表1 生物胺衍生样品的梯度洗脱模式
Table 1 Mobile phase gradients for separation of derivatives of biogenic amines
杨 娟，丁晓雯*，秦樱瑞，曾艺涛
（西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工重点实验室，重庆 400716）
摘 要：目的：测定豆豉、腐乳中包括挥发性盐基氮（total volatile bas ic nitrogen，TVB-N）值、三甲胺、硫化氢、生物胺在内的蛋白质分解产物含量，确定豆豉、腐乳中蛋白质的腐败程度，为生产更安全的豆豉、腐乳等发酵豆制品提供依据。方法：参考GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》、GB/T 5009.179—2003《火腿中三甲胺氮的测定》、GB/T 16489—1996《水质：硫化物的测定：亚甲基蓝分光光度法》及其他文献分别对样品中TVB-N值、三甲胺及硫化氢等进行测定。结果：豆豉中TVB-N值、总生物胺、腐胺、三甲胺及硫化氢的含量分别为8.20～372.72 mg/100 g、15.67～2 057.56 mg/kg、ND～276.03 mg/kg、0.26～10.43 mg/100 g及1.22～27.27 mg/kg；腐乳中的含量分别为95.33～652.94 mg/100 g、11.38～2 406.95 mg/kg、11.38～1 147.32 mg/kg、0.42～4.31 mg/100 g 及0.27～3.72 mg/kg。结论：腐乳、豆豉中TVB-N、三甲胺、硫化氢、生物胺等腐败变质物质大量生成，影响此类食品的可食用性。可初步将TVB-N值、腐胺、总生物胺及三甲胺含量作为腐乳的腐败变质标志物；TVB-N值、总生物胺及三甲胺含量作为豆豉的腐败变质标志物，结合生产环节确定此类物质的限定值。
关键词：豆豉；腐乳；蛋白质降解产物；挥发性盐基氮；三甲胺；硫化氢；总生物胺；腐胺
杨娟, 丁晓雯, 秦樱瑞, 等. 豆豉、腐乳蛋白质降解物限量标准的初步研究[J]. 食品科学, 2016, 37(6): 210-215. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606038. http://www.spkx.net.cn
YANG Juan, DING Xiaowen, QIN Yingrui, et al. Limit standards for protein decomposition products in sufu and Douchi[J]. Food Science, 2016, 37(6): 210-215. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606038. http://www.spkx.net.cn
腐乳和豆豉是我国传统的发酵豆制品，以大豆为主要原料，经微生物发酵而成，具有独特的风味，是受到部分消费者喜欢的传统食品，腐乳通常分为青方、红方、白方3 大类[1]。按制曲微生物不同，豆豉可分为曲霉型（如湖南豆豉、北京豆豉）、毛霉型（如四川潼川豆豉）、细菌型（如山东水豉、日本拉丝豆豉）等[2]。
在豆豉及腐乳的发酵过程中，部分蛋白质会发生降解，产生的高浓度游离氨基酸可在微生物酶脱羧作用下可形成大量脂肪族、芳香族和杂环族的有机碱，如组氨酸、酪氨酸和精氨酸形成相应的组胺、酪胺和腐胺等生物胺；含巯基（—SH）的氨基酸在细菌产生脱巯基酶的作用下分解产生硫化氢和硫醇类化合物；氧化三甲胺在微生物和酶的作用下生成三甲胺（trimethylamine，TMA）等[3-5]，同时还会引起pH值的变化。腐乳中主要含有腐胺、β-苯乙胺、尸胺、酪胺、组胺及色胺等[6-7]，豆豉中主要含有色胺、β-苯乙胺、组胺、腐胺、酪胺等[7-8]，几乎所有腐乳和豆豉样品中均检出的生物胺只有腐胺，其含量也在所有检出生物胺中最高[6-8]。现对于腐乳、豆豉中硫化氢、TMA等的研究较少见。食品中存在的挥发性盐基氮（tolal volatile basic nitrogen，TVB-N）、TMA、硫化氢及生物胺等腐败变质物质可严重影响食品的新鲜度、营养价值及可食用性，甚至使得食品存在一定的安全隐患。许多动物性食品将此类物质作为评价新鲜度的标志物，如硫化氢的含量用来判断肉的新鲜度[9-10]；TMA的含量作为评判猪肉、鱼和虾等食品的新鲜度的指标[11-12]；TVB-N值是用来评判肉品新鲜度的一个重要指标[13]。
腐乳、豆豉类发酵豆制品基本是自然发酵，有众多微生物生长繁殖，发酵过程形成了豆制品所特有的一些风味成分，使得豆制品具有独特的风味。与此同时，蛋白质分解物中同样存在一部分对健康不利的产物，不仅导致此类产品营养价值降低，存在安全隐患。而目前并没有针对腐乳、豆豉等发酵豆制品中蛋白质的腐败变质进行研究。因此，本实验将对腐乳及豆豉样中TVB-N值、硫化氢、TMA等蛋白质的降解产物进行研究，初步判断这些物质是否可以作为腐乳、豆豉等发酵豆制品的腐败变质标志物。希望可以确定腐乳、豆豉等发酵豆制品中蛋白质降解标志物，并对其进行限定，以保证此类食品食用安全性。
1.1 材料与试剂
腐乳、豆豉 市购；符合相关各项国家标准[14]。
氧化镁、硼酸、盐酸、甲基红、次甲基蓝、乙醇、三氯乙酸、甲苯、苦味酸、碳酸钾、甲苯、硫酸镉、NaOH、聚乙烯醇磷酸胺、对氨基二甲基苯胺使用液、三氧化铁、磷酸氢二铵、硫化钠标准品等试剂（均为分析纯） 成都市科龙化工试剂厂；丹磺酰氯、乙腈、氨水（均为色谱级） 美国Tedia公司；腐胺（纯度≥99%） 美国Sigma Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
半微量定氮器、微量滴定管（最小分度0.01 mL）北碚玻璃厂；S22可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；JYL-C022型多功能榨汁机 九阳股份有限公司；PHS-3C pH计 上海三信仪表厂；Milli-Q超纯水器美国Millipore公司；水浴恒温振荡器 江苏省金坛市富华仪器有限公司；1260高效液相色谱仪（带紫外检测器） 美国安捷伦仪器公司；台式高速离心机德国Eppendorf公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
将样品用JYL-C022型多功能榨汁机打成腐乳浆或豆豉粉，置于冰箱冷藏备用。
1.3.2 pH值的测定
称取样品5 g溶于50 mL纯水中，充分混匀后静止30 min，过滤，用pH计测定滤液pH值。
1.3.3 TVB-N值的测定
参照GB/T 5009.44—2003 《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中TVB-N值的测定方法[15]。
1.3.4 TMA含量的测定
参照GB/T 5009.179—2003 《火腿中三甲胺氮的测定》方法进行测定[16]。
1.3.5 硫化氢含量的测定
参考GB/T 16489—1996《水质：硫化物的测定：亚甲基蓝分光光度法》[17]和《亚甲基蓝比色法测定大气中的硫化氢》[18]的测定方法进行。取5 g样品于锥形瓶，加入20 mL吸收液，振荡摇匀后过滤，滤液备用。取1.00 mL滤液，用吸收液定容至10 mL，后向滤液中加入1 mL混合显色剂缓慢摇匀后，放置30 min。加入1滴磷酸氢二胺溶液，以排除三价铁离子的颜色，混匀。在波长665 nm处，用2 cm比色皿，以水为参比，测定吸光度。用同样的方法作硫化氢标准曲线。
1.3.6 总生物胺及腐胺含量的测定
参考文献[19]中的方法。
1.3.6.1 标准品的配制
称取腐胺、尸胺、亚精胺、色胺、2-苯乙胺、组胺、酪胺、精胺各0.050 0 g左右，用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至50 mL，并稀释制成终质量浓度分别为3.0、6.0、12、24、50、100 μg/mL的标准溶液。
1.3.6.2 样品的前处理
取5 g左右样品加入50.00 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，振摇30 min后，以5 000 r/min离心5 min，取上清液备用。
1.3.6.3 生物胺的柱前衍生
取1.00 mL待测溶液，分别加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液，300 μL饱和NaHCO3溶液，2.00 mL丹磺酰氯溶液（10 mg/mL溶于丙酮），在室温条件下避光处理30 min后加入100 μL NH4OH溶液中止反应，加入乙腈使终体积为5.0 mL，用0.45 μm有机滤膜过滤，滤液待检。
1.3.6.4 色谱条件
Agilent XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 øm）；柱温30 ℃；进样量5 øL；紫外检测波长254 nm；流动相A：超纯水，流动相B：乙腈。洗脱程序如表1所示。
表1 生物胺衍生样品的梯度洗脱模式
Table 1 Mobile phase gradients for separation of derivatives of biogenic amines
1.4 数据处理
所有实验均重复3 次，所得结果以
±s表示，利用Excel 2007版程序对数据进行分析。
2.1 豆豉及腐乳样品的pH值
表2 豆豉样品的pH值、TVB-N值、TMA含量、硫化氢含量、腐胺含量及总生物胺含量
Table 2 The values of pH, TVB-N, TMA, H2S, PUT and total BAs in Douchi
注：1～9.细菌型豆豉；10～19.曲霉型豆豉；20～30.毛霉型豆豉；ND.未检出，下表同。
如表2所示，市售细菌型、曲霉型和毛霉型豆豉样品的pH值变化范围分别为4.67～5.79、5.06～5.42及4.73～5.39，中位数分别为5.15、5.28及5.11。此结果与唐文强[20]、胡会萍[21]等的研究后发酵时期豆豉pH值结果吻合。说明豆豉样品的pH值处于正常范围内。
表3 腐乳样品的pH值、TVB-N值、TMA含量及硫化氢含量、
腐胺含量及总生物胺含量
Table 3 The values of pH, TVB-N, TMA and H2S in suuffuu
注：31～35.青方腐乳；36～40.红方腐乳；41～63.白方腐乳。
如表3所示，市售白方、红方及青方腐乳的pH值变化范围分别为5.22～7.33、5.26～6.02及5.49～7.04，中位数分别为6.29、5.48及6.12，此结果与张海涛[22]、徐海蒂[23]、吴晖[24]等研究腐乳后发酵时期的pH值结果吻合。说明腐乳样品的pH值处于正常范围内。因此可推断pH值不适合作为豆豉、腐乳蛋白质降解标志物。
2.2 豆豉及腐乳样品的TVB-N值
TVB-N是指富含蛋白质的食品由于微生物的作用，使蛋白质分解而产生的氨以及胺类等碱性含氮物质，通常此类含氮物质易挥发，并呈现难闻粪臭特征，目前TVB-N值是评价动物性食品新鲜度的一项重要指标[25-26]。
表4 TVB-N值与样品数的关系
Table 4 TVB-N value distribution of samples
市售豆豉中TVB-N值测定结果如表2、4所示，其中细菌型、曲霉型和毛霉型豆豉样的TVB-N值变化范围分别为8.20～262.41、65.31～303.57 mg/100 g 及63.70～372.72 mg/100 g，中位数分别为106.58、93.45 mg/100 g及117.82 mg/100 g。总体看来，市售豆豉TVB-N值集中在50～150 mg/100 g之间的样品占总数的73.33%。
如表3、4所示，市售白方、红方及青方腐乳的TVB-N值变化范围分别为95.33～318.35、123.41～165.80 及225.68～652.94 mg/100 g，中位数分别为236.70、153.93 mg/100 g及342.34mg/100 g。总体看来，腐乳中TVB-N值主要集中在100～300 mg/100 g之间，占总数的78.78%。
TVB-N作为蛋白质分解而产生的氨以及胺类等碱性含氮物质，其含量越高，表明氨基酸被破坏得越多，特别是蛋氨酸和酪氨酸，营养价值大受影响，具有一定的毒副作用[27]。由于不同食品营养成分、微生物种类与含量、贮藏条件等不同，因此不同食品制定TVB-N上限值有很大差异。GB 2707—2005《鲜（冻）畜肉卫生标准》规定，鲜（冻）畜肉中TVB-N值不大于15 mg/100 g[28]；SB/T 10525—2009《虾酱》中规定虾酱中TVB-N值不大于450 mg/100 g[29]；NY/T 1710—2009《绿色食品水产调味品》中规定，蚝油中TVB-N值不大于50 mg/100 g[30]。与其他食品中TVB-N值进行对比可以看出，豆豉、腐乳中TVB-N值是相对较高的，因此可以初步将豆豉、腐乳类发酵豆制品的TVB-N值作为其腐败变质标志物进行研究，结合豆制品特有的营养特性及生产加工特性，对豆豉、腐乳TVB-N值的生产进行全面分析，最终确定从生产到销售过程中TVB-N值对腐乳、豆豉可食用性的影响，确定限定值。
2.3 豆豉及腐乳中总生物胺及腐胺含量
食品中总生物胺含量不应该超过900 mg/kg[31-32]。当总生物胺含量超过1 000 mg/kg则会对人体健康产生危害[33]。从选择的8 种生物胺测定结果可知，唯有腐胺检测率在腐乳中为100%，在豆豉中仅有一个样中没有腐胺的检出，且腐胺的含量普遍高于其他生物胺，因此将腐胺和总生物胺一起纳入腐乳、豆豉蛋白质降解标志物的研究。
如表2所示，细菌型、曲霉型和毛霉型豆豉样中总生物胺的含量范围分别为15.67～89.00、43.03～929.97 mg/kg和48.77～2 057.56 mg/kg，中位数分别为27.56、203.27 mg/kg和84.87 mg/kg。其中，14号、20号和22号共计3 个豆豉样中总生物胺含量超过900 mg/kg，占总数的10%。如表3所示，白方、红方和青方腐乳样中总生物胺的含量范围分别为625.92～2 406.95、11.38～62.83 mg/kg和176.10～304.01 mg/kg，中位数分别为1 492.27、25.41 mg/kg和243.96 mg/kg。红方和青方腐乳样中总生物胺的含量均低于900 mg/kg，而有19 个白方腐乳样中总生物胺的含量超过了900 mg/kg，占白方腐乳样的82.61%，说明白方腐乳生产过程中有大量生物胺生成，认为应该将总生物胺含量作为此类食品的可食性标志物的备选指标。同时，结果生产环节，判断是否应该将其作为腐乳的腐败标志物。结合可食用性标准对其含量进行限定。
腐胺可和亚硝酸盐结合形成致癌的亚硝胺[34-36]；腐胺在坏死组织分解物诱导的炎症反应中可能起重要作用[37]；腐胺还能促进肿瘤的生长[36]，消化道内腐胺含量的高低可作为消化道肿瘤判断的指标之一[38]。结合本实验室关于腐胺的安全性的毒理学实验结果可知，腐胺最大无作用剂量在105～52.5 mg/kg体质量之间，当腐胺高于314.6 mg/kg体质量时，对植物细胞、动物体细胞及生殖细胞均具有遗传毒性作用。如表2所示，豆豉样品中，除3号样外，其他豆豉样中均检出了腐胺，曲霉型、毛霉型和细菌型样品中腐胺含量范围分别为26.49～139.85、36.71～276.03 mg/kg和ND～34.94 mg/kg，中位数分别为37.02、54.30 mg/kg和27.24 mg/kg。由于存在豆豉样品中无腐胺检出的情况，因此不能把腐胺作为豆豉的可食性标志物。如表3所示，所有腐乳样品中均有腐胺检出，白方、红方和青方腐乳样中腐胺的含量范围分别为172.90～1 147.32、11.38～19.93 mg/kg和25.16～234.12 mg/kg，中位数分别为585.06、13.57 mg/kg 和124.32 mg/kg。结合本实验室的研究可知，白方及青方腐乳中腐胺的含量较高，存在一定安全隐患，因此可以将腐胺作为腐乳可食用性标志物的备选指标。同时，结合生产环节，判断是否应该将其作为腐乳的腐败标志物。结合可食用性标准对其含量进行限定。
2.4 豆豉及腐乳样品的TMA含量
TMA，分子式为(CH3)3N，具有鱼腥恶臭，广泛存在于猪肉、鱼和虾等富含蛋白质的食品中，主要是由氧化三甲胺（(CH3)3NO）在细菌的作用下还原形成，且TMA可转化为致癌的N-亚硝基氨基化合物[40]。对豆豉、腐乳中的TMA含量进行了测定，如表2所示，市售细菌型、曲霉型和毛霉型豆豉样的TMA含量分别为0.26～9.14、1.01～4.93、0.49～10.43 mg/100 g，中位数分别为0.77、1.15 mg/100 g及0.77 mg/100 g。有4 个豆豉样TMA含量高于2.5 mg/100 g，占总数的13.33%。如表3所示，市售白方、红方及青方腐乳中的TMA含量变化范围分别为0.97～4.31、0.42～1.75 mg/100 g及1.02～1.43 mg/100 g，中位数分别为1.49、0.67 mg/100 g及1.17 mg/100 g。其中有4 个样TMA含量高于2.5 mg/100 g，占总数的12.12%。
从成因分析，目前没有任何关于豆豉、腐乳等豆制品中TMA的研究，因而也不能判断豆豉、腐乳等豆制品中TMA的来源。而从鱼、肉等动物性食品中TMA的形成可以了解到，动物性食品中的TMA主要是由氧化三甲胺在微生物的作用下分解产生的[39]。一些植物性食品中本身含有一定量的TMA，如魔芋及其制品中含有丰富的TMA[40-41]；环境空气中含有一定量的TMA[42]；此外，豆制品中有甲醛等物质的检出[43-44]，由于氧化三甲胺在微生物作用下反应生成TMA、二甲胺及甲醛的过程是可逆的[45]，因此可以认为，当存在一定微生物时，豆制品中甲醛的产生可能会引起TMA的形成。从含量分析，将豆豉、腐乳中的TMA含量与动物性食品中的TMA含量进行比较。用气相色谱法测定猪肉、带鱼及罗氏沼虾中TMA值分别为0.99、3.10 mg/100 g及1.54 mg/100 g[12]。50 ℃贮藏条件下秘鲁鱿鱼丝中TMA含量在10～20 mg/100 g之间[46]，冷冻贮藏过程中罗非鱼的TMA含量会随着冷藏时间延长而增加，冷藏7 d以内低于1.5 mg/100 g，认为TMA可以作为评价冷藏罗非鱼鲜度的指标物质[47]。腌腊肉中规定三甲胺氮含量不能高于2.5 mg/100 g[48]。总体看来，豆豉及腐乳中TMA值与冷藏罗非鱼、猪肉、带鱼及罗氏沼虾中TMA含量相当，对比相关动物食品的限量标准，认为应该对豆豉、腐乳中的TMA含量进行限量设定。同时，更应该对豆制品中TMA的形成进行全面的研究，最终确定TMA含量是否应该作为此类食品的腐败变质标志物。
2.5 豆豉及腐乳样品的硫化氢含量
硫化氢主要是由含巯基的蛋白质在微生物的作用下产生。如表2所示，市售细菌型、曲霉型和毛霉型豆豉样的硫化氢含量变化范围分别为1.41～27.27、1.39～3.77 mg/kg 及1.22～16.07 mg/kg，中位数分别为10.36、1.80 mg/kg 及5.55 mg/kg。由此可见，3 种类型的豆豉中硫化氢的含量存在差异，细菌型豆豉中硫化氢的含量最高，比曲霉型豆豉样中硫化氢的含量高9 倍。如表3所示，市售白方、红方及青方腐乳中硫化氢含量变化范围分别为0.27～3.48、0.46～3.40 mg/kg及0.79～3.72 mg/kg，中位数分别为0.70、1.15 mg/kg及1.25 mg/kg。不同文献报道的腐乳中硫化氢含量差异极大，吴彩梅等[49]采用碘量法测得黑龙江青腐乳中硫化氢的含量为4561.2 mg/kg；王晖等[50]用比色法测得青方腐乳中硫化氢的含量为20 mg/kg左右；而鲁绯[51]采用气相色谱-质谱联用技术测定得出腐乳中无硫化氢检出。可能是测定方法不同对腐乳中硫化氢含量测定结果存在偏差。因此不宜将硫化氢作为豆豉、腐乳的质量指标。
从上述结果可知，市售豆豉中TVB-N值及TMA含量均较高；市售腐乳中TVB-N值、TMA含量、总生物胺含量及腐胺含量均较高。此类物质均具有一定安全隐患，因此认为豆豉、腐乳存在一定安全隐患。与动物性食品相比较而言，豆豉、腐乳中TVB-N值、TMA等含量几乎接近，认为同样应该进行限定。此外，还需要增加测定样品的数量、探讨生产加工过程、贮藏期间此类物质的变化情况，才能最终确定它们作为豆豉、腐乳质量指标的限定值。建议更多学者追踪豆豉、腐乳从加工到贮藏期间此类物质的变化情况，确定在整个加工贮藏期间豆豉、腐乳类发酵豆制品中此类蛋白质分解产物的变化规律，最后提出适合的限定范围。
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YANG Juan, DING Xiaowen*, QIN Yingrui, ZENG Yitao
(Key Laboratory of Processing and Storage of Agricultural Products of Chongqing, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China)
Abstract: Objective: To determine the values of total volatile basic nitrogen (TVB-N), trimethylamine, hydrogen sulfide and biogenic amines derived from the decomposition of proteins in sufu and Douchi and consequently ensure the safety of fermented soybean products. Methods: The above parameters were measured according to the Chinese national standards (GB/T 5009.44—2003, GB/T 5009.179—2003, and GB/T 16489—1996) and previously published methods, respectively. Results: The values of TVB-N, total biogenic amine, putrescine, trimethylamine, and hydrogen sulfide of Douchi were 8.20–372.72 mg/100 g, 15.67–2 057.56 mg/kg, ND–276.03 mg/kg, 0.26–10.43 mg/100 g and 1.22–27.27 mg/kg, respectively, while those of sufu were 95.33–652.94 mg/100 g, 11.38–2 406.95 mg/kg, 11.38–1 147.32 mg/kg, 0.42–4.31 mg/100 g and 0.27–3.72 mg/kg, respectively. Conclusions: Sufu and Douchi are rich in TVB-N, TMA, H2S and BAs, which adversely affect the eating quality of products. TVB-N, putrescine, total biogenic amines and trimethylamine are preliminarily considered as indicators of sufu spoilage whereas spoilage indicators for Douchi are TVB-N, total biogenic amines and trimethylaminecan. The limit standards for these indicators could be determined by taking the production process into account.
Key words: Douchi; sufu; protein decomposition products; tolal volatile basic nitrogen (TVB-N); trimethylamine; hydrogen sulphide; total biogenic amine; putrescine
中图分类号：R994.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）06-0210-06引文格式：
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201606038
*通信作者：丁晓雯（1963—），女，教授，博士，研究方向为食品安全与功能食品。E-mail：xiaowend@sina.com
作者简介：杨娟（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品安全与质量控制。E-mail：yangjuan-sky@163.com
收稿日期：2015-06-08