测值相符。抗氧化实验结果表明,金银花叶黄酮具有较强的抗氧化能力,其清除超氧阴离子自由基的能力与作用时间呈反比,与提取液质量浓度呈正比;清除羟自由基的IC(50)值为0.11 mg/mL,是对照品的34 倍。

关键词:金银花叶;黄酮;超声辅助提取;二次通用旋转组合设计;抗氧化活性

引文格式:

罗磊, 张冰洁, 朱文学, 等. 响应面试验优化超声辅助提取金银花叶黄酮工艺及其抗氧化活性[J]. 食品科学, 2016, 37(6): 13-19. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606003. http://www.spkx.net.cn

LUO Lei, ZHANG Bingjie, ZHU Wenxue, et al. Ultrasonic-assisted extraction and antioxidation of flavonoids from Lonicera japonica Thunb. leaves: process optimization by response surface methodology and antioxidant activity evaluation[J]. Food Science, 2016, 37(6): 13-19. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606003. http://www.spkx.net.cn

金银花(Lonicera japonica Thunb.)是常用中药材之一,具有抗菌消炎、清热解毒、凉散风热、抗病毒、保肝利胆等功能[1-3]。金银花叶作为金银花种植的副产物,产量大约是金银花的10 倍,价格便宜,采集容易且不受花期影响,却未被充分开发利用[4]。近年来国内外对金银花已有一定的研究,但对金银花叶的研究非常少。现已证实,金银花叶中含有与花类似的药理活性物质[5]。有报道[6-8]通过研究发现金银花叶中富含绿原酸、黄酮等多酚类物质,抑菌、抗氧化等药理活性较好,特别在抑菌方面与花的相同甚至高于花。景小琦等[9]研究表明金银花叶中的黄酮含量高于花蕾。其他研究[10-11]表明金银花叶粗黄酮的抑菌效果和抗氧活性均高于金银花叶中的绿原酸粗品。因此,对金银花叶资源利用方法的探讨具有一定的社会价值和经济效益。

超声波的机械效应和空化效应能够增大溶剂向原料细胞的渗透量并破坏细胞壁,有利于有效成分的溶出;其热效应可使溶剂和原料组织温度升高,提高有效成分的溶解速率,加速提取过程。因此,超声辅助提取技术具有提取时间短、提取效率高、适用性广、操作简单易行等优点,在天然产物的提取中应用广泛[12-14]。目前,对于金银花叶黄酮的超声辅助提取及其抗氧化活性缺乏系统研究。

本研究通过超声辅助提取金银花叶中黄酮类物质,采用二次通用旋转组合设计优化出最佳提取工艺,并对提取物中黄酮类物质清除超氧阴离子自由基、羟自由基的能力进行了研究,为金银花叶资源的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金银花叶于2015年4月上旬采自河南洛阳孟津金银花种植基地,品种为‘益丰一号’。选取大小均匀、无机械损伤、无病虫害的金银花叶,置于45 ℃恒温干燥箱中干燥至质量恒定,粉碎过40 目筛后备用。

芦丁(CAS号:153-18-4) 上海源叶生物科技有限公司;石油醚、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、抗坏血酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、连苯三酚、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、邻菲罗啉、硫酸亚铁、过氧化氢、苯甲酸钠等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

高速粉碎机 北京市永光明医疗仪器厂;FA1004型电子分析天平 美国双杰兄弟集团有限公司;KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;UV2400紫外-可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;XMTD-8222型鼓风干燥箱 上海精宏试验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线绘制

以芦丁为黄酮对照品按照NaNO2-Al(NO2)3-NaOH法[15]绘制标准曲线。测定样品溶液在510 nm波长处的吸光度,以质量浓度(ρ)对吸光度(A)进行线性回归得方程为:A=12.622ρ+0.030 2,R2=0.999 5。

1.3.2 金银花叶黄酮的提取

工艺流程:经预处理的金银花叶干粉→石油醚脱色脱脂→回收石油醚→超声辅助提取→抽滤→浓缩→定容→测定黄酮含量。

操作方法:准确称取2.00 g金银花叶粉末,经过石油醚脱色脱脂,加入乙醇溶液,充分混合后,放入超声波清洗器中提取30 min。过滤,浓缩,定容至50 mL容量瓶中,与对照品溶液同法显色,在510 nm波长处测其吸光度。每组实验重复3 次,求其平均值。黄酮提取率计算如公式(1)所示:

式中:ρ为提取液样品中的黄酮质量浓度/(g/L);V0为提取液定容后的体积/L;V1为量取提取液样品测定定容的体积/L;V2为量取提取液样品测定的体积/L;m为金银花叶的质量/g。

1.3.3 单因素试验设计

分别以液料比(10∶1、25∶1、40∶1、55∶1、70∶1、85∶1、100∶1(mL/g))、提取温度(20、30、40、50、60、70、80 ℃)、超声功率(200、250、300、350、400、450、500 W)、乙醇体积分数(10%、25%、40%、55%、70%、85%、100%)为影响因素,设置4 个因素的不同水平,分析不同的提取条件对金银花叶中黄酮物质提取效果的影响,检测指标为金银花叶中黄酮提取率。

1.3.4 二次通用旋转组合设计优化金银花叶黄酮的提取工艺

表1 四元二次通用旋转组合设计试验因素与水平
Table 1 Factors and levels used in second-order rotation combination experimental design

水平因素X1液料比(mL/g)X2提取温度/℃X3超声功率/W X4乙醇体积分数/%上星号臂(2) 75∶1 70 350 65上水平(1) 65∶1 60 300 60零水平(0) 55∶1 50 250 55下水平(-1) 45∶1 40 200 50下星号臂(-2) 35∶1 30 150 45 Δj 10∶1 10 50 5

在单因素试验的基础上,对液料比(X1)、提取温度(X2)、超声功率(X3)和乙醇体积分数(X4)4 个因素进行四元二次通用旋转组合设计[16],因素水平见表1。1.3.5 金银花叶黄酮清除超氧阴离子自由基的能力

表2 连苯三酚实验加样表
Table 2 Experimental procedures for the determination of superoxide anion radical scavenging ativity by the pyrogallol autoxidation method

吸光度  加样过程A0 2.7 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液+0.2 mL蒸馏水,25 ℃保温10 min后加入0.1 mL 25 ℃预温的1.5 mmol/L连苯三酚溶液Ai 2.7 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液+0.2 mL不同质量浓度的待测液,25 ℃保温10 min后加入0.1 mL 25 ℃预温的10 mmol/L HCl溶液Aj 2.7 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液+0.2 mL不同质量浓度的待测液,25 ℃保温10 min后加入0.1 mL 25 ℃预温的1.5 mmol/L连苯三酚溶液

参照连苯三酚法[17]测定金银花叶黄酮清除超氧阴离子自由基能力,配制不同质量浓度(0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 mg/mL)的金银花叶黄酮提取液作为待测液,备用。按表2加样于具塞比色管中,迅速摇匀后每隔30 s,用紫外-可见分光光度计于320 nm波长处测定相应吸光度,至3 min止,以10 mmol/L HCl溶液为参比液,计算清除率,实验重复3 次取平均值。清除率计算如式(2)所示:

式中:S为清除率/%;Aj为待测液在波长320 nm处的吸光度;Ai为待测液和连苯三酚混合液的吸光度;A0为连苯三酚溶液在波长320 nm处的吸光度。

1.3.6 金银花叶黄酮清除羟自由基的能力

以Fenton反应产生羟自由基,用邻二氮菲-Fe2+氧化比色法[18]测定金银花叶黄酮对羟自由基的清除率。参照谢海玉等[19]的方法稍作修改进行,配制不同质量浓度的金银花叶黄酮提取液(0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21 mg/mL)和苯甲酸钠对照品溶液(0.44、0.89、1.78、2.67、3.56、4.4 mg/mL)作为待测液,备用。向10 mL具塞试管中依次加入1.0 mL 邻二氮菲溶液(2.5 mmol/L)、2 mL KH2PO4-KOH缓冲液(0.4 mol/L,pH 7.40)、1.5 mL蒸馏水,充分摇匀后,加入1 mL FeSO4溶液(2.5 mmol/L),混匀,加入1 mL H2O2溶液(20 mmol/L),置于37 ℃恒温水浴锅中反应1.5 h,于波长536 nm处测定其吸光度A1。将上述体系中的H2O2溶液用相同体积的蒸馏水代替,其他操作相同,测定吸光度A0。再用1.5 mL不同质量浓度待测液代替A1体系中加入的蒸馏水,测定其吸光度Ai。按式(3)计算羟自由基的清除率,并求出清除率50%所对应的质量浓度IC50

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对金银花叶黄酮提取率的影响

称取2.00 g经预处理的金银花叶粉末,按照25∶1的液料比,加入体积分数分别为10%、25%、40%、55%、70%、85%、100%的乙醇溶液,用玻璃棒轻轻搅拌,使粉末充分浸没,在提取温度50 ℃、超声功率200 W的条件下提取30 min,过滤、定容后测定吸光度。

图1 乙醇体积分数对金银花叶黄酮提取率影响
Fig.1 Influence of ethanol concentration on the extraction yield of flavonoids from honeysuckle leaves

由图1可知,随着乙醇体积分数的增大,黄酮提取率先增大后减小,在乙醇体积分数为55%时达到最大。呈现这种现象可能是因为随着乙醇体积分数的增加,材料细胞的溶胀增强,促进提取溶剂有效地向细胞内渗透,从而增加提取率[20]。但当乙醇体积分数超过55%后,溶剂极性下降,水溶性黄酮的溶出减少,同时一些醇溶性杂质、色素及脂溶性杂质溶出增多,这些杂质会和脂溶性黄酮竞争溶剂,从而降低黄酮类化合物的溶解度。因此,选择乙醇体积分数为55%。

2.1.2 液料比对金银花叶黄酮提取率的影响

称取2.00 g经预处理的金银花叶粉末,分别按照10∶1、25∶1、40∶1、55∶1、70∶1、85∶1、100∶1(mL/g)的液料比加入55%的乙醇溶液,在提取温度50 ℃、超声功率200 W的条件下提取30 min,过滤、浓缩、定容后测定吸光度。

图2 液料比对金银花叶黄酮提取率影响
Fig.2 Influence of solvent to solid ratio on the extraction yield of flavonoids from honeysuckle leaves

由图2可知,随着液料比的逐渐递增,黄酮提取率先升高后降低,在液料比为55∶1(mL/g)时达到最大。这是因为液料比越大,提取液中黄酮质量浓度越低,传质推动动力越大,提取速率增加,提取率增大[21]。当液料比继续增大时,黄酮的提取率缓慢降低,这可能是因为有大量的杂质溶出,影响了黄酮的浸出率[20];也可能是由于已浸出的大量黄酮对剩余黄酮有协同浸提的作用[22]。过高的液料比会造成原料和试剂的浪费,增加成本,给后处理工序增加困难,所以,在保证高提取率的前提下,尽量减少溶剂用量,降低蒸发浓缩负荷,适宜液料比为55∶1(mL/g)。

2.1.3 提取温度对金银花叶黄酮提取率的影响

称取2.00 g经预处理的金银花叶粉末,按照55∶1的液料比加入体积分数为55%的乙醇溶液,分别在提取温度为20、30、40、50、60、70、80 ℃,超声功率200 W的条件下提取30 min,过滤、浓缩、定容后测定吸光度。

图3 提取温度对金银花叶黄酮提取率影响
Fig.3 Influence of extraction temperature on the extraction yield of flavonoids from honeysuckle leaves

由图3可知,随着提取温度的升高,金银花叶黄酮的提取率先升高后下降,在50 ℃时提取率达到最大。出现这种现象的原因可能是,随着温度的升高,分子运动速率加快,提取液的黏稠度降低,黄酮的溶解度升高,因而提取率升高[23]。但当温度继续升高,溶剂挥发加剧,反而减小了溶剂与物料的接触面积,降低了扩散速率;并且在高温条件下,杂质的溶出量增加[24],不溶性杂质吸附了黄酮类化合物,使得黄酮含量降低。温度过高在生产中不易控制、能耗较大,还易造成溶剂损失,因此,鉴于黄酮的热稳定性及杂质的溶出温度,最适提取温度为50 ℃。

2.1.4 超声功率对金银花叶黄酮提取率的影响

称取2.00 g经预处理的金银花叶粉末,按照55∶1的液料比加入55%的乙醇溶液,在提取温度50 ℃、超声功率分别为200、250、300、350、400、450、500 W的条件下提取30 min,过滤、浓缩、定容后测定吸光度。

图4 超声功率对金银花叶黄酮提取率影响
Fig.4 Influence of ultrasonic power on the extraction yield of flavonoids from honeysuckle leaves

由图4可知,随着超声功率的增大,金银花叶中黄酮类化合物提取率先升高后下降,在250 W时黄酮提取率最大。这可能是因为黄酮类化合物是次生代谢产物,大部分存在于细胞膜内,超声波的机械效应和空化效应会破坏细胞壁和细胞膜,使黄酮更容易被溶出,超声功率越大,越能有效破坏物料组织的细胞壁,使黄酮充分溶出。但随着超声功率的继续增大,分子运动逐渐加剧,加强了黄酮分子和其他成分之间的反应而使黄酮遭到破坏,导致提取率下降[25]。因此,最适超声功率为250 W。

2.2 金银花叶黄酮提取的二次通用旋转组合试验结果

表3 四元二次通用旋转组合设计试验结果
Table 3 Second-order rotation combination experimental design with experimental results

试验号 X1液料比 X2提取温度X3超声功率X4乙醇体积分数黄酮提取率/% 1 1 1 1 1 14.615 2 1 1 1  -1 13.865 3 1 1  -1 1 14.118 4 1 1  -1  -1 13.223 5 1  -1 1 1 14.853 6 1  -1 1  -1 14.291 7 1  -1  -1 1 15.039 8 1  -1  -1  -1 14.439 9  -1 1 1 1 13.627 10  -1 1 1  -1 14.235 11  -1 1  -1 1 14.075 12  -1 1  -1  -1 14.001 13  -1  -1 1 1 13.510 14  -1  -1 1  -1 14.350 15  -1  -1  -1 1 13.827 16  -1  -1  -1  -1 13.942 17  -2 0 0 0 14.203 18 2 0 0 0 14.754 19 0  -2 0 0 14.596 20 0 2 0 0 12.868 21 0 0  -2 0 12.696 22 0 0 2 0 14.477 23 0 0 0  -2 14.308 24 0 0 0 2 15.303 25 0 0 0 0 15.798 26 0 0 0 0 15.523 27 0 0 0 0 15.358 28 0 0 0 0 15.294 29 0 0 0 0 15.590 30 0 0 0 0 15.154 31 0 0 0 0 15.972

2.2.1 模型建立与显著性检验

采用DPS v7.05数据处理软件设计了四因素五水平共31 个试验点的二次通用旋转组合试验,以黄酮提取率(Y)为指标,试验方案及结果如表3所示。经回归拟合后,得到黄酮类化合物提取率对液料比(X1)、提取温度(X2)、超声功率(X3)和乙醇体积分数(X4)的二次多项式回归方程为:

Y=15.527 03+0.165 72X1-0.247 75X2+0.176 77X3+0.137 82X4-0.266 25X12-0.452 93X22-0.489 33X32-0.184 55X42-0.194 35X1X2+0.057 93X1X3+0.268 63X1X4+0.073 04X2X3+0.056 45X2X4-0.099 28X3X4

表4 试验结果方差分析
Table 4 Analysis of variance of regression model equation

注:P<0.01,差异极显著;P<0.05,差异显著。

变异来源  平方和  自由度  均方  偏相关 F值 P值X1液料比 0.659 1  1  0.659 1  0.478 4  4.748 0  0.044 6 X2提取温度 1.473 1  1  1.473 1 -0.631 5  10.612 2  0.004 9 X3超声功率 0.750 0  1  0.750 0  0.502 4  5.402 8  0.033 6 X4乙醇体积分数 0.455 9  1  0.455 9  0.412 7  3.284 1  0.088 8 X1X2 0.604 4  1  0.604 4 -0.462 5  4.353 9  0.053 3 X1X3 0.053 7  1  0.053 7  0.153 7  0.386 9  0.542 7 X1X4 1.154 6  1  1.154 6  0.584 8  8.317 5  0.010 8 X2X3 0.085 4  1  0.085 4  0.192 4  0.614 9  0.444 4 X2X4 0.051 0  1  0.051 0  0.149 8  0.367 3  0.553 0 X3X4 0.157 7  1  0.157 7 -0.257 5  1.136 1  0.302 3 X1 2 2.027 2  1  2.027 2 -0.690 8  14.603 6  0.001 5 X2 2 5.866 3  1  5.866 3 -0.851 7  42.260 6  0.000 1 X3 2 6.846 9  1  6.846 9 -0.868 9  49.325 0  0.000 1 X4 2 0.973 9  1  0.973 9 -0.552 1  7.016 2  0.017 5回归 18.021 8  14  1.287 3 F2=9.273 44 0.000 1剩余 2.221 0  16  0.138 8失拟 1.724 0  10  0.172 4 F1=2.081 46 0.092 2误差 0.497 0  6  0.082 8总和 20.242 8  30

如表4所示,4 个因素对提取率的影响顺序为:提取温度>超声功率>液料比>乙醇体积分数。对模型Y=f(X1,X2,X3,X4)进行方差分析,一次项X1、X2、 X3、X4,交叉项X1X2、X1X4及二次项对试验指标有显著或极显著的影响,其余项不显著,剔除不显著项,得到的模型方程为:Y=15.527 03+0.165 72X1-0.247 75X2+0.176 77X3+0.137 82X4

对二次回归方程进行F检验和失拟性检验,结果表明:F2=9.27,P<0.01水平上极显著,R2=0.913,说明该模型与实际数据相关性较好;失拟性检验F1=2.08,P>0.05不显著,说明回归方程与实际情况拟合性好。因此该模型是合适的,可用于超声辅助提取金银花叶黄酮的分析和预测。

2.2.2 响应面交互作用分析

将2 个因素固定在0水平,经Design-Expert 8.05软件统计分析,观察其余2个因素的交互作用。做响应面和等高线图,进行试验因素对金银花叶黄酮提取率影响的两两交互作用评价,同时确定各因素的最优作用范围。由图5可知,响应面坡度都比较陡峭,说明液料比(X1)和乙醇体积分数(X4)对黄酮提取率的影响均较大。由响应面的等高线图可知,液料比55∶1~75∶1(mL/g)、乙醇体积分数57%~65%的范围内黄酮提取率较高。响应面的等高线图呈椭圆形,表明二者交互作用非常显著,这一点与表4的显著性分析结果一致。液料比(X1)和乙醇体积分数(X4)交互作用显著可能是因为料液比会影响溶质分子质量浓度,因而对金银花叶黄酮的提取率产生交互影响。

图5 乙醇体积分数和液料比交互作用对黄酮提取率影响的响应面
Fig.5 Response surface plots for the effects of ethanol concentration and liquid/material ratio on the extraction yield of total flavonoids

2.2.3 验证实验

由回归方程优化得出因素水平的最优组合,并将各因素水平换算为对应的实测值,得到金银花叶黄酮提取的最优工艺参数为:液料比64.71∶1(mL/g)、提取温度45.88 ℃、超声功率255.36 W、乙醇体积分数59.94%。考虑到实际操作可行性,将最佳提取条件修正为液料比65∶1(mL/g)、提取温度46 ℃、超声功率250 W、乙醇体积分数60%,在该条件下的响应面模型指标值为15.74%。根据修正的最佳工艺条件,进行6 次重复验证实验,测得黄酮提取率的均值为(15.67±0.81)%,与理论预测值误差绝对值低于5%,且经t检验的结果差异不显著(P>0.1),说明运用二次通用旋转组合设计优化得到的模型参数准确可靠。

2.3 金银花叶黄酮的抗氧化活性分析

图6 金银花叶黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用
Fig.6 Scavenging effects of flavonoids from honeysuckle leaves on
superoxide anion free radical

2.3.1 超氧阴离子自由基清除效果如图6所示,当质量浓度不变时,金银花叶黄酮提取液清除超氧阴离子自由基的能力与作用时间呈反比;而且在相同反应时间时,其清除超氧阴离子自由基的能力大致上与提取液质量浓度呈正比。当作用30 s时,不同质量浓度金银花叶提取液的清除率均最高,90 s后,质量浓度低于0.12 mg/mL的金银花叶提取液的清除率非常小且变化不大,说明低质量浓度的金银花叶提取液经过一段时间后已基本失去清除超氧阴离子自由基的能力。

2.3.2 羟自由基清除效果

图7 苯甲酸钠及金银花叶黄酮对羟自由基的清除作用
Fig.7 Scavenging effects of sodium benzoate and flavonoids from
honeysuckle leaves on hydroxyl radical

从图7可知,苯甲酸钠对羟自由基清除作用的IC50为3.73 mg/mL,而金银花叶黄酮的IC50为0.11 mg/mL。金银花叶黄酮对羟自由基的清除能力是对照品苯甲酸钠的34 倍,由此进一步证实金银花叶中黄酮类物质具有较强的抗氧化作用。

3 结 论

通过二次通用旋转组合设计试验得出超声辅助提取金银花叶黄酮的优化回归数学模型相关系数为R2=0.913,表明该模型较好,此模型在试验范围内能较准确预测金银花叶黄酮提取率;各因素对金银花叶黄酮提取率影响顺序为提取温度>超声功率>液料比>乙醇体积分数。超声辅助提取金银花叶黄酮的最佳方案为:液料比65∶1(mL/g)、提取温度46 ℃、超声功率250 W、乙醇体积分数60%。经实验验证金银花叶黄酮的提取率可达到15.67%,与理论值基本一致。

金银花叶黄酮的抗氧化实验表明,金银花叶黄酮具有很强的清除超氧阴离子自由基和羟自由基的能力。金银花叶提取液清除超氧阴离子自由基的能力与作用时间呈反比,与提取液质量浓度呈正比。金银花叶提取液清除羟自由基50%所对应的质量浓度IC50是0.11 mg/mL,对照品苯甲酸钠的IC50为3.73 mg/mL,金银花叶提取液清除羟自由基能力是对照品的34 倍。

金银花叶中黄酮类化合物提取工艺及其抗氧化能力的研究为金银花叶的进一步开发利用提供了理论依据。实验中所用的是黄酮粗提液,可能含有蛋白质、纤维素等杂质,金银花叶中黄酮的组成、结构以及纯化等还需进一步的研究。

参考文献:

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Ultrasonic-Assisted Extraction and Antioxidation of Flavonoids from Lonicera japonica Thunb. Leaves: Process Optimization by Response Surface Methodology and Antioxidant Activity Evaluation

LUO Lei, ZHANG Bingjie, ZHU Wenxue, LIU Yunhong, WANG Yaqi, DONG Jinlong
(Food Materials Engineering Technology Research Center of Henan Province, College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

Abstract: The extraction of flavonoids from leaves of Lonicera japonica Thunb. (L. japonica) was optimized by the combined use of single factor experiments and response surface methodology. For this purpose, a second-order rotation combination experimental design was conducted using ethanol concentration, extraction temperature, ratio of solvent to materials and ultrasonic power as the independent variables. The in vitro antioxidant activity of the obtained flavonoids was studied. Results indicated that the highest yield of flavonoids of 15.67% was achieved when the extraction was carried out with an ultrasonic power of 250 W using 60% ethanol as the extraction solvent at a solvent/solid ratio of 65:1 (mL/g), which was in good agreement with the model predicted value. Antioxidant tests showed that the flavonoids extracted from the leaves of L. japonica possessed strong antioxidant ability, and the superoxide anion free radical scavenging capacity was negatively correlated with reaction time but positively correlated to their concentration. The IC(50)for scavenging hydroxyl radical was 0.11 mg/mL, a 34-fold increase over that of control.

Key words: Lonicera japonica Thunb. leaves; flavonoid; ultrasonic-assisted extraction; quadratic general rotation combination design; antioxidant capacity

中图分类号:TS209

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)06-0013-07

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606003

作者简介:罗磊(1976—),男,副教授,博士,研究方向为食品干燥品质控制、食品营养成分与活性。E-mail:13623896431@139.com

基金项目:国家自然科学基金联合基金项目(U1304330)

收稿日期:2015-07-20