张晓松，张博雅，张永忠，金 花*
（东北农业大学理学院，黑龙江 哈尔滨 150030）
摘 要：利用“Amano”β-糖苷酶对槐角异黄酮进行水解制备染料木黄酮。采用高效液相色谱法检测槐角异黄酮水解率。探讨酶质量浓度、水解时间、pH值和水解温度对异黄酮水解率的影响，并通过响应面法确定最佳水解条件。结果表明，最佳水解条件为酶质量浓度0.5 mg/mL、水解时间3.68 h、pH 4.95、水解温度59.2 ℃。在此条件下，槐角异黄酮水解率达95.76%。该研究为自然界药用植物的开发应用提供了理论依据。
关键词：槐角异黄酮；酶水解；高效液相色谱
张晓松, 张博雅, 张永忠, 等. 响应面试验优化“Amano” β-糖苷酶水解槐角异黄酮工艺[J]. 食品科学, 2016, 37(6): 82-88. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606014. http://www.spkx.net.cn
ZHANG Xiaosong, ZHANG Boya, ZHANG Yongzhong, et al. Process optimization by response surface methodology for hydrolysis of Fructus Sophorae isoflavones by “Amano” β-glucosidase[J]. Food Science, 2016, 37(6): 82-88. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606014. http://www.spkx.net.cn
槐属豆科植物，其成熟果实为槐角，在传统中医学中槐角具有清热凉血、明目泻火的药理活性和保健功效，主要可用于缓解头痛、止血和治疗血管性高血压等疾病[1-9]。槐角除药用外，民间也常食用，国内有速溶槐角饮料研制的报道[10]。现代研究[1-3,11]表明槐角中富含异黄酮类物质，包括槐角苷、槐属双苷、染料木黄酮、染料木黄酮-7,4’-双葡萄糖苷等。异黄酮类化合物又被称为“植物雌激素”，具有抗氧化性和抑菌性等功能，能够有效地起到预防和抑制中老年骨质疏松、乳腺癌、前列腺癌以及妇女更年期综合症等疾病的作用[12-17]，从而受到人们的广泛关注。目前，研究人员主要通过大豆来提取和制备异黄酮类化合物，但是大豆中除异黄酮类化合物之外，还含有较多的油脂、蛋白质、大豆低聚糖、大豆皂苷等成分，这些物质较难分离，使得大豆异黄酮的纯化成本较高。据测定大豆中总异黄酮类化合物含量约为525～986 mg/kg[18]，远低于槐角中总异黄酮的含量（大于200 g/kg[19]）。因此，以槐角替代大豆作为获取异黄酮类物质的原料，不仅能够解决纯化成本较高的问题，还不占用粮食资源，这对于开发槐角这种药用可再生植物的应用具有重要意义。
槐角中所含的染料木黄酮是一种天然的酪氨酸激酶抑制剂，是槐角异黄酮中功能活性最高的一种，其生物活性比糖苷型槐角苷、槐属双苷更加显著，但含量却相对较少。然而，染料木黄酮是槐角苷、槐属双苷等化合物的苷元，可以通过酶催化水解的方法，将槐角苷、槐属双苷等糖苷型异黄酮转化成为苷元型染料木黄酮，从而提高染料木黄酮的含量。国内已有通过水解方法制备染料木黄酮的报道[20-22]。由青霉菌属菌发酵生产的“Amano”β-糖苷酶制剂是一种葡聚糖酶配制品，在适宜条件下可将糖苷型大豆异黄酮一步转化成苷元形式。国内用“Amano”β-糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的研究也有报道[23]，但应用“Amano”β-糖苷酶水解槐角总异黄 酮在国内外还鲜有报道。本研究以槐角为原料，借助高效液相色谱法，以提高染料木黄酮含量为目标，利用“Amano”β-糖苷酶水解成功将糖苷型异黄酮转化为苷元型染料木黄酮，并应用响应面法对工艺进行了优化。
1.1 材料与试剂
槐角异黄酮粉（总异黄酮含量46.5%） 课题组按文献[24]方法制备；染料木黄酮标准品（纯度98%）美国Sigma公司；“Amano”β-糖苷酶制剂（等电点4.3；最适温度60 ℃；最适pH 5.0～5.5；50 ℃以下稳定；pH 6以下稳定；β-糖苷酶活力约为600 U/g（1 U为pH 5.5条件下，在1 min内催化对-硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷释放1 μmol对硝基苯酚的酶量）） 日本天野酶制品株式会社；甲醇（色谱纯） Dikma科技有限公司；实验用水为超纯水；其余所用试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HZS-H水浴振荡器 哈尔滨东明医疗仪器厂；pHs-25型pH计 上海精科雷磁仪器厂；1100高效液相色谱仪（G1314A泵、G1314A紫外检测器） 美国Agilent公司；AL104型电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 高效液相色谱测定
色谱条件：流动相CH3OH-H2O体积比55∶45；色谱柱：C18柱（4.6 mm×150 mm）；流速：1.00 mL/min；进样量：5 μL；柱温：室温；检测波长：260 nm；检测时间：15 min。
标准曲线的绘制：用分析天平称取染料木黄酮标准品0.025 0 g，用甲醇定容至100.0 mL容量瓶中，制成染料木黄酮标准储备液。精密吸取储备液，甲醇定容为25.00 mL，配制系列梯度质量浓度（0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.11、0.13、0.15、0.17 mg/mL）的标准溶液待测。利用高效液相色谱进行测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.2 酶水解反应
本实验利用“Amano”β-糖苷酶对槐角中的糖苷型异黄酮进行水解，制备产物染料木黄酮。利用水和正丁醇混合溶液（水-正丁醇体积比1∶2），萃取槐角异黄酮粉3 次。萃取后的正丁醇相经减压脱溶、离心干燥后，得到异黄酮萃取物。精密称取此萃取物0.010 0 g，以0.05 mol/L的HAc-NaAc缓冲溶液溶解，稀释并定容至10.00 mL，然后再与10 mL酶液充分混合（用相同pH值缓冲溶液配制）。将此溶液转移至水浴振荡器内，于100 r/min条件下水解，反应结束，加15 mL甲醇终止反应，再将水解液用甲醇定容至50.00 mL。应用高效液相色谱测定水解液中染料木黄酮的含量，槐角异黄酮水解率计算公式如下：
以酸催化完全水解确定完全水解后产物中染料木黄酮含量。依据上述实验方法，以盐酸代替酶，调节盐酸浓度为2.5 mol/L，水解3.5 h。不断升高水解温度，直至染料木黄酮含量不再升高为止。
1.3.3 酶水解单因素试验
以槐角异黄酮水解率为评价指标，对酶质量浓度、水解时间、pH值和水解温度4 个因素进行单因素试验。单因素试验条件范围如下：设定水解pH 5、水解温度45 ℃、水解时间2.5 h，配制质量浓度为0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL的酶溶液10 mL，再分别与10 mL异黄酮溶液（1 mg/mL）相混合，进行水解；pH 5、水解温度45 ℃条件下，移取10 mL酶质量浓度为0.45 mg/mL的酶溶液与10 mL异黄酮溶液（1 mg/mL）相混合，分别使水解时间为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h进行水解；设定水解温度45 ℃、水解时间3.5 h，移取10 mL酶质量浓度为0.45 mg/mL的酶溶液与10 mL异黄酮溶液（1 mg/mL）相混合，分别调整体系pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0进行水解；设定水解pH 5，移取10 mL酶质量浓度为0.45 mg/mL的酶溶液与10 mL异黄酮溶液（1 mg/mL）相混合，水解时间3.5 h，分别在温度为35、40、45、50、55、60、65、70 ℃条件下进行水解。根据单因素试验所确定的水解条件，通过测定槐角异黄酮水解率来测定最佳酶质量浓度、水解时间、pH值及水解温度。实验重复3 次，取平均值。
1.3.4 响应面优化试验
由单因素试验分析后，选择酶质量浓度、水解时间、pH值和水解温度4 个因素，使用Box-Behnken方法进行四因素三水平响应面试验设计[25]，因素与水平见表1。并通过Design-Expert V8.0.6软件对试验数据进行处理分析。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels used in Box-Bchnken design
2.1 高效液相色谱法测定染料木黄酮的标准曲线
测定系列质量浓度的染料木黄酮标准溶液，以峰面积为纵坐标，染料木黄酮质量浓度为横坐标，得回归方程：Y=5 760.8X－2.047 6，R2=0.999 4。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 酶质量浓度对异黄酮水解率的影响
图1 酶质量浓度对水解效果的影响
Fig.1 Effect of enzyme concentration on hydrolysis efficiency of isoflavones
由图1可知，槐角异黄酮水解率随着酶质量浓度的增加而增加。当酶质量浓度在0.20～0.40 mg/mL时，槐角异黄酮的水解率升高较快。但是在酶质量浓度增加至0.40 mg/mL以后，水解率上升开始变缓慢。这是因为在酶质量浓度较低时，由于底物充足，提高酶质量浓度，酶与底物的结合程度会随之增强。当酶质量浓度上升到一定程度时，底物分子占据结合点饱和，限制了底物分子与酶质量浓度的结合力，从而减缓了水解效率的提高。因此继续增加酶质量浓度不再会使水解效率提升显著。所以选择酶质量浓度为0.45 mg/mL，最节省、合理。
2.2.2 水解时间对异黄酮水解率的影响
由图2可以看出，在水解时间为3.5 h之前，水解率随着水解时间的延长而快速提升。当水解时间3.5 h时，水解率最高。但是，继续延长水解时间时却发现异黄酮的水解率下降明显。分析造成这种现象的原因可能是随着反应的进行，体系中的产物含量提高，越来越多的产物分子逐步占据酶的活性部位，从而与底物形成竞争，抑制了酶促反应，最终导致水解率下降。
图2 水解时间对异黄酮水解率的影响
Fig.2 Effect of hydrolysis time on hydrolysis efficiency of isoflavones
2.2.3 pH值对异黄酮水解率的影响
图3 pH值对水解效果的影响
Fig.3 Effect of pH values on hydrolysis efficiency of isoflavones
由图3可知，在pH 5之前，增大体系pH值，槐角异黄酮的水解率上升显著。当pH 5时水解率达到最高。当pH值超过5以后，水解率则快速下降，由此可见体系pH值对酶活性有显著影响。这可能是由于酶空间构象会随着体系pH值的改变而发生变化，从而使酶活性部分解离效果受到影响，同时也可能改变底物的解离状态，进而影响底物与酶的结合程度。这说明“Amano”β-糖苷酶仅在较窄的pH值范围内（pH 5），底物与酶的活性部位结合最为充分，转化的水解产物也最多。
2.2.4 水解温度对异黄酮水解率的影响
图4 水解温度对异黄酮水解率的影响
Fig.4 Effect temperatures on hydrolysis efficiency of isoflavones
由图4可以看出，随着水解温度的升高，水解率先平稳上升而后迅速下降。当水解温度为60 ℃时，槐角异黄酮的水解率最大。这是因为温度对水解过程同时有两方面的影响：一方面是，当温度升高，分子运动速率较快，水解进行越顺利；另一方面来说，温度升高还会导致 维持酶分子结构的次级键解体，从而引起酶蛋白变性，抑制了水解的进行。温度较低时，第一方面影响占据主导作用，水解率稳步上升；而当温度升高，酶蛋白变性占据主导作用，酶的活性迅速减弱乃至丧失。所以，水解反应温度不应选择过高，以60 ℃为宜。
2.3 响应面试验结果
2.3.1 多元二次模型方程的建立与检验
采用Design-Expert软件进行29 组试验设计，以酶质量浓度、水解时间、pH值和水解温度为自变量，以槐角异黄酮水解率为响应值进行试验，结果见表2。
表2 Box-Behnken试验设计与结果
Table 2 Box-Behnken experimental design with experimental results
使用Design-Expert软件对表2进行二次多元回归拟合，得到多元二次响应面回归模型，回归方程为：
表3 Box-Behnken试验方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
注：*.差异显著，P＜0.05；**.差异极显著，P＜0.01。
从表3可以看出，回归模型达到极显著水平（P＜0.000 1），失拟误差（P=0.209 3＞0.05）不显著，说明该回归方程的建立与实际情况互相吻合，同时决定系数与校正决定系数可以解释响应值的变化，因此可以利用该回归方程确定水解的最佳工艺条件。方差分析中一次项X1（酶质量浓度）、X3（pH值）、X4（水解温度）对模型影响极显著，一次项X2（水解时间）和交互项X1X3、X2X4影响显著，二次项
对模型影响极显著，二次项
影响显著。结果表明试验因素对响应值不是简单的线性关系，而是一种非线性关系。因此，观察方差分析结果，可知各因素影响顺序：X3（pH值）＞X1（酶质量浓度）＞X4（水解温度）＞X2（水解时间）。
2.3.2 响应面分析
利用Design-Expert软件对表2数据进行二次多项回归拟合，做出二次回归方程响应面及等高线图，由图5可分析任何两因素对异黄酮水解率的交互影响，并确定最优工艺。
图5 两因素交互作用对异黄酮水解率影响的响应面和等高线图
Fig.5 Response surface and corresponding contour plots for the interactive effects of factors on hydrolysis efficiency of isoflavones
由图5可见，等高线图越趋近圆形，模型中各因素交互作用越弱，因此酶质量浓度与水解温度、pH值与水解温度的交互作用对异黄酮水解率的影响最大，与方差分析结果一致，所以X1X3与X2X4存在交互作用的影响。根据回归方程，考察拟合响应面的形状，当响应值 最大时，获得最优工艺参数为：酶质量浓度0.5 mg/mL、水解时间3.68 h、pH 4.95、水解温度59.2 ℃。预测最佳水解率为95.82%。
2.3.3 最佳条件验证实验结果
将实验条件设定为酶质量浓度0.5 mg/mL、水解时间3.68 h、pH 4.95、水解温度59.2 ℃时，重复实验3 次，实际测得异黄酮水解率平均值为95.76%。实测值与预测值相互吻合，说明该回归方程建立的模型正确且与实际情况拟合度较好，最佳工艺条件可行。
2.4 糖苷型异黄酮水解过程分析
图6 水解前（A）、后（B）槐角异黄酮样品的高效液相色谱图
Fig.6 HPLC chromatogram of Fructus sophorae isoflavones and their hydrosate
运用高效液相色谱分别对最佳工艺条件下水解前后样品进行分析（图6），根据洗脱定律，可推测水解前出峰较早为糖苷型异黄酮，而染料木黄酮极性较小，出峰较晚。水解前槐角中糖苷型异黄酮的出峰时间集中在2.1～3.5 min，峰值较高，相比染料木黄酮峰值很低，说明其含量较少；水解后糖苷型异黄酮峰值降低且无新峰出现，染料木黄酮峰升高明显。由此可知，糖苷型异黄酮经水解多数转化为染料木黄酮。这是因为在“Amano”β-糖苷酶的作用下，糖苷型异黄酮的糖苷键断裂，水解最终生成了苷元型染料木黄酮。本实验结果也与邬建国等[26]报道相吻合。
对比图6还可以看出，变化最剧烈的为保留时间2.4 min和3.3 min的峰。判断此两种物质为染料木苷和槐角苷，他们的水解转化率较完全。而峰值在保留时间2.1 min和2.8 min的物质水解前后两图变化不大，推测这两种物质有可能为槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖-O-鼠李糖、山柰酚3-O-β-D-葡萄糖苷等异黄酮糖苷，导致此两种物质没有转化得原因可能是它们的糖苷键位于C-3位，受到C-2位苯环的空间位阻的影响阻碍其水解。
应用“Amano”β-糖苷酶可对槐角总异黄酮进行水解，得到染料木黄酮。在单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，设计四因素三水平试验，利用Design-Expert软件进行响应面分析，建立了槐角异黄酮水解率的回归方程。结果表明，酶质量浓度、pH值和水解温度对异黄酮水解率影响 极显著。最佳工艺条件为：酶质量浓度0.5 mg/mL、水解时间3.68 h、pH 4.95、水解温度59.2 ℃。在此条件下测得槐角总异黄酮的水解率为95.76%，与预测值吻合。
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ZHANG Xiaosong, ZHANG Boya, ZHANG Yongzhong, JIN Hua*
(College of Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)
Abstract: Purpose: To optimize the hydrolysis (into genistein) of isoflavones ex tracted from Fructus Sophorae with “Amano”β-glucosidase. Methods: The optimization of four hydrolysis conditions including enzyme concentration, time, pH and temperatur e for improved hydrolysis efficiency was performed using response surface methodology (RSM). Results: The optimal hydrolysis conditions were determined as follows: enzyme concentration, 0.5 mg/mL; hydrolysis time, 3.68 h; pH value, 4.95, and hydrolysis temperature, 59.2 ℃. Under these conditions, the hydrolysis efficiency of total isoflavones was as high as 95.76%. Our investigation is significant for the exploitation and application of medicinal pants.
Key words: Fructus Sophorae isoflavones; enzymatic hydrolysis; high performance liquid chromatography
中图分类号：Q946.8
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）06-0082-07引文格式：
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606014
*通信作者：金花（1982—），女，讲师，博士，研究方向为天然生物活性物质提取及应用。E-mail：jinhua@neau.edu.cn
作者简介：张晓松（1982—），男，实验师，硕士，研究方向为天然生物活性物质提取及应用。E-mail：liuxing167@163.com
收稿日期：2015-07-27