气相色谱-三重四极杆质谱联用法测定核桃油中酚类抗氧化剂的不确定度评估

舒 平,杨卫 花,徐 幸*

(大理州质量技术监督综合检测中心,云南 大理 671000)

摘 要:采用气相色谱-三重四极杆质谱联用法测定核桃 油中酚类抗氧化剂,分析不确定度的来源,建 立评估的数学模型,通过计算不确定度的各主要分量,给出了3 种酚类抗氧化剂测定结果的扩展不确定度。评定结果表明:影响检测结果不确定度的主要因素为标准品的纯度和样品的回收率。该评估模型为气相色谱-三重四极杆质谱联用法的不确定度评估提供了参考依据。

关键词:气相色谱-三重四极杆 质谱联用法;不确定度;核桃油;酚类抗氧化剂

引文格式:

舒平, 杨卫花, 徐幸. 气相色谱-三重四极杆质谱联用法测定核桃油中酚类抗氧化剂的不确定度评估[J]. 食品科 学,

SHU Ping, YANG Weihua, XU Xing. Evaluation of uncertainties in determination of phenolic antioxidants in walnut oil by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J]. Food Science, 2016, 37(6): 194-198. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606035. http://www.sp kx.net.cn

抗氧化剂是一类能延缓食品氧化的食品添加剂,它能提高食品的稳定性和延长贮存期。按其来源可分为天然的和合成的抗氧化剂,其中常用的合成抗氧化剂有丁基羟基茴香醚(butyl hydroxy anisd,BHA)、二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、特丁基对苯二酚(tertiary butylhydroquinone,TBHQ)等,它们都属于酚类抗氧化剂。主要用于油脂的加工和贮藏,GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》对这几种抗氧化剂的使用限量都做出了明确的规定[1]。目前,检测这几种抗氧化剂的方法有GB/T 5009.30—2003《食品中叔丁基羟基茴香醚(BHA)与2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)的测定》[2]和GB/T 23373—2009《食品中抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)与特丁基对苯二酚(TBHQ)的测定》[3],这2 个标准在样品前处理的过程中都使用了大量对人体有危害的有机溶剂,且净化过程繁琐耗时,近年来也有采用液相色谱法[4-5]或者液相色谱串联质谱法[6]来测定抗氧化剂的研究报道,最近有报道[7]采用乙醇直接提取植物油脂中的抗氧化剂,采用气相色谱串联质谱测定,此方法与标准推荐的方法相比,更简便和环保,然而此方法非标准检测方法,为确保检测数据准确可靠,以及测量结果的表达和质量评定更规范,有必要对此方法进行测量不确定度的评估。同时,不确定度的评估在方法确认和量值溯源方面也具有重要意义[8]。因此,按照JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[9]以及CNAS-GL06《化学分析中不确定度的评估指南》[10]规定的方法和程序,对新建立的气相色谱-三重四极杆质谱联用法测定核桃油中酚类抗氧化剂BHA、BHT和TBHQ的方法,进行不确定度的评估,分析不确定度的主要来源,找出影响测量结果的主要因素,对这些因素进行重点控制,从而提高检测质量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

核桃油 市售;BHA标准品(纯度≥99%)、BHT标准品(纯度≥99%)、TBHQ标准品(纯度≥97%)美国Supelco公司;无水乙醇(分析纯) 重庆川东化工(集团)有限公司。

7890-7000B气相色谱-三重四极杆质谱联用仪 美国Agilent公司;涡旋混匀器 美国Thermo公司;AL204电子天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 单标储备液的配制

准确称取BHA、BHT和TBHQ标准品各100 mg(精确值0.1 mg),分别用无水乙醇溶解并定容至100 mL,配制成1 mg/mL标准物质储备溶液,避光保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2 混合标准工作液的配制

分别吸取适量的各标准储备液,配制成质量浓度为2、5、10、20、50 μg/L的BHA、BHT和TBHQ的混合标准工作液,供气相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定。

1.2.3 样品前处理

准确称取100 mg核桃油样品(精确到0.1 mg)于100 mL比色管中,用量筒量取100 mL无水乙醇,加入已称取的核桃油样品中,涡旋振荡提取1 min,充分混匀提取后吸取上清液乙醇相,供气相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定。

1.2.4 仪器分析条件

采用DB-17MS毛细柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)进行分离;载气流速为1.2 mL/min;升温程序:80 ℃保持1 min,以10 ℃/min的速率升温至200 ℃,再以20 ℃/min的速率升温至280 ℃,保持3 min;进样口温度230 ℃;进样体积1 μL;不分流进样[7]。质谱离子源采用电子电离源,溶剂延迟时间为10 min,多反应监测条件见表1。

表1 多反应监测条件
Table 1 MRM Parameters

化合物  保留时间/min定量离子对(m/z)定性离子对1 (m/z)定性离子对2 (m/z)碰撞能量/eV BHT  12.34 205/177 205/145 205/189 10 BHA  12.72 165/137 165/105 165/150 8 TBH Q  13.18 151/123 151/95 151/110 10

1.2.5 数学模型的建立与不确定度来源的分析

1.2.5.1 数学模型

建立测量值的数学模型,进行不确定度来源的分析。酚类抗氧化剂的数学模型如公式(1):

式中:X为样品中抗氧化剂的含量/(mg/kg);C为从标准曲线上计算提取液中抗氧化剂的质量浓度/(μg/L);V为提取液的体积/mL;m为样品称量的质量/mg;frec为样品的加标回收率/%。

1.2.5.2 不确定度分量的来源分析[11]

采用本实验确立的方法分析核桃油样品时,不确定度的主要来源包括:标准品的纯度、标准溶液的配制过程、标准工作曲线的拟合、样品的称量、提取溶剂的体积及加标回收 率等。

2 结果与分析

2.1 标准溶液引入的不确定度[12-15]

2.1.1 由标准品纯度引入的不确定度

根据标准品证书提供的信息,BHA纯度不小于99%,BHT纯度不小于99%,TBHQ纯度不小于97%,取矩形分布,由标准品纯度引入的不确定度为:urel(p)BHA=(1-0.99)/1.732=0.005 8;urel(p)BHT= (1-0.99)/1.732=0.005 8;urel(p)TBHQ=(1-0.97)/ 1.732=0.017 3。

2.1.2 标准品称量过程引入的不确定度

天平允许的最大误差为(±0.1) mg,分别称取BHA、BHT和TBHQ的标准品100 mg,取矩形分布,引入相对标准不确定度为:urel(m)BHA=0.000 58;urel(m)BHT=0.000 58;urel(m)TBHQ= 0.000 58。

2.1.3 标准溶液稀释过程中由玻璃量器引入的不确定度

标准溶液的配制过程中使用了玻璃量器,按照JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》[16]的要求,对所使用的玻璃量器有相应的最大允许误差,取矩形分布,标准溶液稀释过程中由玻璃量器引入的相对标准不确定度见表2。在标准溶液稀释过程中,由玻璃量器引入的相对不确定度,按表2中的数据合成,按公式(2)计算[17]

表2 标准溶液配制过程中玻璃量器引入的不确定度
Table 2 Uncertainties resulting from the preparation of standard solution using working glass containers

玻璃量器  最大允许误差/mL相对标准不确定度100 mL单标线容量瓶A级(使用8 次) ±0.10 uV1rel=0.000 58 50 mL单标吸量管A级(使用1 次)  ±0.05 uV2rel=0.000 58 20 mL单标吸量管A级(使用1 次)  ±0.03 uV3rel=0.000 87 10 mL单标吸量管A级(使用3 次)  ±0.02 uV4rel=0.001 16 5 mL单标吸量管A级(使用1 次)  ±0.015 uV5rel=0.001 74 2 mL单标吸量管A级(使用1 次)  ±0.01 uV6rel= 0.002 9

2.1.4 标准溶液稀释过程中由温度引入的不确定度

表3 标准溶液配制过程中温度引入的不确定度
Table 3 Uncertainties resulting from temperature variation in the preparation of standard solution

玻璃量器  计算公式  相对标准不确定度100 mL单标线容量瓶A级(使用8 次) 100×5×1.09×10-3/31/2/100  uT1rel=0.003 15 50 mL单标吸量管A级(使用1 次) 50×5×1.09×10-3/31/2/50  uT2rel=0.003 15 20 mL单标吸量管A级(使用1 次) 20×5×1.09×10-3/31/2/20  uT3rel=0.003 15 10 mL单标吸量管A级(使用3 次) 10×5×1.09×10-3/31/2/10  uT4rel=0.003 15 5 mL单标吸量管A级(使用1 次) 5×5×1.09×10-3/31/2/5  uT5rel=0.003 15 2 mL单标吸量管A级(使用1 次) 2×5×1.09×10-3/31/2/2  uT6rel=0.003 15

玻璃量器的检定在20 ℃条件下进行,配制标准溶液的温度控制在(20±5) ℃范围内,根据体积膨胀系数,计算出由温度波动引起的不确定度,因液体的膨胀系数远比玻璃的膨胀系数大,所以玻璃的膨胀系数忽略不计。标准工作液是用无水乙醇稀释配制的,无水乙醇溶液在20 ℃时的膨胀系数为1.09×10-3mL/℃,假设温度变化为矩形分布,由此计算的不确定度见表3。在标准溶液稀释过程中,由温度引入的相对不确定度按表3中的数据合成,按公式(3)计算[11]

2.1.5 最小二乘法拟合标准曲线的不确定度

通过测定标准工作溶液,得到校准曲线拟合的不确定度,标准系列的每个质量浓度测量2 次。用最小二乘法拟合标准工作溶液的质量浓度与峰面积曲线,标准曲线测定结果见表4。采用标准曲线测量时,对被测核桃油样品提取液测量2 次,由最小二乘法拟合的标准曲线引入的不确定度按公式(4)~(7)计算[13]

式中:S(A)为校准曲线的标准偏差/(μg/L);C0为实测样品的平均质量浓度/(μg/L);为标准溶液的各质量浓度点Cij的平均值/(μg/L);Scc为标准溶液的各质量浓度点Cij之差的平方和/(μg/L);b为校准曲线斜率;p为平行测定样品的次数;m为重复测定标准溶液的次数;n为标准溶液质量浓度点的个数;Yij为测定的各质量浓度点的峰面积;Yi为由回归方程计算得到各质量浓度点的峰面积,不确定度的计算结果见表4。

表4 3 种酚类抗氧化剂的标准曲线测定结果和不确定度计算
Table 4 Standard curves of three phenolic antioxidants and uncertainties

化合物 质量浓度C/ (μg/L) 峰面积A  线性回归方程A=a+bC相关系数r S(A)/ (μg/L)C0/ (μg/L) urel(c)BHA 2  5 725 5  12 000 10  23 100  A=1 874.1+2 062.7C  0.999 9  244.65  17.4  32.6  0.102 9 20  43 050 50  104 950 BHT 2  3 570 5  8 300 10  16 700  A=425.68+1 584.4C  0.999 2  227.47  17.4  35.2  0.129 1 20  31 650 50  79 750 TBHQ 2  3 475 5  8 500 10  15 700  A=359.42+1 549.7C  0.999 6  213.72  17.4  20.8  0.107 5 20  30 950 50  78 000

根据表4的数据,计算得出由标准曲线拟合的相对标准不确定度为:urel(c’)BHA=0.102 9/32.6=0.003 16;urel(c’)BHT=0.129 1/35.2=0.003 67;urel(c’)TBHQ= 0.107 5/20.8=0.005 17。

在测定核桃油样品的过程中,由标准溶液和校准曲线合成的不确定度按公式(8)计算:

因此,计算出urel(C)BHA=0.014 6;urel(C)BHT= 0.014 7;urel(C)TBHQ=0.022 2。

2.2 由样品前处理引入的不确定度[18-21]

2.2.1 样品的称量过程引入的不确定度

天平校准的允许最大误差为(±0.l) mg,称取核桃油样品100 mg,取矩形分布,引入的相对标准不确定度为:urel(W)=0.01/1.732=0.000 58。

2.2.2 提取溶剂量取过程引入的不确定度

采用100 mL的量筒量取100 mL的无水乙醇溶液,其最大允许误差为(±1.0)mL,由量筒和温度变化引入的相对标准不确定度分别为:uV7rel=0.005 8;uT7rel=0.003 15。

因此,由提取溶剂量取过程所引入的相对不确定度按公式(9)计算:

2.2.3 加标回收率引入的不确定度

采用空白核桃油样品中做加标回收率实验,添加水平为20 μg/L,由回收率引入的相对不确定度按公式(10)计算:

按公式(11),对回收率进行显著性检验:

式中:urel(R)为由回收率引入的相对不确定度;S ()为回收率的相对标准偏差/%;为平均回收率/%。

表5 3 种酚类抗氧化剂的回收率和不确定度计算
Table 5 Recoveries of three phenolic antioxidants and uncertainties

化合物名称平均回收率/%相对标准偏差/%  urel(R) t值 P BHA  99.8  2.64  0.010 8  0.170  不显著BHT  95.9  4.06  0.017 3  2.383  不显著TBHQ  101.5  3.37  0.013 6  1.092  不显著

计算结果如表5所示,由于加标回收率实验平行测定6 次,由f=n-1=5,查t检验临界值分布表,若t值大于双侧临界值时,回收率具有显著性差异,则回收率需带入计算用以修正结果,反之则无需带入计算[24]。本实验的t值结果见均小于t(0.05,5)=2.571,平均回收率与100%不具显著性差异,故回收率frec无需带入公式修正结果。

由样品前处理过程引入的合成不确定度按公式(12)计算:

因此,计算出urel(S)BHA=0.012 7;urel(S)BHT= 0.018 5;urel(S)TBHQ=0.015 1。

2.3 测量不确定度的评定与报告

以上不确定度的各分量相互独立,不考虑各分量间的相关性[22-24],则核桃油中酚类抗氧化剂的含量根据公式(13)计算出合成标准不确定度:

依据JJF 1135—2005《化学分析测量不确定度评定》[25],在95%的置信水平条件下,取包含因子k=2,用扩展不确定度U=k×urel(X)×W表示,核桃油样品中酚类抗氧化剂的检测结果见表6。

表6 3 种酚类抗氧化剂不确定度评定结果
Table 6 Uncertainty evaluation for the determination of three phenolic antioxidants

化合物名称 urel(X) W/(mg/kg) U  检测结果/(mg/kg)BHA  0.019 4 32.6 1.26  32.6±1.3 BHT  0.023 6 35.2 1.66  35.2±1.7 TBHQ  0.026 8 20.8 1.12  20.8±1.1

2.4 相对不确定度来源汇总

表7 样品中3 种抗氧化剂含量的相对不确定度来源汇总表
Table 7 List of relative standard uncertainties for the determination of three phenolic antioxidants in walnut oil

来源  符号  相对标准不确定度BHA BHT  TBHQ标准品纯度 urel(p) 0.005 8  0.005 8  0.017 3标准品称量 urel(m) 0.000 58  0.000 58  0.000 58玻璃量器 urel(V) 0.004 39  0.004 39  0.004 39温度 urel(T) 0.012 2  0.012 2  0.012 2拟合标准曲线 urel(c’) 0.003 16  0.003 67  0.005 17样品称量 urel(W) 0.000 58  0.000 58  0.000 58提取溶剂量取 urel(Vs) 0.006 6  0.006 6  0.006 6回收率 urel(R) 0.010 8  0.017 3  0.013 6

在测定核桃油样品中酚类抗氧化剂时,通过对检测过程中各不确定度分量进行评定,结果见表7。标准品的纯度、温度和样品的回收率等因素对不确定度的贡献较大,其次是提取溶剂的量取体积、玻璃量器与拟合标准曲线引入的不确定度,而标准品和样品的称量对不确定度的影响较小。

3 结 论

本实验采用气相色谱-三重四极杆质谱联用法对核桃油中的酚类抗氧化剂BHA、BHT和TBHQ进行测定,方法简便、准确,结合实验及分析过程,测定酚类抗氧化剂的不确定度主要来源于标准品的纯度、温度和样品的回收率等因素,其他不确定度影响较小。由此可知,在实际的检测过程中,选择纯度较高的标准品,加强对实验操作环境因素的质量控制,增加平行样的测定,进一步减小测量数据的不确定度,从而提高检测质量。

参考文献:

[1] 国家卫生和计划生育委员会. GB 2760—2014 食品添加剂使用标准[S].北京: 中国标准出版社, 2014.

[2] 国家标准化管理委员会. GB/T 5009.30—2003 食品中叔丁基羟基茴香醚(BHA)与2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.

[3] 国家标准化管理委员会. GB/T 23373—2009 食品中抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)与特丁基对苯二酚(TBHQ)的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2009.

[4] 孟磊, 谢黎霞, 苏惠. 反相高效液相色谱法测定儿童饼干中8 种抗氧化剂[J]. 理化检验(化学分册), 2013, 49(10): 1261-1263.

[5] 王浩, 杨悠悠, 刘佟, 等. 分散式固相萃取结合高效液相色谱法快速测定油脂中三种抗氧化剂含量[J]. 食品安全质量检测学报, 2014, 5(11): 3620-3625.

[6] 唐丽娜, 宁焕焱, 曾宪远, 等. 抗氧化剂的超高效液相色谱-串联质谱法测定[J]. 中国酿造, 2014, 33(7): 98-101. DOI:10.11882/ j.issn.0254-5071.2014.07.022.

[7] 杨卫花, 徐幸, 赵浩军, 等. 气相色谱/三重串联四极杆质谱分析食用植物油中抗氧化剂BHA、BHT和TBHQ[J]. 粮食储藏, 2013, 42(1): 41-44; 56.

[8] 霍晓敏. 气相色谱法对干海参中的六六六、滴滴涕测量结果不确定度的评定[J]. 食品科学, 2013, 34(8): 244-248. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201308053.

[9] 国家质量监督检验检疫总局. JJF 1059.1—2012 测量不确定度评定与表示[S]. 北京: 中国计量出版社, 2012.

[10] 中国合格评定国家认可委员会. CNAS-GL06: 2006 化学分析中不确定度的评估指南[S]. 北京: 中国标准出版社, 2006.

[11] 申中兰, 袁东, 王坤, 等. 固相萃取-气相色谱-稳定性同位素稀释质谱法测定酱油中氯丙醇的不确定度评定[J]. 中国食品学报, 2013, 13(11): 132-138.

[12] 王吉祥, 张学忠, 王亚琴, 等. 气相色谱法和气相色谱-质谱法测定茶叶中联苯菊酯的不确定度评定[J]. 食品科学, 2014, 35(12): 200-203. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201412041.

[13] 牛华, 牛之瑞, 冯雷, 等. 高效液相色谱法测定辣椒粉中罗丹明B的测量不确定度评估[J]. 食品科学, 2014, 35(8): 165-168. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201408033.

[14] BANERJEE K, OULKAR D P, DASGUPTA S, et al. Validation and uncertainty analysis of a multi-residue method fo r pesticides in grapes using ethyl acetate extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J ournal of Chromatography A, 2007, 1173(2): 98-109. DOI:10.1016/j.chroma.2007.10.013.

[15] HASEGAWA H, SHINOHARA Y, HASHIMOTO T, et al. Prediction of measurement uncertainty in isotope dilution gas chromatography/ mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1136(2): 226-230. DOI:10.1016/j.chroma.2006.09.073.

[16] 国家质量监督检验检疫总局. JJG 196—2006 常用玻璃量器检定规程[S]. 北京: 中国计量出版社, 2006.

[17] 张平, 陈睿, 曹美萍, 等. UPLC-MS/MS法检测肉制品中克伦特罗残留量的不确定度评定[J]. 食品工业科技, 2013, 34(15): 302-305.

[18] 赵健亚, 陈丹, 谢怀根, 等. 高效液相色谱法测定鸡肉中磺胺类药物残留的不确定度评定[J]. 食品科 学, 2013, 34(10): 144-147. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201310031.

[19] 樊垚, 黄翠丽, 王力清, 等. 超高效液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中的VD3含量的不确定 度评定[J]. 食品科学, 2013, 34(12): 143-146. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201312030.

[20] WALORCZYK S. Validation and use of a QuEChERS-based gas chromatographic-tandem mass spectrometric method for multiresidue pesticide analysis in blackcurrants including studies of matrix effects and estimation of measurement uncertainty[J]. Talanta, 2014, 120: 106-113. DOI:10.1016/j.talanta.2013.11.087.

[21] JIMÉNEZ J J. Determination of aminopolycarboxylic acids in river water by solid-phase extraction on activated charcoal cartridges and gas chromatography with mass spectrometric detecti on. Method performance characteristics and estimation of the uncertainty[J]. Analytica Chimica Acta, 2013, 770: 94-102. DOI:10.1016/ j.aca.2013.01.060.

[22] 张金艳, 胡丽芳, 李伟红, 等. 高效液相色谱法测定辣椒粉中碱性橙的不确定度评定[J]. 食品科学, 2014, 35(20): 213-216. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201420042.

[23] 黄旭, 贾宏新, 李辉. 荧光分光光度法测定营养素补充剂中硫胺素含量的测量不确定度评定[J]. 食品科学, 2015, 36(10): 174-178. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201510035.

[24] 洪武兴, 罗聪亮, 刘益锋, 等. 液质联用法罗非鱼中磺胺嘧啶不确定度的评定[J]. 现代食品科技, 2009, 25(11): 1369-1371. DOI:10.3969/ j.issn.1673-9078.2009.11.034.

[25] 国家质量监督检验检疫总局. JJF 1135—2005 化学分析测量不确定度评定[S]. 北京: 中国计量出版社, 2005.

Evaluation of Uncertainties in Determination of Phenolic Antioxidants in Walnut Oil by Gas Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry

SHU Ping, YANG Weihua, XU Xing*
(Dali Comprehensive Inspection Centre of Quality and Technical Supervision, Dali 671000, China)

Abstract: The sources of uncertainty in the determination of phenolic antioxidants in walnut oil by gas chromatographytriple quadrupole mass spectrometry (GC-MS/MS) were analyzed, and a mathematical model for uncertainty evaluation was established. The major uncertainty components were calculated and used to obtain the expanded uncertainties for the results of determination of three phe nolic antioxidants. The major uncertainty sources were determined as the purity of standard substance and recovery of sample. This study can provide a reference for uncertainty evaluation of GC-MS/MS analysis.

Key words: gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (GC-MS/MS); uncertainty; walnut oil; phenolic antioxidants

中图分类号:O657.63

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)06-0194-05

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606035 2016, 37(6): 194-198. 10.7506/spkx1002-6630-201606035. http://www.spkx.ne t.cn

*通信作者:徐幸(1983—),女,工程师,博士,研究方向为食品质量安全检测。E- mail:xuxing1983@163.com

作者简介:舒平(19 75—),男,高级工程师,学士,研究方向为食品质量安全检测。E-mail:2691856721@qq.com

基金项目:云南省质量技术监督局科技计划项目(2013ynzjkj16)

收稿日期:2015-06-19