大白桩菇多糖的结构鉴定及清除自由基活性

包 瑛1,马 岳1,李雅双1,2,张云琴1,仵 缘1,2,刘春兰1,2,*
(1.中央民族大学生命与环境科学学院,北京 100081;2.北京市食品环境与健康工程技术研究中心,北京 100081)

摘 要:利用水提醇沉法提取大白桩菇粗多糖,用酸性乙醇分级、SepharoseCL-4B以及Sephadex G-100柱层析分离纯化得到大白桩菇多糖(DBZG(4-b))。采用高效液相色谱法检测DBZG(4-b)均一性及相对分子质量。经气相色谱、纸层析、红外光谱、甲基化、气相色谱-质谱、核磁共振方法解析DBZG(4-b)的结构。结果显示,DBZG(4-b)为均一性多糖,相对分子质量约为6 864;DBZG(4-b)为多分支结构多糖,主链由Glc和Gal构成,均以1→6糖苷键连接,Glc在3位上有分支,Gal在4位上有分支;支链由Ara、Glc、Gal构成,其中Ara以1→3连接,Glc以1→3连接,Gal以1→4连接,Ara、Xyl、Rha、Man、Glc、Gal都有一部分构成分子的末端残基。清除·OH与1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基实验表明,DBZG(4-b)具有良好的清除自由基能力。

关键词:大白桩菇;多糖;分离纯化;结构;自由基

包瑛, 马岳, 李雅双, 等. 大白桩菇多糖的结构鉴定及清除自由基活性[J]. 食品科学, 2016, 37(6): 71-76. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201606012. http://www.spkx.net.cn

BAO Ying, MA Yue, LI Yashuang, et al. Structure identification and free radical scavenging activity of polysaccharide from fruit bodies of Leucopaxillus giganteus[J]. Food Science, 2016, 37(6): 71-76. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606012. http://www.spkx.net.cn

大白桩菇(Leucopaxillus giganteus),又名大青蘑、雷蘑、青腿子或竹菇,隶属伞菌目,白蘑科,桩菇属,子实体大型。夏秋季在草原上单生或群生,常形成蘑菇圈,有时生林中草地上,主要产自我国内蒙古等地[1]。大白桩菇不仅可以食用,还具有多种药用价值,可治小儿麻疹、烦燥不安等[2]。研究显示,大白桩菇具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌等多种作用的多种生物活性物质[3],能产生杯伞素,有抗肺结核病的作用以及促进体外人宫颈癌细胞的细胞凋亡[2]。对于大白桩菇化学成分的研究,刘坤等[3]从大白桩菇乙酸乙酯部位分离鉴定出甾体、吡啶甲酸及生物碱等。有关大白桩菇多糖的报道较少。

多糖是食用菌体内的主要活性成分之一[4]。近年来,有关真菌多糖的研究已成为科研领域的热点之一。阮家耀等[5]对杏鲍菇子实体多糖进行结构研究,鉴定其主要以1,6-葡萄糖构成主链。黄智璇等[6]进行灵芝多糖的小鼠灌胃实验表明,400 mg/kg灵芝多糖剂量下,降血糖作用明显。多糖的结构是其生物活性的基础,现如今已有不少研究结果表明,糖类作为信息分子在受精、发育分化、神经系统的维持等方面起着重要作用,自身免疫疾病、病原体感染和癌细胞的异常增殖等生物学过程都有糖类的介导,在这一系列生物过程中,最重要的生物活性因子便是糖链[7-8]

本实验以大白桩菇为原材料,分离纯化出一种均一多糖,用酸性乙醇分级、SepharoseCL-4B以及Sephadex G-100柱层析分离纯化得到大白桩菇多糖(DBZG4-b)。采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法检测DBZG4-b均一性及相对分子质量。经气相色谱、纸层析、红外光谱、甲基化、气相色谱-质谱、核磁共振方法解析DBZG4-b的结构。此外,对其清除自由基活性进行初步探索,旨在为了解和建立真菌多糖作用机理提供依据;为其新药的挖掘、大型真菌资源的合理开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白蘑科桩菇属的大白桩菇(Leucopaxillus giganteus),购自内蒙古自治区克什克腾旗,由河北经贸大学张香美副教授鉴定为大白桩菇。

乙醇、碳酸钡、乙酸酐、水杨酸(均为分析纯)、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、半乳醛酸糖、甘露糖、半乳糖 国药集团化学试剂有限公司;浓硫酸、邻苯二甲酸、氯化钙、氨水、硼酸、盐酸(均为分析纯) 北京化工厂;硼氢化钾、碘化钾、五氧化二磷、二氯甲烷、冰乙酸(均为分析纯)北京化学试剂公司;Sephadex G-100、SepharoseCL-4B、Dextran标准品(分析纯,相对分子质量5000、10000、20 000、40 000、70 000、100 000、5 000 000)美国GE公司;透析袋(截留分子质量3500 D)韩国Biosharp公司;蛋白酶 德国默克公司。

1.2 仪器与设备

BS-100A自动部分收集器 上海青浦滬西仪器厂;Nicolet Magna-IR750傅里叶变换红外光谱仪 日本日立公司;Epoch紫外-可见分光光度计 基因有限公司;Benchmark plus酶标仪 美国伯乐公司;Avance 600 MHz核磁共振谱仪 德国Bruker公司;GC-2014型毛细管气相色谱仪(配有NHA-300氮氢空一体机) 日本岛津公司;QQQ7000气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司;HPLC仪(配有RI2041视差折光检测器) 德国Knauer公司。

1.3 方法

1.3.1 大白桩菇水溶性多糖的提取

取乙醇回流脱脂后的大白桩菇干燥粉末,按料液比1∶20(g/mL)加蒸馏水,置于烧杯中,放入80 ℃水浴锅中热水浸提2 h,抽滤。将滤液浓缩至1/3体积,离心,4 倍体积95%乙醇溶液醇沉,真空干燥,得大白桩菇粗多糖(DBZGC[9]

1.3.2 大白桩菇水溶性多糖DBZG4-b的制备

配制质量浓度2 g/100mL的DBZGC溶液,经脱色,链酶蛋白酶和Sevag法联合脱蛋白[10],pH 2.0酸性乙醇分级[11],得级分DBZG4,30 mg DBZG4溶于3 mL超纯水,经SepharoseCL-4B(2.6 cm×70 cm)柱层析,超纯水洗脱,流速0.75 mL/min,每试管2 mL溶液,苯酚-硫酸法[9]显色,洗脱液收集,浓缩、透析、醇沉、真空干燥得DBZG4-a。30 mg DBZG4-a溶于3 mL 0.1 mol/L NaCl溶液,经SephadexG-100(2.6 cm×70 cm)纯化,0.1 mol/L NaCl洗脱,流速1 mL/min,每试管2 mL溶液溶液。苯酚-硫酸法显色,洗脱液收集,浓缩、透析、醇沉、干燥得DBZG4-b

1.3.3 DBZG4-b纯度的鉴定及相对分子质量的测定

将标准葡聚糖(相对分子质量500 000、100 000、70 000、40 000、20 000、10 000、5 000)及待测纯化大白桩菇多糖进行HPLC检测。以标准葡聚糖保留时间为横坐标,相对分子质量对数值为纵坐标,得标准曲线[12]。计算DBZG4-b的相对分子质量。

分别用50%的甲醇和0.1 mol/L NaNO3溶液(所用溶液均过滤膜,超声除气泡)清洗系统30 min。装柱,待基线平稳后,用流动相溶解合适浓度的标准品和待测样品。

条件:OHpak SB-805HQ series凝胶柱;柱温35℃;流速0.8 mL/min;进样量20 μL;流动相0.1 mol/L NaNO3溶液。

1.3.4 大白桩菇纯化多糖DBZG4-b的单糖组成

纸层析(paper chromatography,PC):DBZG4-b2 mg,硫酸100 ℃条件下水解8 h,BaCO3中和,过滤,浓缩,点样于新华滤纸(15 cm×35 cm),进行PC。在相同条件下对标准糖样进行PC[13]

展开剂:正丁醇、乙酸和水的体积比为4∶1∶5,混合后待两相分离后,取上层正丁醇液。

显色剂:100 mL正丁醇饱和水溶液中,加入邻苯二甲酸0.93 g,溶解,再加入苯胺1.66 g。

气相色谱(gas chromatography,GC)法:取标准品与大白桩菇纯化多糖样品各1 mg进行水解、还原、乙酰化后进行GC分析,与标准品谱图对比分析得其单糖组成及其物质的量比[14]

GC条件:Rtx-225毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);升温程序:100℃开始,以5 ℃/min升至200 ℃,保留40 min;载气(H2)线速:48 cm/s;进样量:1 μL;分流比:10∶1;检测器:火焰离子化检测器。1.3.5 结构分析

1.3.5.1 红外光谱分析

1 mg DBZG4-b,加入KBr 100 mg,混合研磨成极细粉末,压片,置于红外光谱仪4 000~400 cm-1条件下进行扫描[15]。扫描次数:64 次;扫描速率:20 kHz。

1.3.5.2 甲基化及其产物的气相色谱-质谱(GC-mass spectrometry,GC-MS)分析

甲基化:取干燥的DBZG4-b5 mg溶解于二甲基亚砜溶液(60 ℃减压蒸馏)中。加入NaOH-DMSO及碘甲烷各2 mL,3 次平行重复,红外色谱检测DBZG4-b的甲基化产物无羟基峰,说明DBZG4-b甲基化完全[16]

甲基化的糖样残渣,进行水解、还原及乙酰化反应,得可气化衍生物,待GC-MS分析。

GC条件:DB-5MS石英毛细管(30 m×0.25 mm,液膜厚度0.25 μm);载气(He)线速率41 cm/s;升温程序:120 ℃开始,以5 ℃/min升至250 ℃,保留10 min。检测器温度250 ℃;进样器温度250 ℃。

MS条件:电子电离源;离子源温度250 ℃;电子能量70 eV。

1.3.5.3 核磁共振谱(1H-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)分析

称取10 mg多糖DBZG4-b,溶于0.5 mL重水,在600 MHz核磁共振谱仪上检测,5 mm BBI型PROBHD条件下测定。1H - N M R,累加次数1 6 次,频率17 985.611 Hz。

1.3.6 大白桩菇多糖抗氧化活性的测定

1.3.6.1 清除·OH活性的测定

在96 孔板中依次加入9 mmol/L的水杨酸、8.8 mmol/L的H2O2、9 mmol/L FeSO4溶液各15 μL,不同质量浓度的大白桩菇多糖溶液各75 μL、37 ℃反应30 min,每个样品平行测3 次,并以水做空白对照。后用酶标仪于510 nm波长处测定各自的吸光度A[13,17]。按照上述方法,以VC(抗坏血酸)作为对照组进行测定。·OH清除率计算见公式(1):

式中:Ai为样液反应的吸光度;Ao为空白组的吸光度。

1.3.6.2 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基活性的测定

用超纯水配制不同质量浓度的DBZG4-b溶液,96 孔微量滴定板中加入不同质量浓度糖溶液50 μL(3个平行重复),各加120 μmol/L DPPH溶液50 μL,避光反应30 min后,在517 nm波长处测吸光度为As[18-19],每个样品平行测3 次。按照上述方法,以VC(抗坏血酸)作为阳性对照进行测定。DPPH自由基清除率计算见公式(2):

式中:As为DPPH与样液反应的吸光度;Ar为样品空白(50 μL样品+50 μL 95%乙醇溶液)的吸光度;Ao为未加样液的DPPH溶液(50 μL DPPH+50 μL 95%乙醇溶液)吸光度。

2 结果与分析

2.1 大白桩菇水溶性多糖的提取及制备

取95%乙醇溶液回流脱脂后的大白桩菇,经水提醇沉得水溶性粗多糖(DBZGC),得率为7.52%。经脱色、脱蛋白、透析所得的大白桩菇初步纯化多糖,进行酸性乙醇分级得DBZG4,得率为8.57%。

DBZG4经SepharoseCl-4B(2.6 cm×70 cm)柱层析,超纯水洗脱,收集,醇沉,干燥得DBZG4-a。DBZG4-a经SephadexG-100(2.6 cm×70 cm)柱层析,0.1 mol/L NaCl溶液洗脱,收集醇沉,干燥得白色粉末状多糖DBZG4-b

2.2 大白桩菇水溶性多糖的纯度鉴定及相对分子质量

多糖纯度标准不能用通常化合物的纯度标准来衡量,因为即使多糖纯品其微观也并不均一,多糖纯品实质上是指一定相对分子质量范围的均一组分。测定多糖纯度的方法有功能团分析、比旋度、水解后糖组分分析、PC和HPLC、超离心分析法等。

图1 DBZG4-b的HPLC
Fig.1 HPLC of DBZG4-b

由图1可知,大白桩菇水溶性多糖DBZG4-b经HPLC检测,呈现单一狭窄对称峰,说明DBZG4-b是分子质量与极性都均一的多糖。

以不同相对分子质量标准葡聚糖的HPLC保留时间为横坐标,相对分子质量的对数值为纵坐标得标准曲线线性方程:y=-1.301 4x+19.4,R2=0.994 6。DBZG4-b保留时间为11.959 min,代入方程,计算得DBZG4-b相对分子质量为6 864。

2.3 大白桩菇纯化多糖DBZG4-b单糖组成分析

图2 大白桩菇纯化多糖DBZG4-b的PC(A)和GC(B)图
Fig.2 Paper chromatography and GC chromatogram of DBZG4-b

大白桩菇纯化多糖DBZG4-b进行PC(图2A)与GC(图2B)检测。根据与标准品比较分析得出DBZG4-b单糖组成为:鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal),物质的量比为1.00∶1.81∶0.38∶0.82∶2.89∶2.74。说明DBZG4-b是由6 种单糖残基构成的中性杂多糖,其中Glc和Gal占较大比例。

2.4 大白桩菇纯化多糖DBZG4-b的结构分析

2.4.1 DBZG4-b的红外光谱分析

图3 DBZG4-b的红外光谱
Fig.3 IR spectrum of DBZG

DBZG4-b用红外光谱仪在4 000~400 cm-1范围扫描,结果如图3所示。4 000~1 250 cm-1特征谱带中,3 408.60 cm-1处是—OH伸缩振动吸收峰,2 925.13 cm-1处是次甲基C—H伸缩振动吸收峰,这是糖类特征吸收峰[20];1 632.58 cm-1处吸收峰为—OH弯曲振动吸收峰,1 409.26 cm-1是C—H变角振动吸收峰;1 250~400 cm-1指纹谱带中,1 241.38 cm-1是伯醇β-OH伸缩振动吸收峰;1 200~1 000 cm-1的吸收峰表明含有吡喃糖环,DBZG4-b在1 075.21 cm-1处有吸收峰[21],说明DBZG4-b可能含有吡喃环;910.00 cm-1左右是β-型糖苷键特征吸收峰,800.00 cm-1左右是α-型糖苷键特征吸收峰[22],说明DBZG4-b可能含有α-型和β-型糖苷键。

2.4.2 DBZG4-b的甲基化及其产物的GC-MS分析

图4 甲基化DBZG4-b的 GC图
Fig.4 GC chromatogram of methylation products of DBZG4-b

表1 DBZG4-b甲基化产物GC-MS结果分析
Table 1 Methylation and GC-MS analysis of DBZG4-b

峰号  甲基化单糖  连接位点  物质的量比  主要离子碎片(m/z)1  2,3,4-Ara 1→ 0.98 43、45、75、88、101、144 2  2,3,4-Xyl 1→ 0.37 43、45、101、117、129、161 3  2,3,4-Rha 1→ 1.00 43、45、71、88、101、117、127 4  2,4-Ara 1→3 0.68 43、45、71、88、101、115 5  2,3,4,6-Man  1→ 0.89 43、45、58、73、87、101、117、161 6  2,3,4,6-Glc 1→ 0.02 43、45、72、89、101、115、117、131、161、175 7  2,3,4,6-Gal 1→ 0.11 43、45、71、87、101、117、129、145、161、205 8  2,3,6-Gal 1→4 0.15 43、45、74、85、89、101、117、131、159、173、233 9  2,4,6-Glc 1→3 0.03 43、45、71、87、101、117、129、145、161、205 10  2,3,4-Glc 1→6 1.63 43、45、71、87、101、129、145、161、205 11  2,3,4-Gal 1→6 2.03 43、45、71、88、101 12  3,5-Gal 1→4,6 0.40 43、45、58、71、87、101、117、129、161、233 13  2,4-Glc 1→3,6 1.10 43、45、75、89、101、113、117、129、233

DBZG4-b经甲基化,水解、还原、乙酰化后进行GC-MS分析,结果如图4和表1所示。GC-MS分析结果显示,单糖组成及物质的量比为Rha∶Ara∶Xyl∶Man∶Glc∶Gal = 1.00∶1.66∶0.37∶0.89∶2.78∶2.69,与GC分析结果基本一致。根据甲基化产物的组成及物质的量比分析可知DBZG4-b为多分支结构多糖,Glc以1→6糖苷键连接构成多糖DBZG4-b的主链之一,在3位上有分支,由物质的量比可计算出平均每22 个糖残基有9 个分支;Gal以1→6糖苷键连接构成多糖DBZG4-b的主链之一,在4位上有分支,由物质的量比可计算出平均每39 个糖残基有6 个分支[23]。支链由Ara、Glc、Gal构成,其中Ara以1→3连接,Glc以1→3连接,Gal以1→4连接。Ara、Xyl、Rha、Man、Glc、Gal都有一部分构成分子的末端残基。

2.4.31H-NMR分析DBZG4-b

大白桩菇纯化多糖 DBZG4-b以Bruker Avance 600 MHz核磁共振谱仪检测,得1H-NMR谱图,如图5所示。

图5 多糖DBZG4-b1H-NMR图
Fig.51H-NMR spectrum of DBZG4-b

α型吡喃糖H-1质子化学位移大于4.95,β型吡喃糖H-1质子化学位移δ小于4.95[24-25]。对于DBZG4-b1H-NMR谱图,在δ 4.6~δ 5.5同时存在共振峰化学位移大于4.9及小于4.9,表明DBZG4-b中存在α和β两种糖苷键。这与红外光谱分析结果一致。

2.5 DBZG4-b清除自由基的活性

2.5.1 DBZG4-b清除·OH的活性

图6 DBZG4-b及 VC对·OH的清除作用
Fig.6 Scavenging effect of DBZG4-bVC on hydroxyl free radical

如图6所示,随着多糖质量浓度的增加DBZG4-b对·OH的清除作用逐渐增强,存在一定的剂量关系。在DBZG4-b溶液质量浓度达到4 mg/mL时,对·OH的清除率可达83.99%,与VC相当。说明大白桩菇多糖DBZG4-b对·OH具有很好的清除作用。

2.5.2 DBZG4-b清除DPPH自由基的活性

图7 DBZG4-b及VC对DPPH的清除作用
Fig.7 Scavenging effect of DBZG4-band VC on DPPH free radical

如图7所示,随着溶液质量浓度的增加,DBZG4-b对DPPH自由基的清除作用逐渐增强,且清除率随多糖溶液质量浓度的变化趋势与VC一致。当DBZG4-b溶液质量浓度达4 mg/mL时,对DPPH自由基清除率可达72.50%。说明DBZG4-b具有良好的清除DPPH自由基的活性。

国内外大量研究显示[26-29],绝大部分真菌多糖具有清除自由基等抗氧化作用。实验结果表明,大白桩菇多糖DBZG4-b对·OH与DPPH自由基均有良好的清除作用。

3 结 论

大白桩菇粗多糖经提取分离纯化得均一多糖DBZG4-b。HPLC测得其相对分子质量约为6 864。经红外光谱、PC、甲基化、GC-MS、NMR分析,得多糖DBZG4-b具有α-型和β-型糖苷键构型,为多分支结构,分子主体由Glc(1→6)和Gal(1→6)构成,Glc在3位上有分支,平均每22 个糖残基有9 个分支,Gal在4位上有分支,平均每39 个糖残基有6 个分支。支链由Ara、Glc、Gal构成,其中Ara以1→3连接,Glc以1→3连接,Gal以1→4连接。Ara、Xyl、Rha、Man、Glc、Gal都有一部分构成分子的末端残基。体外清除自由基活性实验表明,大白桩菇多糖质量浓度达4 mg/mL时,对·OH 与DPPH自由基清除率分别可达83.99%和72.50%,表明DBZG4-b具有良好的体外清除自由基活性,过量的自由基可诱发多种疾病和促进生物体衰老,清除过量的自由基可维持生物体的健康衡态[30],DBZG4-b良好的清除自由基活性将为抗衰老保健品及药物的应用开发提供依据。

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Structure Identification and Free Radical Scavenging Activity of Polysaccharide from Fruit Bodies of Leucopaxillus giganteus

BAO Ying1, MA Yue1, LI Yashuang1,2, ZHANG Yunqin1, WU Yuan1,2, LIU Chunlan1,2,*
(1. College of Life and Environmental Science, Minzu University of China, Beijing 10008l, China; 2. Beijing Engineering Research Center of Food Environment and Public Health, Beijing 10008l, China)

Abstract: Crude polysaccharide was extracted from the fruit bodies of Leucopaxillus giganteus by water extraction and alcohol precipitation and was purifi ed through sequential steps: acidic ethanol fractionation, Sepharose CL-4B and Sephadex G-100 gel fi ltration chromatography to homogeneity as confi rmed by high performance liquid chromatography (HPLC). The purifi ed polysaccharide was designated as DBZG(4-b)and its molecular weight was measured by HPLC. Moreover, the structure of DBZG(4-b)was elucidated by means of gas chromatography, paper chromatography, infrared (IR) spectroscopy, gas chromatography-mass spectrometry after methylation, and nuclear magnetic resonance (NMR). Results showed that the average relative molecular weight of the homogeneous polysaccharide, DBZG(4-b), was 6 864. Its main chains were composed of Glc and Gal, and both of them were conjugated to 1→6 glycoside bond; Glc was substituted at 3-O while Gal was substituted at 4-O. The side chain was composed of (1→3)-Ara, (1→3)-Glc, and (1→4)-Gal. The terminal residue was made up of Ara, Xyl, Rha, Man, Glc and Gal. Furthermore, DBZG(4-b)had signifi cant scavenging potential against hydrolxyl and DPPH free radicals.

Key words: Leucopaxillus giganteus; polysaccharide; isolation and purifi cation; structure; free radicals

中图分类号:Q538

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)06-0071-06引文格式:

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606012

*通信作者:刘春兰(1962—),女,教授,硕士,研究方向为多糖化学。E-mail:13520669416@163.com

作者简介:包瑛(1991—),女,硕士研究生,研究方向为天然产物多糖化学。E-mail:13681496205@163.com

基金项目:中央民族大学一流大学一流学科建设项目(YLDX01013);“111创新引智计划”工程项目(B08044);准格尔北部生态保育技术集成与示范项目(2014BAC15B04);北京市大学生科学研究与创业行动计划项目(BEIJ2013110009)

收稿日期:2015-06-23