发芽糙米铁生物强化的正交试验优化及其形态分析

梅 婵,方 勇,裴 斐,杨文建,王红盼,胡秋辉*
(南京财经大学食品科学与工程学院,江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心,江苏 南京 210023)

摘 要:研究稻谷品种、铁营养剂、Fe(2+)浓度、浸泡温度、浸泡时间、培育温度、培育时间对发芽糙米有机铁和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)含量的影响,优化了糙米发芽过程中有机铁生物强化的生产工艺,并对发芽糙米铁形态进行分析。结果表明,以0.005 mol/L FeSO4溶液为铁营养剂对‘绿旱1号’品种糙米进行铁强化发芽处理时,有机铁和GABA含量显著提高。获得铁强化发芽糙米最优生产工艺条件为:浸泡温度30 ℃、浸泡时间10 h、培育温度32 ℃、培育时间44 h。在此条件下获得的铁强化发芽糙米的有机铁含量为(405.48±9.18)mg/kg,是普通发芽糙米的51 倍,其中铁主要是与蛋白结合的形态,占总铁含量的53.74%;GABA含量为(508.04±13.50)mg/kg,是普通发芽糙米的14 倍。

关键词:糙米;发芽;有机铁;γ-氨基丁酸

梅婵, 方勇, 裴斐, 等. 发芽糙米铁生物强化的正交试验优化及其形态分析[J]. 食品科学, 2016, 37(6): 52-57. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606009. http://www.spkx.net.cn

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铁是人体必需的微量营养素之一,它主要参与人体的供氧系统和促进酶活性以保证生命活动[1-3]。目前,铁缺乏已经是全球三大隐性饥饿之一,是全世界尤其是发展中国家面临的主要营养问题之一,解决这一问题主要方法是药物治疗或者食物中强化铁元素[4]。目前,我国约有2/3人口以稻米为主食,但是,稻米中的有机铁含量都较低,无法满足人们对于必需微量元素的需求[5-6]。因此铁强化发芽糙米不仅能满足人体对铁元素的需求,也可以减少对补铁药品、食品中添加铁元素的经济投入。同时研究铁强化发芽糙米中铁元素的存在形态有利于揭示生物强化铁在发芽糙米中与有机物的协同作用,对研究铁强化发芽糙米的营养价值有一定的意义。目前国内外主要通过生物强化的方式提升稻米中的铁含量,其中利用糙米发芽过程来提高稻米中铁元素含量的报道很少,铁形态分析研究更少。通过铁营养剂溶液培育发芽糙米,不仅能提升发芽糙米中有机铁含量,而且其中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)含量增加显著,更利于人体吸收[7-8]。已有研究[9-11]发现通过铁营养剂溶液对黄豆进行发芽培育,使豆芽中铁含量由11 mg/100 g升至311.6 mg/100 g。研究探索有机铁强化能力强、GABA富集含量高的稻米品种以及有利于稻米有机铁、GABA富集的经济适用型铁营养剂,研究富铁发芽糙米工艺优化条件和其中铁元素形态分布,这不仅为人们缺铁问题提供解决方案,也为后期进一步研究铁强化发芽糙米的营养性能奠定基础,为我国稻米加工业以及铁强化食品开辟新的途径。

本研究以不同品种稻谷为材料筛选出有机铁和GABA富集含量较高的品种,选取不同铁营养剂并筛选出最有益于发芽糙米有机铁强化和GABA富集的铁营养剂。同时,研究不同工艺条件下有机铁和GABA含量变化,优化铁强化发芽糙米生产工艺条件,为铁强化发芽糙米产业化生产加工提供依据。同时对铁强化发芽糙米中铁形态分布进行研究,为进一步研究铁生物强化发芽糙米提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘泰瑞丰5号’稻谷 安徽国瑞种业有限公司;‘绿旱1号’、‘南粳9108’、‘南粳505’稻谷 安徽皖垦种业股份有限公司;‘丰优22’稻谷 江苏苏垦种业有限公司;‘华安3号’稻谷 江苏天普农种业有限公司;‘临旱1号’稻谷 山东省临沂市水稻研究所;‘大粮202’稻谷 山东临沂市大粮种业有限公司。

FeSO4、FeCl2国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖酸亚铁(C12H22O14Fe)、富马氨酸亚铁(C4H2FeO4)、柠檬酸铁铵(FeC6H5O7·NH4OH) 上海宝曼生物科技有限公司;甲醇、乙腈均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

JLGJ4.5型检验垄谷机 台州市粮仪厂;恒宇PYSDHS-BS-Ⅱ隔水式电热恒温恒湿培养箱 上海跃进医疗机械有限公司;CEM微波消解仪 美国培安科技有限公司;HITACHIZ-2000火焰原子吸收分光光度计 株式会社日立制作所;1260高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪 美国Agilent科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同品种稻谷发芽糙米的培育

分别选取不同品种糙米进行发芽糙米富铁能力优化,每种样品各100 g置于0.002 mol/L的FeSO4溶液中,在30 ℃恒温水浴锅中浸泡8 h,放入30 ℃恒温恒湿培养箱中培养40 h。漂洗灭酶,50 ℃干燥12 h,测定各品种铁强化发芽糙米中有机铁含量和GABA含量。

1.3.2 不同铁营养试剂发芽糙米的培育

根据SNT—2360.17《食品进出口添加剂检验规程》营养强化剂部分选取5 种铁营养剂,以‘绿旱1号’为实验材料,将样品置于0.002 mol/L的FeSO4、FeCl2、C12H22O14Fe、C4H2FeO4、FeC6H5O7·NH4OH 5 种铁营养剂溶液中,在30 ℃恒温水浴锅中浸泡8 h,放入30 ℃恒温恒湿培养箱中培养40 h。漂洗灭酶,50 ℃干燥12 h。

1.3.3 铁强化发芽糙米制备的单因素试验

在此分别以不同的浸泡温度(25、30、35、40 ℃)、FeSO4浓度(0.001、0.002、0.005、0.01、0.015、0.02 mol/L)、浸泡时间(6、8、10、12、14 h)、培育温度(25、30、35、40 ℃)、培育时间(24、36、48、60 h)为单因素进行试验,考察各因素对发芽糙米有机铁和GABA含量的影响。

1.3.4 铁强化发芽糙米制备工艺条件正交试验优化

表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and their coded levels used in orthogonal experimental design

水平因素A浸泡温度/℃B浸泡时间/h C培育温度/℃D培育时间/h 1 25 8 28 40 2 30 10 30 44 3 35 12 32 48

采用L9(34)正交试验方法,为全面考察各因素影响,以浸泡温度、浸泡时间、培育温度、培育时间作为考察因素,设计试验方案见表1,称取9 份‘绿旱1号’糙米,分别按试验方案培育发芽,干燥贮存备用。以有机铁、GABA含量为指标进行检测分析,以得到最优铁强化发芽糙米的制备工艺条件。

1.3.5 有机铁含量的测定

参照刘昆仑[12]方法测定有机铁。称取0.5 g铁强化发芽糙米粉于透析袋中(截留分子质量3 500 D),两端封闭后于100 mL烧杯中加入50 mL蒸馏水,于37 ℃水浴摇床中透析1 周,期间每12 h更换透析液1 次,透析结束后合并透析液,浓缩干燥后称取0.5 g样品进行微波消解,赶酸,火焰原子吸收分光光度计测定有机铁含量。

1.3.6 GABA含量的测定

参照何荣等[13]的方法测定GABA。称取3.00 g样品粉,以1∶7的料液比加入21 mL超纯水,超声波辅助提取2 h,以15 000 r/min离心15 min取上清液,并过滤定容至25 mL容量瓶。取1 mL样液于具塞试管中,加入pH 9.0的硼砂-硼酸缓冲液2 mL和5 ømol/mL的4-氯-3,5二硝基三氯甲苯衍1 mL,封口振荡,65 ℃水浴40 min后取出冷却,用pH 7.0的磷酸盐缓冲液定容至10 mL,摇匀后用0.22 øm微孔滤膜过滤器过滤至上机小瓶。

H P L C条件:色谱柱:E c l i p s e X D B - C1 8(4.6 mm×250 mm,5 øm)。流动相A:乙腈-水(1∶1,V/V),流动相B:0.05 mol/L的醋酸盐缓冲液(pH 6.8)。紫外检测波长:238 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 øL;流速:1 mL/min。梯度洗脱程序为:0~10 min,50%~60% A;10 min,60%~95% A;10~15 min,95% A;15~17 min,95%~50%A;17~20 min,50% A。

1.3.7 铁强化发芽糙米中铁形态分析

参照Ju等[14]方法提取4 种蛋白溶液。样品粉用正已烷脱脂后依次用纯水(清蛋白)、1 mol/L NaCl溶液(球蛋白)、70%乙醇溶液(醇溶蛋白)、0.1 mol/L NaOH溶液(谷蛋白)于25 ℃提取2 h,每步骤重复3 次。每次提取后,样品于6 000 r/min离心20 min,合并上清液,于4 ℃冷藏备用。其中,取一半的水提物直接测定游离的无机铁含量,另一半取1 mL进行消化、赶酸,测定总铁含量,蛋白结合铁含量=总铁含量-无机铁含量。最后得到的残渣为粗淀粉和纤维,冻干,取0.5 g进行消化、赶酸,定容至20 mL测定铁含量。

参照陈琛等[15]的方法提取多糖。称取5.0 g样品粉,在70 ℃条件下按料液比1∶60(g/mL)恒温水浴振荡2 h,将经过抽滤得到的可溶液旋转蒸发至50 mL,取可溶液2 mL,加10 mL无水乙醇混合均匀,4 000 r/min离心10 min,所得沉淀用蒸馏水溶解,定容至10 mL,取1 mL进行消化、赶酸,测定铁含量。

2 结果与分析

2.1 稻谷品种对发芽糙米中有机铁和GABA含量的影响

图1 稻米品种对有机铁(a)、GABA(b)含量的影响
Fig.1 Effect of rice varieties on the contents of organic iron (a) and GABA (b)

小写字母不同表示对照组间差异显著,大写字母不同表示FeSO4处理组间差异显著(P<0.05)。

对水稻籽粒有机铁含量研究表明,有机铁含量在大部分水稻基因型中是不同的,一般食用糙米中铁元素的含量为5~13 mg/kg。如图1所示,在0.002 mol/L的FeSO4溶液培育条件下,不同品种对发芽糙米有机铁、GABA含量有显著影响(P<0.05),其中‘绿旱1号’有机铁含量最高,可达到(243.33±18.35)mg/kg(图1a),‘泰瑞丰5号’GABA含量最高,达到(264.39±4.69)mg/kg,与‘绿旱1号’无显著性差异(图1b)。不同品种间有机铁含量的差异性可能与不同稻米所生长的环境、营养物质组成、遗传因素相关[16]。糙米的胚层和糊粉层中含有丰富的生理活性物质,如GABA、谷维素等,具体含量与稻谷品种、栽种季节有关[1]。因此选择‘绿旱1号’作为实验材料进行下一步研究。

2.2 铁营养剂种类对发芽糙米中有机铁和GABA含量的影响

图2 5 种铁营养强化剂对有机铁(A)、GABA(B)含量的影响
Fig.2 Effect of five iron nutrition enhancers on the contents of organic iron (A) and GABA (B)

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

如图2所示,在0.002 mol/L浓度条件下,不同品种铁营养剂对铁强化发芽糙米有机铁、GABA含量有显著影响(P<0.05),如图2A所示,FeSO4和C12H22O14Fe培育的发芽糙米中有机铁含量最高,且两种铁营养剂之间无显著性差异。FeC6H5O7·NH4OH培育条件下高铁发芽糙米有机铁含量最少,这可能与FeC6H5O7·NH4OH是铁盐而其他铁营养剂均为亚铁盐有关。根据傅友强等[17]对不同铁形态对水稻生物铁吸收量的研究发现,FeCl2处理铁吸收量显著大于FeCl3处理,可能是由于Fe2+是植物的吸收形态更易进入细胞进行跨膜转运。如图2B所示,在5 种铁营养剂培育条件下,C12H22O14Fe培育的发芽糙米GABA富集最高,达(284.07±6.98)mg/kg,这可能是因为葡萄糖酸亚铁溶液的pH值接近谷氨酸脱羧酶最佳活性pH值,pH 5.0~6.0左右酶的活性最佳[18]。由于C12H22O14Fe价格较高,因此选用FeSO4作为铁营养剂进行下一步研究。

2.3 铁强化发芽糙米制备工艺条件优化

图3 FeSO4浓度(a)、浸泡温度(b)、浸泡时间(c)、培育温度(dd)和培育时间(e)对发芽糙米有机铁、GABA含量的影响
Fig.3 Effect of iron concentration (a), soaking temperature(b), soaking time (c), germinating temperature (d), germinating time (e) on the contents of organic iron and GABA in germinated brown rice

如图3a所示,发芽糙米中有机铁和GABA含量与FeSO4溶液浓度密切相关。随着浸泡液FeSO4浓度的增加,有机铁、GABA含量呈现递增趋势。但是,当FeSO4溶液浓度大于0.005 mol/L时增加缓慢,且有机铁含量差异性不显著,并且发芽糙米芽长开始变短,发芽受到影响。这可能是因为Fe2+是细胞中许多酶的组成成分或激活剂,适量铁离子的存在促进了Fe2+转化、GABA的合成[19],然而过高的Fe2+浓度会导致糙米失水,蛋白质变性,酶活性降低,进而抑制植物生长,使糙米发芽受到影响[20]。因此Fe2+浓度安全范围应为0~0.005 mol/L。当Fe2+浓度达到0.005 mol/L时,铁强化发芽糙米中有机铁含量达(317.38±11.23)mg/kg。文献[21]推荐每人每日铁的摄入量为5~20 mg,结合该研究,每人每日摄入20~50 g该研究中的发芽糙米,即可满足人体对铁元素的需求。因此本实验选择0.005 mol/L FeSO4作为最佳浓度。

如图3b所示,随着浸泡温度的升高,有机铁含量在35 ℃达到最高(375.26±10.48)mg/kg在30℃时,GABA达到最大值(344.33±5.76)mg/kg。浸泡温度的升高有利于分子运作,促使Fe2+随着水进入细胞,并随着发芽糙米发芽而转化为有机铁。随着浸泡温度的升高,糙米能够快速吸附充足的水分,激活谷氨酸脱羧酶使得GABA生成。但是过高的的温度使得糙米吸附大量水,破坏细胞组成,营养损失,使得发芽率降低。

如图3c所示,随着浸泡时间的延长,有机铁、GABA含量呈现先增加再减小的趋势。富铁发芽糙米中有机铁含量在浸泡时间8 h时达到最高,为(342.93±8.04)mg/kg,GABA含量在10 h达到最高,为(358.49±5.29)mg/kg。随着浸泡时间的延长,浸泡溶液中氧气不足导致厌氧型细菌滋生,抑制了糙米发芽[22-23]。充分的浸泡时间使得糙米吸收足够的水分使得谷氨酸脱羧酶被激活,促进GABA含量增加,过分浸泡后使得糙米种皮胀裂和营养物质丧失,进而导致发芽率降低,使得GABA含量的下降。

如图3d所示,随着培育温度的升高,有机铁、GABA含量呈现先增大后趋于平缓的趋势。在40 ℃时,有机铁含量达到最高(332.4±6.58)mg/kg,但是与培育温度为35 ℃时无显著性差异。这有可能是糙米发芽过程中参与有机铁转化的酶在30 ℃左右活性最佳。在35 ℃时GABA含量到达最高(304.43±6.22)mg/kg,与培育温度30 ℃无显著性差异。温度过高抑制了谷氨酸脱羧酶的活性,不利于GABA生成。

如图3e所示,随着培育时间的延长,有机铁含量增加幅度呈现先增大后减小的趋势,在60 h时有机铁含量达到最高(314.74±4.36)mg/kg。植物生长初期,植物对铁元素的吸收逐渐增加并转移至种子中,贮藏于铁蛋白以满足植物后期成长需求[20]。发芽糙米中GABA含量随着培育时间的延长呈现先增大再减小的趋势,在48 h时GABA含量达到最高(271.18±5.14)mg/kg,48 h之后开始降低,随着培育时间的延长,糙米内谷氨酸含量降低,GABA积累到一定程度,GABA转氨酶将GABA转化为琥珀酸半醛的速率增大,使GABA消耗速率大于GABA生成速率[24]

2.4 铁强化发芽糙米制备工艺条件优化

采用L9(34)正交试验方法,以浸泡温度、浸泡时间、培育温度、培育时间作为铁强化发芽糙米工艺条件的试验因素,考察以上4 个因素对铁强化发芽糙米中有机铁、GABA含量的影响,并进行极差分析,结果见表2。

由表2可以得出,两组较好的试验方案为A3B2C2D2或者A2B2C3D2。通过验证分析,得出实验方案A2B2C3D2,此条件下得到铁强化发芽糙米有机铁含量为(405.48±9.18)mg/kg,GABA含量为(508.04±13.5)mg/kg,相对于9 组试验结果处于较高水平。所以A2B2C3D2(浸泡温度30 ℃、浸泡时间10 h、培育温度32 ℃、培育时间44 h)为最佳铁强化发芽糙米生产工艺条件。

表2 正交试验设计与结果
Table 2 Results of orthogonal array experiments

试验号 A浸泡温度B浸泡时间C培育温度D培育时间有机铁含量/ (mg/kg)GABA含量/ (mg/kg)1 1 1 1 1  201.24  255.95 2 1 2 2 2  380.28  415.10 3 1 3 3 3  301.65  476.24 4 2 1 2 3  288.74  392.40 5 2 2 3 1  305.94  460.87 6 2 3 1 2  229.34  345.98 7 3 1 3 2  402.48  480.04 8 3 2 1 3  288.98  324.44 9 3 3 2 1  365.89  361.38有机铁含量k1 294.39  297.48  239.85  291.02 k2 274.67  325.06  344.97  337.36 k3 352.45  298.96  336.69  293.12 R  77.78  27.58  105.11  46.34最佳方案 A3B2C2D2GABA含量k1’ 382.43  376.13  308.79  359.40 k2’ 399.75  400.13  389.62  413.70 k3’ 388.62  394.53  472.38  397.69 R’ 17.32  24.0  163.59  54.30最佳方案 A2B2C3D2

2.5 铁强化发芽糙米中铁形态分析

如表3所示,铁强化发芽糙米中铁主要以机铁形式存在,少量以无机铁形式存在。其中有机铁以蛋白结合态存在,占总铁含量53.74%。在4 类蛋白中,谷蛋白是主要的铁结合蛋白,占总铁含量的16.31%,与多糖的结合的铁占总铁含量8.79%。通过对残余的粗淀粉和纤维进一步分析,发现其中还存在25.65%的铁,这可能是由于铁与胚乳中的大米蛋白结合,与大米淀粉紧密结合,简单提取无法分离,也可能是因为稻谷的发育器官和组织中存在大量的铁蛋白以储存可溶、无毒和生物体可以利用的铁[25-26]

表3 富铁发芽糙米中铁的分布及形态
Table 3 Iron species distribution in iron-enriched germinated brown rice

铁形态  铁含量/(mg/kg)  百分比/%总铁 457.89±12.67 100无机铁 32.73±1.68 7.14粗淀粉、纤维 117.45±8.89 25.65清蛋白 55.53±2.93 12.12球蛋白 56.22±6.20 12.27醇溶蛋白 59.58±8.33 13.01谷蛋白 74.72±6.27 16.31多糖 40.27±3.60 8.79损失铁 21.39±4.59 4.67

3 结 论

本研究表明,不同稻谷品种和铁营养剂对铁强化发芽糙米有机铁和GABA含量影响不同,筛选出有机铁、GABA富集能力较强的‘绿旱1号’作为实验原料,FeSO4作为培育营养剂。通过对铁强化发芽糙米的工艺条件优化得出最佳工艺条件为:FeSO4浓度0.005 mol/L、浸泡温度30 ℃、浸泡时间10 h、培育温度32 ℃、培育时间44 h。在此条件下获得的铁强化发芽糙米有机铁含量为(405.48±9.18)mg/kg,是普通发芽糙米的51 倍;GABA含量为(508.04±13.50)mg/kg,是普通发芽糙米的14 倍,其中铁主要与蛋白结合,占总铁的53.74%,蛋白结合铁更利于人体消化吸收。本研究为生产安全、营养、富铁食品提供理论依据,为补铁提供新的途径。

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Optimization by Orthogonal Array Design of Iron Biofortification of Germinated Brown Rice and Iron Speciation Analysis

MEI Chan, FANG Yong, PEI Fei, YANG Wenjian, WANG Hongpan, HU Qiuhui*
(Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance & Economics, Nanjing 210023, China)

Abstract: In order to determine the optimum conditions for producing iron-biofortified germinated brown rice, the effect of rice varieties, iron nutrition fortifiers, iron concentration, soaking temperature soaking time, germination temperature, and germination time on the contents of organic iron and γ-aminobutyric acid (GABA) were investigated. Results showed that the contents of organic iron and GABA were significantly increased in the “Lühan No. 1” cultivar of germinated brown rice after being treated with 0.005 mol/L FeSO4. The optimal conditions for iron biofortification of brown rice during germination were obtained as follows: iron concentration, 0.005 mol/L; soaking temperature, 30 ℃; soaking time, 10 h; germination temperature, 32 ℃; and germination time, 44 h. Under these conditions, the content of organic iron was (405.48 ± 9.18) mg/kg, a 51-fold increase over that of ordinary germinated brown rice. The majority of organic iron in the germinated brown rice was bound to proteins, accounting for 53.74% of the total iron. The GABA content was (508.04 ± 13.50) mg/kg, which was 14 times higher than that of ordinary germinated brown rice.

Key words: brown rice; germination; organic iron; γ-aminobutyric acid

中图分类号:TS213

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)06-0052-06引文格式:

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606009

*通信作者:胡秋辉(1962—),男,教授,博士,研究方向为食品与农产品加工。E-mail:qiuhuihu@njue.edu.cn

作者简介:梅婵(1991—),女,硕士研究生,研究方向为食品安全与营养。E-mail:690057094@qq.com

基金项目:公益性行业(粮食)科研专项(201313011);江苏省教育厅青蓝工程项目;江苏高校优势学科建设工程资助项目

收稿日期:2015-09-27