涩柿树皮单宁的纯化及抗氧化活性

杨琼琼,李 东,屈 恋,张 强,刘雄民 *

(广西大学化学化工学院,广西 南宁 530004)

摘 要:选用超声波法从涩柿树皮中提取单宁,溶剂法、大孔树脂法纯化粗提物,并考察了不同纯度的单宁对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和羟自由基(·OH)的清除作用。结果表明:涩柿树皮单宁的超声波提取率为5.6%;大孔吸附树脂纯化涩柿树皮单宁的最佳工艺参数为:以HPD-500树脂为吸附树脂,上柱流速1.5 mL/min,上样质量浓度1.2 mg/mL;洗脱流速1.5 mL/min,乙醇体积分数60%;粗提物、乙酸乙酯萃取物、大孔树脂纯化物、乙酸乙酯萃余物经大孔树脂纯化后产物、乙酸乙酯萃取物经大孔树脂纯化后产物的纯度分别为5.6%、11.5%、19.4%、47.4%、53.3%;当质量浓度为1 mg/mL时各纯度单宁对DPPH自由基有最大清除率,清除率分别为69.07%、80.19%、92.96%、94.02%、94.05%;清除DPPH自由基的IC 50值分别为0.68、0.52、0.13、0.12、0.11 mg/mL;当质量浓度为0.9 mg/mL时各纯度单宁对·OH有最大清除率,清除率分别为43.04%、73.99%、83.00%、94.68%、96.23%。

关键词:单宁;纯化;抗氧化活性

柿子(Diospyros kaki Thunb.)为柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros L.)植物,分为甜柿和涩柿两大类,广泛分布在温带、热带和亚热带地区 [1]。中国、西班牙、日本、韩国、美国等为主要栽培国家,其中中国在柿栽培面积和产量上均居世界第一位 [2]。柿树果实具有降血压、解蛇毒、解酒、抗癌和抗病毒等多种功能 [3]。涩柿树皮即柿科植物的树皮,《本草图经》记载涩柿树皮具有主下血和烫火伤的功效,是我国的一味中草药之一,也是栲胶原料之一。涩柿树皮含有丰富的柿单宁 [4]。柿单宁是主要由儿茶素、棓儿茶素、儿茶素-3-棓酸和棓儿茶素-3-棓酸4 种单体组成的酚类物质 [5]

氧自由基活性极大,具有一个不配对电子,它能夺取与其相遇的分子中的一个电子与自己配对,这将致使人体内的正常生化过程受到干扰,毁坏正常细胞,对机体造成伤害。当体内氧自由基积累过多,就会引发心血管、皮肤老化、内分泌、新陈代谢以及各类癌症等许多慢性疾病 [6]。涩柿树皮中含有丰富的多酚基抗氧化化合物(主要为单宁),该物质被证实通过使机体免于自由基介导损伤而减小慢性疾病的威胁 [7],而单宁被认为具有抗诱变、抗癌、抗氧化活性 [8]

关于柿单宁的研究情况国内外研究报道较多,就抗氧化性方面,国外学者Ahn [9]、Han [10]等发现柿种子和柿叶提取物具有自由基清除能力,并能抑制细胞中脂质过氧化。Gorinstein等 [11]研究发现,柿皮和柿果肉对实验小鼠具有显著的抗氧化降胆固醇和降血脂功效。Katsubet等 [12]研究发现柿单宁具有抗低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)氧化能力。国内学者顾海峰等 [13]制备了不同分子质量的柿子单宁,并研究其抗氧化活性,发现高分子质量柿单宁具有较强清除自由基能力。我国对柿树的开发利用仅局限于叶子和果实,从其树皮中提取具有抗氧化及清除自由基功能的生物活性物质尚未见报道。涩柿树皮资源在我国极为丰富,经过修剪丢弃的柿树枝可作为长期大量的植物来源。若能把涩柿树皮中的单宁提取出来,应用于抗氧化、降血压、解蛇毒等方面,并进行合理开发利用,其应用前景广阔,发展潜力较大。

单宁粗提物中含有大量的蛋白质、色素、脂类和糖等杂质,因此需要进一步分离纯化。单宁的分离纯化技术有有机溶剂萃取法、大孔树脂法等。乙酸乙酯能够溶解低聚的缩合单宁和多种水解单宁 [14]。大孔吸附树脂具有吸附量大、吸附速率快、选择性好、方便再生处理等优点,被广泛用于天然产物的初步分离纯化 [15]

本研究采用超声波辅助提取的方法对涩柿树皮单宁进行了提取,分别采用乙酸乙酯萃取法、大孔吸附树脂法、乙酸乙酯萃取法与大孔吸附树脂法联用分离纯化涩柿树皮粗提物,考察了不同纯度的单宁清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和羟自由基(·OH)的能力,评价了其抗氧化性能,为涩柿树皮的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

涩柿树皮:2014年7月上旬采自广西南丹县,将修剪的枝干剥取树皮去芯材部分得到树皮,将树皮60 ℃烘干后粉碎,40 目过筛后低温保存备用。

DPPH 美国Sigma公司;AB-8、HPD-500、D-101型大孔树脂 南开大学化工厂;儿茶素标准品(分析纯) 中国药品生物制品检定所;甲醇、浓硫酸、香草醛、无水乙醇均为分析纯。

1.2 仪器与设备

多用途恒温超声波提取仪 上海比朗仪器有限公司;UV-2550型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 涩柿树皮单宁的提取

将新鲜的涩柿树皮在恒温干燥箱中60 ℃烘干,将其粉碎过40 目筛,得到干燥的涩柿树皮粉末原料。准确称取100 g干燥涩柿树皮粉末加2 000 mL石油醚在60 ℃、360 W、40 min的超声提取条件下对原料进行脱脂,然后挥干石油醚得到干燥脱脂涩柿树皮粉末。采用超声波法在提取条件为料液比1∶20(m/V)、70 ℃、360 W条件下提取40 min得到粗提物。

1.3.2 单宁的定量分析 [16]

采用香草醛-硫酸法进行,分别准确量取质量浓度为0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175、0.200、0.225 mg/mL的儿茶素标准溶液各0.5 mL于9 支10 mL的棕色容量瓶中,依次加入30 mg/mL香草醛-甲醇溶液、30%硫酸-甲醇溶液各2.5 mL,摇匀,30 ℃水浴条件下放置30 min。以甲醇和相应体积的试剂做参比液,以0.150 mg/mL儿茶素标准溶液及样品溶液显色后,在400~600 nm波长范围内扫描,确定最大吸收波长,再在最大吸收波长处测定系列质量浓度标准溶液吸光度。以质量(X,mg)为横坐标、吸光度(A 500 nm)为纵坐标,绘制标准曲线。取0.5 mL提取液,与标准样品同样方法测定其在工作波长处的吸光度,计算涩柿树皮单宁的提取率。

1.3.3 涩柿树皮单宁样品的分离与纯化

1.3.3.1 乙酸乙酯萃取

100 mL粗提液,用石油醚100 mL萃取1 次,收集水相,水相再用一倍体积的氯仿萃取3 次,收集水相,水相再用二倍体积的乙酸乙酯萃取6 次,合并6 次萃取的乙酸乙酯相,收集乙酸乙酯相和乙酸乙酯萃余相,分别在40 ℃旋转蒸发,40 ℃恒温烘干得到涩柿树皮单宁的乙酸乙酯萃取物和乙酸乙酯萃余相纯化样品。

1.3.3.2 大孔树脂的静态筛选

称取已预处理的AB-8、HPD-500、D-101型大孔树脂各2 g,分别装入250 mL三角瓶中,然后加入50 mL已知质量浓度的单宁粗提液,置于摇床中,设置温度为30 ℃,振荡速率为110 r/min,振荡24 h后过滤,然后用体积分数为60%的乙醇50 mL洗脱树脂,分别测定滤液及洗脱液中单宁的含量,计算树脂的吸附率和解吸率,选出最佳大孔吸附树脂。

1.3.3.3 HPD-500树脂对涩柿树皮单宁的分离工艺考察

量取15 mL已预处理的HPD-500大孔吸附树脂,湿法装柱。每次量取300 mL样品溶液上柱,设定一定的流速,用分部收集器收集流出液。通过改变上样液流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min)和上样液质量浓度(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)确定其最适上样流速和上样液质量浓度。

吸附完成后,通过改变洗脱流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min)和乙醇体积分数(20%、40%、60%、80%、90%、95%)的实验,考察其最适洗脱流速和洗脱剂体积分数。

1.3.4 单宁抗氧化性的测定

1.3.4.1 ·OH的清除作用 [17-19]

依次取10 mL容量瓶分别编号,各加入7.5 mmol/L邻二氮菲溶液1.0 mL、pH 7.4磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS)2.0 mL和7.5 mmol/L FeSO 4溶液l.0 mL,混匀后分别加入1.0 mL不同质量浓度的样品溶液,再各加入0.1%的H 2O 2溶液l.0 mL,并加蒸馏水定容至10 mL。摇匀后,37 ℃水浴保温1 h,在 510 nm波长处测定其吸光度A 1,以蒸馏水代替试样的吸光度A 2,以蒸馏水代替试样及H 2O 2的吸光度A 0,以消除样品本身影响,以抗坏血酸作为对照,以蒸馏水作参比液。自由基清除率可用以下公式计算。

1.3.4.2 DPPH自由基的清除作用 [20]

配制浓度为2h10 -4mol/L的DPPH自由基-无水乙醇溶液。取样品溶液2 mL和2 mL DPPH自由基溶液,摇匀,放置30 min,以提取溶剂无水乙醇调零,在517 nm波长处测定吸光度记为A i,2 mL无水乙醇加入2 mL DPPH自由基溶液,摇匀,测定吸光度A c,2 mL样品溶液加入2 mL无水乙醇,摇匀,测定吸光度A j。每个浓度平行测3 次,取平均值。以抗坏血酸(VC)作阳性对照,依照上述方法测定,根据下式分别计算样液和VC对DPPH自由基的清除率。

式中:A j为样品自身吸光度;A c为DPPH自由基本身吸光度;A i为样品对DPPH自由基作用后的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单宁的定性与定量分析

2.1.1 单宁定性分析结果

图1 儿茶素、粗提物溶液的紫外-可见吸收光谱
Fig.1 Uv-visible absorption spectra of catechin and the crude extract

由图1可知,涩柿树皮中的单宁与儿茶素的光谱特征相似,说明样品中含有单宁。

2.1.2 单宁定量分析结果

经香草醛-硫酸法显色后,儿茶素标准溶液在500 nm波长处有最大吸收,以吸光度A 500 nm和儿茶素质量X得到回归方程为:A 500 nm=6.185 1X+0.006 6(R 2=0.999 5)。由此可得涩柿树皮单宁的提取率为5.6%。

2.2 涩柿树皮单宁分离纯化工艺的确定

2.2.1 大孔树脂的筛选

表1 3 种大孔树脂对样品中单宁的静态吸附和解吸结果
Table 1 Adsorption and desorption efficiency of tannin using three types of resins

树脂类型 吸附率/% 解吸率/% HPD-500 70.95 95.66 AB-8 61.16 92.36 D101 66.66 97.44

以树脂对单宁的吸附能力与解吸能力为指标,通过树脂静态吸附与解吸实验选择树脂类型,结果如表1所示。在实验条件下,HPD-500型树脂对涩柿树皮中单宁的吸附作用最好,吸附率达 70.95%,解吸率为95.66%。D101型树脂解吸率虽然最高,达97.44%,但吸附率比HPD-500型树脂稍低。综合比较这两种树脂,选用HPD-500型大孔树脂进行动态吸附实验。

2.2.2 吸附流速对HPD-500树脂吸附涩柿树皮单宁的影响

由图2可知,树脂的吸附率随着流速的增加而降低。当上柱流速在0.5~1.5 mL/min时吸附率均达到86%以上且差别不大,之后流速加大吸附率降低显著,这是因为上柱流速过大,大量单宁还来不及被树脂充分吸附便流出树脂柱。虽然较低的流速对吸附率大,但流速过低,耗时长,工作效率低,经综合考虑确定,以1.5 mL/min的流速进行上柱较为适宜。

图2 不同流速对HPD-500树脂吸附涩柿树皮单宁效果的影响
Fig.2 Effect of sample loading flow rate on adsorption efficiency of tannin

2.2.3 上样质量浓度对HPD-500树脂吸附涩柿树皮单宁的影响

图3 样液质量浓度对HPD-500树脂吸附涩柿树皮单宁效果的影响
Fig.3 Effect of sample concentration on adsorption efficiency of tannin

如图3所示,HPD-500型大孔树脂的吸附量随单宁质量浓度的升高而增大,吸附率随单宁质量浓度增大而降低。虽然单宁质量浓度为0.4 mg/mL时吸附率最大,但其吸附量仅为5.77 mg/g,树脂吸附能力未得到充分发挥。质量浓度为1.2 mg/mL时,吸附率为88.74%,树脂吸附量已达10.51 mg/g,吸附率和吸附量均较高。综合考虑,选择质量浓度为1.2 mg/mL比较适宜。

2.2.4 不同解吸流速对涩柿树皮单宁洗脱的影响

如图4所示,树脂的解吸率随着流速的增加而降低。当流速在0.5~1.5 mL/min时吸附率均达到94%以上且差别不大,之后流速加大解吸率降低显著,这可能是因为流速过快,洗脱剂未能与被吸附的单宁充分作用而将其从大孔树脂的吸附位点上置换出来。虽然较低的流速解吸率大,但流速过低,耗时长,工作效率低,经综合考虑确定,以1.5 mL/min的流速进行解吸较为适宜。

图4 不同洗脱流速对涩柿树皮单宁解吸的影响
Fig.4 Effect of elution flow rate on desorption efficiency

2.2.5 不同洗脱剂体积分数对涩柿树皮单宁洗脱的影响

涩柿树皮单宁类化合物经树脂柱吸附后,再将其从树脂上洗脱下来才能达到分离纯化的目的。水和乙醇溶液的洗脱效果较好 [21]。考虑到涩柿树皮一般应用在中药行业中,本实验选用无毒性的乙醇-水作解吸剂,研究乙醇体积分数对解吸率的影响,其结果如图5所示。由于单宁化合物能与大孔树脂间产生强烈的氢键作用,所以吸附在树脂上的单宁类物质不会被水洗脱下来。涩柿树皮单宁的性质不同与大孔树脂之间的吸附作用强度也不同。体积分数较低的乙醇只能使少部分单宁洗脱下来,并且随着乙醇体积分数的增加,树脂的解吸率显著增加。当乙醇体积分数增加到60%时,解吸率达到最大,之后略有降低。故选择乙醇体积分数为60%。

图5 不同体积分数乙醇对涩柿树皮单宁洗脱效果的影响
Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption efficiency

2.3 样品纯度分析

采用不同的纯化方法纯化样品液,经香草醛-硫酸法显色测定单宁纯度。结果如表2所示,不同纯化方法得到的样品纯度各不相同。粗提物经乙酸乙酯萃取后纯度约为粗提物的2 倍,经大孔树脂纯化后纯度约为粗提物的3 倍。乙酸乙酯萃取后的萃余相经HPD-500型树脂纯化后所得产物的纯度约为粗提物的8 倍,乙酸乙酯萃取后的萃取相经HPD-500型树脂纯化后所得产物的纯度约为粗提物的10 倍。采用溶剂萃取与大孔树脂联用方法得到的涩柿树皮单宁纯度高于文献[22]柿叶多酚纯度。

表2 样品纯度分析结果
Table 2 Purity of the crude extract and purified samples

乙酸乙酯萃取物经大孔树脂纯化后产物单宁纯度/% 5.6 11.5 19.4 47.4 53.3样品 粗提物 乙酸乙酯萃取物大孔树脂纯化物乙酸乙酯萃余物经大孔树脂纯化后产物

可见,单宁粗提物杂质含量较多,很难经过简单的某种纯化方法达到很好的分离效果,这也正是天然产物分离的难点,如果能解决这一问题,将有利于促进我国中药现代化进程。

2.4 涩柿树皮单宁对DPPH自由基的清除效果

考察了单宁酸、不同纯度的单宁质量浓度在0.10~1.00 mg/mL时对DPPH自由基的清除率(图6),在实验质量浓度范围内,清除率随各试样质量浓度的增加而增大。各试样均在质量浓度为1.00 mg/mL时有最大清除率,最大清除率分别为69.07%、80.19%、92.96%、94.02%、94.05%;清除DPPH自由基的IC 50值分别为0.68、0.52、0.13、0.12、0.11 mg/mL;其中大孔树脂纯化物、乙酸乙酯萃余物经大孔树脂纯化后产物、乙酸乙酯萃取后经大孔树脂纯化后产物在质量浓度为0.5 mg/mL时与等质量浓度的单宁酸对清除DPPH自由基能力几乎相同,均达到90%以上,表现出较高清除能力。依据IC 50值,单宁对DPPH自由基清除能力次序为:乙酸乙酯萃取后经大孔树脂纯化后产物>乙酸乙酯萃余物经大孔树脂纯化后产物>大孔树脂纯化物>乙酸乙酯萃取物>粗提物,与图6反映的结果一致。

图6 不同质量浓度样品对DPPH自由基的清除率
Fig.6 Percentage scavenging of different samples for DPPH radical

2.5 涩柿树皮单宁对·OH的清除效果

考察了单宁酸、不同纯度的单宁质量浓度在0.10~0.90 mg/mL时对·OH的清除率,结果见图7。在实验质量浓度范围内,清除率随各试样质量浓度的增加而增大。各试样均在质量浓度为0.90 mg/mL时有最大清除率,最大清除率分别为43.04%、73.99%、83.00%、94.68%、96.23%,其中大孔树脂纯化物、乙酸乙酯萃余物经大孔树脂纯化后产物、乙酸乙酯萃取后经大孔树脂纯化后产物均比同等质量浓度的单宁酸对清除·OH能力强。

图7 不同质量浓度样品对·OH的清除率
Fig.7 Percentage scavenging of different samples for ·OH

综上可知,不同纯度的涩柿树皮单宁的DPPH自由基和 ·OH清除能力差异较大。虽然DPPH自由基和 ·OH清除率数据略有区别,但是总体趋势一致,即大孔树脂纯化物、乙酸乙酯萃余物经大孔树脂纯化后产物、乙酸乙酯萃取后经大孔树脂纯化后产物的抗氧化活性较强,粗提物和乙酸乙酯萃取物较弱。造成DPPH自由基和·OH清除率差异的原因可能是两者的反应条件与机理不同 [23]。另外,本实验中涩柿树皮单宁的DPPH自由基和·OH清除率高于文献[24]中柿叶多酚对这两种自由基的清除率,略低于文献[25]柿果不同部位单宁对这两种自由基的清除率,原因可能是涩柿树皮单宁含量高于柿叶单宁含量,低于柿果单宁含量。

3 结 论

以涩柿树皮粗提物为原料,考察各种大孔树脂对单宁的动态吸附效率,筛选出了对涩柿树皮单宁纯化效果较好的大孔树脂为HPD-500,其吸附率为70.95%,解吸率为95.66%,HPD-500树脂动态纯化的较适工艺参数为:上柱流速1.5 mL/min,上样质量浓度1.2 mg/mL,洗脱流速1.5 mL/min,洗脱剂的乙醇体积分数60%。

分离、纯化得到了不同纯度的涩柿树皮单宁,并分析了不同纯度的涩柿树皮单宁抗氧化活性。结果表明,不同纯化方法得到单宁样品纯度差异较大,说明单宁类物质是个极复杂的混合物,很难通过简单的纯化方法得到高纯度单宁。不同纯度的涩柿树皮单宁对DPPH自由基和·OH均有一定的清除作用,各单宁样品的自由基清除能力呈现出明显的剂量依赖性。总体上看,大孔树脂纯化物、乙酸乙酯萃余物经大孔树脂纯化后产物、乙酸乙酯萃取物经大孔树脂纯化后产物的抗氧化活性较强,值得进一步提纯与研究。

参考文献:

[1] 王仁梓. 柿[M]. 北京: 中国林业出版社, 1982: 1-20.

[2] 傅建敏, 梁晋军, 周道顺. 柿叶有效成分研究综述[J]. 中南林业科技大学学报, 2013(11): 66-72. DOI:10.3969/j.issn.1673-923X.2013.11.013.

[3] WU P W, HWANG L S. Determination of soluble persimmon tannin by high performance chromatography gel permeation chromatography[J]. Food Research International, 2002, 35: 793-800. DOI:10.1016/S0963-9969(02)00076-5.

[4] GU Haifeng, LI Chunmei, XU Yujuan. Structural features and antioxidant activity of tannin from persimmon pulp[J]. Food Research International, 2008, 41(2): 208-217. DOI:10.1016/ j.foodres.2007.11.011.

[5] 张宝善, 伍晓红, 陈锦屏. 柿单宁研究进展[J]. 陕西师范大学学报(自然科学版), 2008(1): 99-105. DOI:10.15983/j.cnki.jsnu.2008.01.017.

[6] LIU Zhongli, WANG Panfen, LIU Youcheng. Studies on Bioantioxidants (V): inhibition of autoxidation of linoleic acid by vitamin C and lipophilic vitamin C derivatives in micelles[J]. Science in China: Series B, 1992, 35(11): 1307-1314.

[7] SHELA G, GUSTAW W K, ELZBIETA B, et al. The influence of persimmon peel and persimmon pulp on the lipid metabolism and antioxidant activity of rats fed cholesterol[J]. Nutritional Biochemistry, 1998, 9: 223-227. DOI:10.1016/S0955-2863(98)00003-5.

[8] UCHIDA S, OZAKI M, AKASHI T, et al. Effects of (-)-epigallocatechin-3-O-gallate(green tea tannin)on the life span of strokeprone spontaneously hypertensive rats[J]. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 1995, 22: 302-303. DOI:10.1111/ j.1440-1681.1995.tb02928.x.

[9] AHN H S, JEON T L, LEE J Y, et al. Antioxidative activity of persimmon and grape seed extract: in vitro and in vivo[J]. Nutrition Research, 2002, 22: 1265-1273. DOI:10.1016/S0271-5317(02)00429-3.

[10] HAN J, KANG S, CHOUE R. Free radical scavenging effect of Diospyros kaki, Laminaria japonica and Undaria pinnatifida[J]. Fitoterapia, 2002, 73(7/8): 710-712. DOI:10.1016/S0367-326X(02)00236-8.

[11] GORINSTEIN S, ZEMSER M, WEISZ M, et al. Fluorometric analysis of phenolics in persimmons[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1994, 58: 1087-1092. DOI:10.1271/bbb.58.1087.

[12] KATSUBET T, TABATAH H, OHTA Y, et al. Screening for antioxidant activity in edible plant products: comparison of lowdensity lipoprotein oxidation assay, DPPH radical scavenging assay, and Folin-Ciocalteu assay[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(8): 2391-2396. DOI:10.1021/jf035372g.

[13] 顾海峰, 李春美, 徐玉娟, 等. 柿子单宁的制备及其抗氧化活性研究[J]. 农业工程学报, 2007, 23(5): 241-245. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6819.2007.05.047.

[14] 陈荟芸. 肉桂单宁提取分离纯化及抗氧化活性研究[D]. 南宁: 广西大学, 2014.

[15] 洁丽, 杨中汉, 袁珂. 新型凝胶树脂及大孔吸附树脂在中草药成分分离纯化中的应用[J]. 中药材, 2005, 28(3): 239-242. DOI:10.3321/ j.issn:1001-4454.2005.03.035.

[16] 杨依姗, 李春美, 陈美红. 香草醛/硫酸法测定柿子单宁含量条件的优化[J]. 食品科技, 2010, 35(12): 267-271. DOI:10.13684/j.cnki. spkj.2010.12.049.

[17] 谢云涛, 马国平, 何玉凤, 等. BPR-硫脲催化光度法对羟基自由基的检测及清除作用[J]. 化学通报, 2006, 69(6): 458-461. DOI:10.3969/ j.issn.0441-3776.2006.06.021.

[18] 丁宗庆, 李小玲. 溴甲酚紫光度法测定水果的抗氧化活性[J]. 食品研究与开发, 2008, 29(3): 54-57. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2008.03.017.

[19] 张德莉, 罗光富, 陈燕, 等. 溴甲酚绿测定Fenton产生的羟基自由基[J].三峡大学学报(自然科学版), 2005, 27(5): 449-452. DOI:10.3969/ j.issn.1672-948X.2005.05.018.

[20] 赵国建, 李桂峰, 董周永, 等. 石榴籽中多酚的提取及其抗氧化作用研究[J]. 西北植物学报, 2008, 28(12): 2532-2537. DOI:10.3321/ j.issn:1000-4025.2008.12.027.

[21] CAO Xi, WANG Chuan, PEI Hua, et al. Separation and identification of polyphenols in apple pomace by high-speed counter-current chromatography and high-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography, 2009, 1216: 4268-4274. DOI:10.1016/j.chroma.2009.01.046.

[22] 王超华. 柿叶中酚类物质的提取、纯化及初步鉴定研究[D]. 长沙:湖南农业大学, 2010.

[23] 张东娣, 康文艺, 刘瑜新, 等. 开封产3 种白色菊花提取物的抗氧化活性[J]. 精细化工, 2009, 26(5): 464-467. DOI:10.13550/ j.jxhg.2009.05.024.

[24] 赵丰丽, 张云鸽, 庞冠兰. 柿叶多酚测定条件及其抗氧化活性的研究[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012(11): 173-176. DOI:10.3969/ j.issn.1005-9903.2012.11.051.

[25] 陈美红, 李春美, 杨依姗. 柿子不同部位单宁提取物清除自由基作用的比较研究[J]. 食品科技, 2009, 34(8): 120-123. DOI:10.11974/ nyyjs.20150501031.

Purification and Antioxidant Activity of Tannin from Persimmon Tree Bark

YANG Qiongqiong, LI Dong, QU Lian, ZHANG Qiang, LIU Xiongmin *
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China)

Abstract:Tannin in persimmon tree bark was ultrasonically extracted. The crude extract was purified by organic solvent extraction and macroporous resin adsorption. The free radical scavenging activity of tannin samples with different purities was studied using two different systems. The extraction yield of tannin in the crude extract was 5.6%. The optimum conditions for purifying the crude extract with HPD-500 macroporous resin were as follows: a sample containing 1.2 mg/mL tannin was loaded onto the column at a flow rate of 1.5 mL/min and eluted with 60% ethanol at a flow rate of 1.5 mL/min. The purity of the crude extract was 5.6%, which was increased to 19.4% after macroporous resin purification. After ethyl acetate extraction of the crude extract, the extract phase was purified to a purity of 11.5%. After further purification by macroporous resin adsorption, the purity of the raffinate and extract phases was increased to 47.4% and 53.3%, respectively. The crude extract and the resulting purified samples exhibited maximum percentage (69.07%, 92.96%, 80.19%, 94.02% and 94.05%, respectively) of DPPH radical scavenging activity at 1 mg/mL with an IC 50value of 0.68, 0.13, 0.52, 0.12 and 0.11 mg/mL, respectively. The maximum percentage scavenging (43.04%, 83.00%, 73.99%, 94.68% and 96.23%, respectively) of ·OH by the tannin samples with different purities at 0.9 mg/mL was obtained.

Key words:tannin; purification; antioxidant activity

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607010

中图分类号:TS209

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)07-0050-06

引文格式:

杨琼琼, 李东, 屈恋, 等. 涩柿树皮单宁的纯化及抗氧化活性[J]. 食品科学, 2016, 37(7): 50-55. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607010. http://www.spkx.net.cn

YANG Qiongqiong, LI Dong, QU Lian, et al. Purification and antioxidant activity of tannin from persimmon tree bark[J]. Food Science, 2016, 37(7): 50-55. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607010. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2015-05-08

基金项目:广西科学研究与技术开发项目(桂科攻 1099061-2;桂科攻 12118008-2)

作者简介:杨琼琼(1989—),女,硕士研究生,研究方向为天然产物的提取分离纯化及活性。E-mail:m15578000363@163.com

*通信作者:刘雄民(1969—),男,教授,博士,研究方向为天然产物的提取分离纯化及活性。E-mail:xmliu1@gxu.edu.cn