刘淑敏，张兴龙，邵兴锋*，许 凤，王鸿飞
（宁波大学食品科学与工程系，浙江 宁波 315211）
摘 要：以“宁海白”枇杷为实验对象，研究不同质量分数裂褶菌多糖粗提物、4 种常用褐变抑制剂（草酸、柠檬酸、VC、L-半胱氨酸）对抑制枇杷果汁褐变的影响。结果发现，5 种褐变抑制剂的作用效果强烈顺序为：L-半胱氨酸＞草酸＞VC＞柠檬酸＞裂褶菌多糖，其中裂褶菌多糖质量分数在0.8%时，褐变抑制率达到80%以上。基于果汁风味考虑，选择裂褶菌多糖、VC、L-半胱氨酸一起作为抑制剂组合，并通过响应面优化试验得出最佳组合为：裂褶菌多糖质量分数1%、VC质量分数0.025%、L-半胱氨酸质量分数0.004%。经回归分析和验证实验，得到的果汁褐变抑制率为98.04%，与理论模型预测值99.22%接近，响应模型可靠。优化处理后的果汁可溶性固形物、VC和总酚含量都得以提高。可见，裂褶菌多糖可以与其他抑制剂复合使用，运用于枇杷果汁褐变防控。
关键词：枇杷果汁；褐变；裂褶菌多糖；优化
刘淑敏, 张兴龙, 邵兴锋, 等. 裂褶菌多糖抑制枇杷果汁褐变的工艺优化[J]. 食品科学, 2016, 37(6): 58-63. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201606010. http://www.spkx.net.cn
LIU Shumin, ZHANG Xinglong, SHAO Xingfeng, et al. Optimization of browning inhibition of loquat juice by schizophyllan[J]. Food Science, 2016, 37(6): 58-63. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606010. http://www.spkx.net.cn
枇杷是我国南方的一种特产水果，不仅酸甜适口，营养丰富，且具有润肺、止咳、和胃、清热等作用，深受消费者喜爱。“宁海白”枇杷作为新的品种，品质优良，皮薄，果肉呈白色，含糖量高、风味浓郁，市场价值较高[1]。但是，该种枇杷采后货架期短、极易发生腐烂，亟需发展其加工产业。用枇杷制作的果汁风味独特，营养丰富而全面，是理想的滋补保健品。酶促褐变是果汁加工中遇到的主要障碍之一，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、过氧化物酶（peroxidase，POD）能非常迅速地将酚类物质氧化为褐色物质，造成果汁感官质量下降及营养物质损失[2]。目前，实验研究常采用物理、化学和生物等方法来抑制果汁的酶促褐变。其中最有效的抑制方法是添加褐变抑制剂。最早使用的褐变抑制剂是亚硫酸盐，但由于亚硫酸盐应用于果汁不具有安全性，目前已被限制使用。此外，VC、L-半胱氨酸等也是经常使用的褐变抑制剂。如詹嘉红[3]研究了pH值、还原剂（VC、L-半胱氨酸）、有机酸（柠檬酸、草酸）对枇杷鲜果中PPO活性的影响，结果表明，这几种因素可明显抑制PPO活性，且其最适pH值为6.3。枇杷果肉果冻生产中，在护色剂乙二胺四乙酸二钠添加量0.02%、柠檬酸添加量0.01%、异VC-Na添加量0.03%时，枇杷果肉的护色效果最好，基本保持与鲜果一样的色泽及亮度[4]。何志刚等[5]以枇杷为原料制备枇杷清汁，加入0.3～0.5 g/kg的VC可有效抑制枇杷浆汁的氧化褐变。林剑阳[6]也探讨了抗氧化剂对枇杷果汁护色的影响，通过感官评定证明添加0.1% VC＋0.005%焦亚硫酸钠护色效果最佳。近年来，探索生物褐变抑制剂成为该领域的研究热点。如β-环糊精可将酚类物质等底物包埋，防止果蔬汁中褐变发生，且可以与VC共同作用强化VC的防褐变作用[7]。le Bourvellec等[8]发现天然花青素及其氧化产物咖啡酰奎宁酸对PPO也有抑制作用，且其抑制作用随质量分数的增加而增加。同时，Billaud等[9]发现葡萄糖、果糖焦糖化的反应产物和L-半胱氨酸、葡萄糖美拉德反应产物可以抑制PPO的活性，从而抑制酶促褐变；Chisari等[10]则发现葡萄糖和果糖对鲜切冬瓜的PPO和POD有较好的抑制作用，从而有效抑制褐变。
裂褶菌多糖，又称裂褶菌素，是一种水溶性的β-D-葡聚糖，具有抑制肿瘤、抗菌消炎、调节免疫功能、抗辐射等功能[11]。其生理功能广泛受到关注，但将该多糖应用于果蔬汁褐变防控研究中还未见相关报道。在本实验中，选取裂褶菌多糖提取物作为天然褐变抑制剂，并与传统褐变抑制剂（柠檬酸、草酸、VC、L-半胱氨酸）协同作用于“宁海白”枇杷果汁中，期望能够探索出新型的果蔬汁褐变抑制方法，为以后的生产应用提供技术条件和理论依据。
1.1 材料与试剂
“宁海白”枇杷（Eriobotrya japonica Lindl. cv.）：采摘自浙江省宁海县一市镇，挑选成熟、新鲜、无损伤、无害虫的果实用于实验。将枇杷剥皮去核，果肉立即放入匀浆机12 000 r/min组织捣碎10 s得到枇杷果浆，再4 000 r/min离心10 min得上清液为原汁，备用。
裂褶菌：产自于云南省。柠檬酸、草酸、L-半胱氨酸、VC均为食品级。
1.2 仪器与设备
HR2003型匀浆机 飞利浦家庭电器有限公司；JY6002型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；TDZ4-WS台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV1600分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；恒温恒湿培养箱 宁波东南仪器有限公司；循环水真空泵英峪予华仪器厂；冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；自动部分收集器、紫外检测器、恒流泵 上海沪西分析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 褐变抑制率测定
褐变抑制率的测定采用分光光度计法。以蒸馏水为参比，在波长420 nm处测定其吸光度A0，然后取40 mL果汁倒入离心管，置于4 ℃条件下，24 h后再测其吸光度A24。
1.3.2 总可溶性固形物（total soluble solids，TSS）含量测定
TSS含量采用手持糖量仪直接测定。
1.3.3 VC含量测定
采用钼蓝比色法[12]，取2 mL果汁加入到试管中，随后依次加入草酸-乙二胺四乙酸溶液3 mL，偏磷酸乙酸0.5 mL，5%硫酸溶液1.0 mL及5%钼酸铵溶液2 mL；加水定容到20 mL，混匀后于30 ℃水浴放置10 min。以空白管调零，测定760 nm波长处吸光度。配制质量分数为0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的VC溶液，按上述方法测定吸光度，以VC含量作横坐标，绘制标准曲线。
1.3.4 总酚含量测定
参考Sato等[13]的方法。取0.4 mL果汁加入0.4 mL福林-酚试剂充分振荡后静置3 min，再加入0.04 mL饱和Na2CO3溶液，经充分振荡后静置于暗室1 h后，测定700 nm波长处吸光度。配制不同质量分数没食子酸溶液，按上述方法测定A700 nm，并绘制标准曲线。
1.3.5 裂褶菌多糖提取
参考文献[14-15]的方法，裂褶菌粉末放到烧杯中，按照料液比1∶30（g/mL）加入蒸馏水。接着100 ℃水浴30 min，取出，加入酒精静置24 h，再次水浴加热，去除酒精，依次加入无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤。所得沉淀物干燥即得裂褶菌粗糖，裂褶菌多糖纯化参考周林等([16])的方法，再采用DEAE cellulose-52离子柱层析分离纯化，获得裂褶菌多糖。
1.3.6 单因素试验
新鲜的“宁海白”枇杷，经剥皮、去核、打浆、离心后，分别加入一定量的褐变抑制剂，使其质量分数达到一定值，并测定其吸光度。VC的质量分数为0.005%、0.010%、0.015%、0.020%、0.025%、0.030%；草酸质量分数为0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.010%、0.012%；L-半胱氨酸质量分数为0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%；柠檬酸质量分数为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%；裂褶菌多糖质量分数为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%。加入褐变抑制剂后的果汁在4 ℃条件下放置24 h后，再测定其吸光度。
1.3.7 响应面试验设计
根据单因素试验结果，选择裂褶菌多糖、L-半胱氨酸和VC质量分数3 个因素与褐变抑制率进行响应面设计，采用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行回归分析，优化枇杷果汁的抑制褐变工艺。在分析得到的最佳工艺条件下，做3 组平行实验（优化组）验证响应面分析的可靠性，以不加抑制剂的果汁作为对照组，同时测定TSS、VC、总酚含量。Box-Behnken试验各因素水平见表1。
表1 枇杷果汁护色工艺Box-Behnken设计试验因素与水平
Table 1 Variables and their coded values used in the Box-Behnken design for optimizing browning inhibition of loquat juice
1.4 数据统计与分析
所有实验重复3 次，采用Excel处理数据，计算标准偏差。数据图片用Origin Pro 8.1绘制。显著性差异用SPSS分析（P=0.05）。
2.1 单因素试验结果
图1 不同抑制剂对枇杷果汁的褐变抑制效果
Fig.1 Inhibitory effects of different inhibitors on browning of loquat juice
A. VC；B. L-半胱氨酸；C.草酸；D.柠檬酸；E.裂褶菌多糖。
2.1.1 VC及L-半胱氨酸对枇杷果汁褐变的影响
从图1A、B可以看出，在VC质量分数0.020%以内，其褐变抑制率随着VC质量分数的增加而明显上升；直到VC质量分数为0.020%之后，抑制率达到90%左右。继续增加其质量分数并没有显著提高抑制效果（P＞0.05），甚至有缓慢下降趋势。因此0.020%的VC对枇杷果汁的褐变抑制作用较好。而L-半胱氨酸对果汁褐变抑制作用与VC对果汁的褐变抑制作用趋势相似，0.003%的L-半胱氨酸对枇杷果汁的褐变抑制作用较好。继续增加L-半胱氨酸的质量分数也不能显著提高抑制效果（P＞0.05）。
VC是食品加工中重要的食品添加剂，其主要作用是将褐色物质醌还原为无色的酚类物质，并且阻止醌类物质进一步反应形成褐色物质，但添加VC的质量分数对果汁的褐变影响很大，添加量少，抑制效果不佳；添加量大，在果汁存放过程中会发生非酶褐变[17]。L-半胱氨酸抑制果汁褐变被认为是其直接与PPO活性中心的铜离子结合而抑制其活性，也有人认为酶促反应的产物的醌类物质可能被L-半胱氨酸还原成无色化合物。可见，L-半胱氨酸抑制果汁褐变是多种原因作用的结果。在本研究中，相同质量分数的L-半胱氨酸对枇杷果汁褐变的抑制效果好于VC。
2.1.2 草酸及柠檬酸对枇杷果汁褐变的影响
从图1C、D可以看出，草酸及柠檬酸对果汁的褐变抑制率随着质量分数的上升而上升，当柠檬酸质量分数达到0.6%时，果汁褐变抑制率接近100%，几乎完全抑制果汁褐变；草酸质量分数达到0.012%时，果汁褐变抑制率为80%，也能很好地起到抑制果汁褐变的作用。柠檬酸、草酸主要是通过螯合PPO和POD的金属离子来抑制酶活，另一方面草酸、柠檬酸是酸性的，可以降低反应体系的pH值，使PPO远离最适pH值范围，从而抑制酶的活性，但是添加草酸或柠檬酸后，果汁会有酸涩口感，影响风味[18]。本研究也发现这两种抑制剂对“宁海白”枇杷果汁褐变都能起到较好的抑制效果，但影响果汁口感，因此不建议使用。
2.1.3 裂褶菌多糖对枇杷果汁褐变的影响
由图1E可以看出，在裂褶菌多糖提取物质量分数0.2%～0.8%之间，随着多糖提取物质量分数的上升，褐变抑制率上升；但是当多糖质量分数达到0.8%后，褐变抑制率随着多糖质量分数的上升而增加缓慢，且作用效果不显著（P＞0.05）。杜贞等[19]研究发现不同质量分数的马齿苋多糖提取物对翅果油树愈伤组织的褐变有一定缓解作用，在0.19 g/L的多糖添加物质量浓度下，子叶愈伤组织产生生物量最多，抗褐变效果与VC的作用相似，推测其褐变机制是多糖中弱酸性物质与酚类的羟基作用形成酯类，从而减少PPO作用底物的含量。此外，很多研究表明，一些真菌子实体多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性、螯合Fe2＋的能力等抗氧化作用。如Chen 等[20]从香菇的子实体中分离出3 种糖，测定了它们清除超氧阴离子自由基、羟自由基的能力，以及对Fe2＋的螯合能力，结果证实其中一种糖有较强的体外抗氧化活性。从林芝子实体中分离出的3种多糖、双孢菇多糖也被证实具有较强的自由基清除和螯合能力，表明其具有良好的体外抗氧化活性[21-22]。Gao等[23]也发现红菇胞外多糖在体外清除自由基及还原力实验中具有很强的抗氧化能力。裂褶菌多糖对果汁明显的褐变抑制作用可能也是由于其具有较强的抗氧化作用，抑制了果汁的褐变发生。
裂褶菌多糖除了具有上述抗氧化、抗癌、提高免疫力等生理活性外，它极易溶于水、黏度大、乳化能力和乳化稳定性也很强[24]。此外，它是经过微生物发酵用物理方法提取的多糖，无毒、无副作用。所以在枇杷果汁中添加裂褶菌多糖和VC、L-半胱氨酸作为复合抑制剂进行优化试验，且3 种抑制剂都是人体所需的营养物质，将这些抑制剂应用到果汁生产中，不仅能抑制褐变，还能增加果汁营养物质含量。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 响应面试验设计及结果
在单因素试验的基础上，选择裂褶菌多糖提取物和L-半胱氨酸、VC作为复合抑制剂，根据Box-Behnken试验设计原理进行响应面试验。结果见表2，并用Design-Expert 8.0.6对试验结果进行分析。
表2 Box-Behnken设计方案及结果
Table 2 Box-Behnken design with response values of browning inhibition
2.2.2 模型方差分析及显著性检验
对表2中以褐变抑制率为响应值，通过Design-Expert 8.0.6软件对响应值与各因素的编码值进行回归拟合后，得到如下回归方程：
Y=82.92＋2.73A＋6.80B＋5.03C＋0.092AB－2.63AC＋0.54BC＋0.32A2－1.99B2－4.24C2
从表3可以看出，所得的Y回归方程高度显著（P＜0.001），且失拟检验不显著（P=0.211 9），说明此回归模型很理想，用方程Y拟合3 个因素与褐变抑制率之间的关系可行。模型的R2=0.951 2，说明该模型拟合度较好[25]。RSN=14.304大于4，说明试验精度较高。综合以上分析得知：该模型与实际情况拟合很好，可用于预测褐变抑制率的变化情况。
表3 回归方程系数显著性检验表
Table 3 Significance test of regression model equation
注：**.差异极显著（P＜0.01）；*.差异显著（P＜0.05）。
从3个因素（A、B、C）对褐变抑制率的影响来看，一次项A（L-半胱氨酸质量分数）、B（VC质量分数）和C（裂褶菌多糖质量分数）对褐变抑制率均有显著的影响；交互项中的AB、BC、AC对结果没显著影响，影响的顺序依次是AC＞BC＞AB；二次项C2对结果有显著的影响，A2和B2无显著影响。
响应面等高图直观地反映出各因素交互作用对褐变抑制率的影响，椭圆趋势表示两因素交互作用显著，圆形及其他表示两因素交互作用不显著。从图1～3也可以看出，L-半胱氨酸、VC及裂褶菌多糖质量分数两两之间都没有交互作用。
当L-半胱氨酸质量分数一定时，果汁的褐变抑制率随着VC质量分数的增加而明显增加（图2）；而当VC质量分数一定时，果汁褐变抑制率也随着L-半胱氨酸质量分数增加而增加，但增加不明显。由图3可知，当L-半胱氨酸质量分数一定时，果汁的褐变抑制率随着多糖质量分数的增加变化不明显；当多糖质量分数一定时，果汁褐变抑制率随着L-半胱氨酸质量分数增加而缓慢增加。
当裂褶菌多糖质量分数一定时，果汁褐变抑制率随着VC质量分数增加而明显增加；当VC质量分数一定时，果汁褐变抑制率随着多糖质量分数增加而增大，但趋势不明显（图4）。
图2 L-半胱氨酸和VC质量分数对果汁褐变抑制率影响的响应面和等高线图
Fig.2 Response surface and contour plots for inhibitory rate as a function of L-cystine and ascorbic acid
图3 L-半胱氨酸和裂褶菌多糖质量分数对果汁褐变抑制率影响的响应面和等高线和等高线图
Fig.3 Response surface and contour plots for inhibitory rate as a function of L-cystine and schizophyllan
图4 VC和裂褶菌多糖质量分数对果汁褐变抑制率影响的响应面和等高线图
Fig.4 Response surface inhibitory rate for inhibitory rate as a function of ascorbic acid and schizophyllan
2.2.3 最佳工艺参数及验证
通过计算分析，得到的最佳抑制剂组合为：L-半胱氨酸质量分数0.004%、VC质量分数0.025%、裂褶菌多糖质量分数1%。在此条件下，果汁褐变抑制率理论值99.22%。为了检验该响应面优化方法的可靠性，采用上述最适宜抑制剂组合进行验证实验，得出的褐变抑制率为98.04%，与预测值接近。并且优化实验所得果汁的TSS、VC及总酚含量都高于对照组（表4）。其中TSS含量差异显著（P＜0.05），这是添加了裂褶菌多糖的缘故。可见优化处理不仅抑制褐变，还能提高果汁品质。
表4 优化组与对照组部分营养物质含量
Table 4 The contents of some nutrients in optimized and control groups
注：同列肩标相同字母表示差异不显著（P＞0.05）；不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
本实验结果显示，5 种褐变抑制剂的作用效果大小顺序为L-半胱氨酸＞草酸＞VC＞柠檬酸＞裂褶菌多糖，其中裂褶菌多糖质量分数在0.8%时，褐变抑制率达到80%以上。
从安全、抑制效果、果汁风味考虑，筛选出裂褶菌多糖、VC、L-半胱氨酸。采用响应面试验对这3 种抑制剂组合进行优化，获得的最佳工艺参数为L-半胱氨酸质量分数0.004%、VC质量分数0.025%、裂褶菌多糖质量分数1%。
经回归分析和验证实验，得出优化后的果汁褐变抑制率为98.04%，与理论模型99.22%接近，且优化后处理的果汁品质也有所提高。
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LIU Shumin, ZHANG Xinglong, SHAO Xingfeng*, XU Feng, WANG Hongfei
(Department of Food Science and Engineering, Ningbo University, Ningbo 315211, China)
Abstract: Development of natural and safe browning inhibitors is a hot spot for the prevention of fruit juice browning. In this study, loquat juice from the cultivar “Ninghaibai” was used to study the effects of different concentrations of crude schizophyllan combined with four common browning inhibitors (oxalic acid, citric acid, VC, and L-cysteine) on prevention of loquat juice from browning. It was indicated that the order of the efficacy of five browning inhibitors was as follows: L-cysteine > oxalic acid > VC > citric acid > schizophyllan. The percent inhibition of browning by schizophyllan at a concentration of 0.8% was over 80%. Based on fruit juice flavor, we chose the inhibitor combination consisting of schizophyllan, ascorbic acid and L-cysteine. The optimum inhibitor combination, i.e. 1% schizophyllan, 0.025% ascorbic acid and 0.004% L-cysteine, was obtained using response surface methodology. The results of verification showed that the percent inhibition of juice browning by the optimized combination was 98.04%, approaching to the predicted value of 99.22%, suggesting that the response surface model was reliable. The contents of total soluble solids (TSS), ascorbic acid and total phenol in loquat juice were increased after treatment with the inhibitor combination. These results showed that schizophyllan can be used in combination with other inhibitors to prevent loquat juice browning.
Key words: loquat juice; browning; schizophyllan; optimization
中图分类号：TS255.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）06-0058-06引文格式：
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606010 [24] 冀颐之. 裂褶菌胞外多糖的研究[D]. 天津: 天津科技大学, 2003. 10.7666/d.y543541.
*通信作者：邵兴锋（1980—），男，副教授，博士，研究方向为农产品贮藏与加工。E-mail：shaoxingfeng@nbu.edu.cn
作者简介：刘淑敏（1989—），女，硕士研究生，研究方向为农产品贮藏与加工。E-mail：275002187@qq.com
基金项目：浙江省自然科学基金项目（R15C20002）；浙江省科技厅公益性应用研究项目（2013C32094）；宁波市农业和社会发展攻关项目（2014C50084）
收稿日期：2015-06-10