NKA-9大孔树脂纯化香椿叶黄酮类物质工艺优化

苗修港,余 翔,张贝贝,张京芳 *,梁峻彬

(西北农林科技大学林学院,陕西 杨凌 712100)

摘 要:以香椿叶提取物为原料,以吸附率和解吸率为指标,考察了9 种大孔树脂对香椿叶黄酮的吸附与解吸性能,并结合静态吸附动力学,筛选出适宜纯化香椿叶黄酮的大孔树脂为NKA-9。运用静态与动态吸附、解吸实验,研究得出NKA-9纯化香椿叶黄酮的最佳工艺条件为:选取70 mL 7 mg/mL的香椿叶提取物(含NaCl浓度为3 mol/L),上量流速2 BV/h,用80 mL 60%乙醇溶液(pH 6)为洗脱剂,以2 BV/h的流速洗脱。在该条件下,香椿叶黄酮含量由纯化前81.272 3 mg/g增加到纯化后219.970 2 mg/g。高效液相色谱结果分析表明,芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、阿福豆苷5 种黄酮类单体物质含量均提高到纯化前的3 倍以上。该工艺能有效地富集纯化香椿叶黄酮类物质,槲皮苷是此香椿叶黄酮类化合物的主要组分,含量是其他4 种单体总量的2 倍左右。

关键词:香椿叶;黄酮;大孔树脂;纯化;高效液相色谱

苗修港, 余翔, 张贝贝, 等. NKA-9大孔树脂纯化香椿叶黄酮类物质工艺优化[J]. 食品科学, 2016, 37(8): 32-38. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608006. http://www.spkx.net.cn

MIAO Xiugang, YU Xiang, ZHANG Beibei, et al. Purification of flavonoids from Toona sinensis leaves with NKA-9 macroporous resin[J]. Food Science, 2016, 37(8): 32-38. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608006. http://www.spkx.net.cn

香椿(Toona sinensis)属楝科香椿属,是一种落叶乔木,广泛分布于黄河与长江流域,是我国特有的木本蔬菜。香椿嫩芽及嫩叶香气浓郁,营养丰富,味道鲜美,深受人们欢迎,但香椿老叶大多未被合理利用而废弃。研究表明香椿叶提取物具有抗氧化、抗菌、降血糖、降血脂、抗癌、抗病毒等功效 [1-6],这些功效可能主要来自于香椿叶中的黄酮类,包括山奈酚、芦丁、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、黄芪苷、槲皮素-3-O-(2″-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷等化合物 [1,7]。现阶段以黄酮类物质含量为指标,研究香椿叶提取物的制备工艺较多,主要有索氏提取法、浸渍法、超声辅助法、微波辅助法、超临界提取法等 [3,8-10]。但涉及香椿叶黄酮的纯化方法,目前研究还较少,对于大孔树脂纯化现阶段的研究,或选择树脂类型比较单一,未全面考虑其他类型树脂,或树脂条件分析不全面,未讨论香椿叶黄酮的主要组成成分及大孔树脂纯化对单体的影响 [11-12]。因此,研究香椿叶黄酮的富集方法,对科学利用香椿资源,提高香椿附加值有重要意义。

植物活性成分提取物的富集纯化方法主要有双水相法、膜富集法、大孔树脂法等。双水相法具有萃取时间短、萃取效率高的优点,但需要用高聚物和无机盐且后续盐的脱除较困难,不适宜大规模工业化生产。膜富集法是根据分子形状和相对分子质量大小,通过膜孔的筛选和吸附作用实现富集,操作简单、环保卫生,但对设备要求较高,成本较大 [13-14]。大孔树脂具有操作简单、纯化效率高、稳定性好、再生处理简便、成本低、无污染等优点,被广泛应用于天然产物的提取与分离 [15-17]

本研究以香椿老叶乙醇提取物为实验材料,以黄酮吸附率与解吸率为指标,比较了9 种大孔树脂的吸附解吸性能,筛选出适宜的大孔树脂,通过静态与动态吸附解吸实验优化大孔树脂分离纯化香椿叶黄酮的工艺条件,并采用高效液相色谱分析研究了大孔树脂纯化前后香椿叶黄酮的组成成分及其变化,以期获得纯度较高、组成成分明确的香椿叶黄酮类化合物,为香椿叶黄酮工业化生产提供依据,亦可为开发天然黄酮类产品提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香椿叶于2014年8月采自陕西省眉县,阴干粉碎过80 目筛。

XAD-7、HPD-100、AB-8、HPD-400、D101、D4020、NKA-9、NKA-2和HPD-500 9 种大孔树脂西安蓝晓科技有限公司;槲皮素、芦丁、槲皮苷、金丝桃苷、阿福豆苷、异槲皮苷 美国Sigma公司;甲醇和乙腈均为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1800紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;SKY-2102C恒温振荡培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司;R1001旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司;BG-200恒温混匀仪 杭州朗基科学仪器有限公司;AUY-220电子天平 日本岛津公司;SK2510LHC超声波清洗机 上海科导超声仪器有限公司;1260型高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香椿叶提取物的制备

称取50 g香椿叶粉,于超声功率175 W、乙醇体积分数60%、料液比1∶14(g/mL)、温度50 ℃条件下,超声提取40 min,过滤,滤渣再按前述条件重复提取1 次,过滤,合并2次滤液,于温度40 ℃条件下减压浓缩,得香椿叶提取物。

1.3.2 黄酮含量的测定

采用Al(NO 33显色法 [18]。取1.0 mL受试液,加入4.4 mL 60%乙醇溶液和0.3 mL 5% NaNO 2溶液,混匀;6 min后,加入0.3 mL 10% Al(NO 33溶液;再经6 min后,加入4 mL 1.0 mol/L NaOH溶液,放置15 min,以60%乙醇溶液为空白,于510 nm波长处测吸光度。以不同质量浓度槲皮素为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,量品黄酮含量以相当于槲皮素毫克数计。标准曲线方程为y=5.339 5x+0.009 1(R 2=0.999 7),黄酮质量浓度在0~0.241 8 mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

1.3.3 大孔树脂的预处理

参考Xiao Ruan等 [19]的方法。用蒸馏水洗去破碎大孔树脂及杂质,然后于95%乙醇溶液浸泡24 h,用蒸馏水洗至无醇味。将大孔树脂湿法上柱(Ф30 mm×360 mm),分别用4 BV 5% NaOH溶液和2% HCl溶液以3 BV/h的速率淋洗大孔树脂以除去残留杂质,提高吸附性能。最后用蒸馏水洗至中性,然后于70 ℃条件下烘干至质量恒定备用。

1.3.4 大孔树脂静态吸附、解吸实验

1.3.4.1 大孔树脂的筛选

分别称取上述9 种大孔树脂各1 g(以干质量计)于100 mL锥形瓶中,加入30 mL 7 mg/mL香椿叶提取物水溶液,振荡吸附24 h(30 ℃、130 r/min)后,测定吸附平衡后溶液中黄酮质量浓度,即为吸附平衡液黄酮质量浓度。在上述吸附饱和的大孔树脂中加入30 mL 70%乙醇溶液振荡解吸24 h(30 ℃、130 r/min),过滤,测定滤液中黄酮质量浓度,此即为解吸液黄酮质量浓度。按公式(1)~(4)计算吸附量、吸附率、解吸率和回收率:

式中:Γ e为吸附量/(mg/g);E e为吸附率/%;D d为解吸率/%;R为回收率/%;C 0为起始量液黄酮质量浓度/(mg/mL);C e为吸附平衡液黄酮质量浓度/(mg/mL);V 0为加入量液体积/mL;M为大孔树脂干质量/g;C d为解吸液黄酮质量浓度/(mg/mL);V d为解吸液体积/mL。

1.3.4.2 大孔树脂的静态吸附动力学

按照1.3.4.1节所述方法,振荡吸附并测定0.5、1、2、5、8、10、24 h的吸附平衡液中黄酮质量浓度,绘制上述优选得到的大孔树脂的静态吸附动力学曲线。

1.3.4.3 上量液质量浓度对大孔树脂吸附效果的影响

用蒸馏水将香椿叶提取物配制成质量浓度为1、4、7、10、13、16 mg/mL的上量液,各取30 mL,分别加至经预处理后的1.000 g(以干质量计)优选得到的大孔树脂,振荡吸附(30 ℃、130 r/min、24 h),测定各吸附平衡液黄酮质量浓度,计算吸附率。

1.3.4.4 上量液pH值对大孔树脂吸附效果的影响

准确称取1.000 g优选得到的大孔树脂于100 mL锥形瓶中,加入30 mL 7 mg/mL上量液,用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液调节上量液pH值分别至2、3、4、5、6、7和9。振荡吸附(30 ℃、130 r/min、24 h),测定各吸附平衡液黄酮质量浓度,计算吸附率。

1.3.4.5 上量液中NaCl浓度对大孔树脂吸附效果的影响

准确称取1.000 g优选得到的大孔树脂于100 mL锥形瓶中,加入30 mL 7 mg/mL上量液,并调节上量液中NaCl浓度分别为0、1、3、5 mol/L,振荡吸附(30 ℃、130 r/min、24 h),测定各吸附平衡液黄酮质量浓度,计算吸附率。

1.3.4.6 解吸剂乙醇体积分数对大孔树脂解吸效果的影响

将吸附饱和的大孔树脂除去残留液后,分别加入30 mL体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液,振荡解吸(30 ℃、130 r/min、24 h),测定各解吸液黄酮质量浓度,计算解吸率。

1.3.4.7 解吸液pH值对大孔树脂解吸效果的影响

将吸附饱和的大孔树脂除去残留液后,加入30 mL 60%乙醇溶液,再分别用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液调节pH值至2、3、4、5、6、7和8,振荡解吸(30 ℃、130 r/min、24 h),测定各解吸液黄酮质量浓度,计算解吸率。

1.3.5 大孔树脂动态吸附、洗脱实验

1.3.5.1 上量流速和上量体积的确定

采用湿法装柱,将25 mL优选得到的大孔树脂装入玻璃层析柱(Ф16 mm×480 mm)。取一定体积质量浓度为7 mg/mL的香椿叶提取物,分别以1、2、3 BV/h的流速通过大孔树脂柱,以每7 mL为一组收集流出液,并测定流出液黄酮质量浓度,绘制动态吸附穿透曲线,找出泄漏点 [20],得到适宜的上量流速和上量体积。

1.3.5.2 洗脱流速和洗脱体积的确定

按前述静态实验结果及优化的上量流速,将上量液上柱,待动态吸附完全后,用蒸馏水冲洗至无色并用苯酚-浓硫酸法检测至无糖,取一定体积60%乙醇溶液分别以1、2、3 BV/h流速洗脱,每7 mL为一组收集流出液,并测定流出液黄酮质量浓度,绘制NKA-9动态洗脱曲线。

1.3.6 纯化前后香椿叶提取物黄酮含量的比较

按照上述优化得到的大孔树脂纯化香椿叶黄酮的工艺条件,纯化香椿叶提取物后,分别测定纯化前后黄酮含量,并采用高效液相色谱法比较纯化前后黄酮类单体物质含量的变化。

高效液相色谱法的工作条件:采用C 18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以水、乙腈为流动相,梯度洗脱,流速为0.8 mL/min,检测波长为254 nm。洗脱梯度如下:0 min,80%水,20%乙腈;50 min,75%水,25%乙腈;55 min,0%水,100%乙腈;70 min,0%水,0%乙腈,100%甲醇。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂静态吸附、解吸实验结果2.1.1 大孔树脂的筛选

表1 不同型号大孔树脂对香椿叶黄酮的吸附及解吸性能
Table 1 Adsorption and desorption performance of different kinds of macroporous resins %

注:结果表示为 同列上标不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

大孔树脂型号含水量大孔树脂类别吸附率解吸率回收率XAD-776.89±2.17 d非极性98.01±1.06 b77.42±2.03 abcd75.87±2.14 bcdHPD-10075.41±2.38 b非极性99.01±0.76 ab75.68±2.37 bcde74.94±2.36 bcdeAB-881.99±2.26 a弱极性99.08±0.54 ab74.87±2.16 cde74.18±2.07 cdeHPD-40042.97±1.29 b非极性61.50±1.93 c67.59±1.89 f41.57±1.35 fD10175.37±2.06 b非极性98.64±0.81 ab79.03±2.44 ab77.95±2.28 abcdD402077.73±2.11 b非极性99.96±0.02 a73.84±2.16 de73.81±2.06 eNKA-258.41±1.79 c极性98.70±0.83 ab72.55±1.94 ae71.61±2.13 eHPD-50075.99±2.34 b非极性99.52±0.27 ab78.84±2.26 bc78.45±1.97 abNKA-975.26±2.41 b极性99.20±0.58 ab80.92±2.31 a80.28±2.38 a

大孔树脂对黄酮类化合物的吸附解吸性能与其本身的极性、空间结构、含水量有密切关系。由表1可知,吸附性能较好且吸附率达到99%以上的大孔树脂有HPD-100、AB-8、D4020、HPD-500、NKA-9,其中NKA-9大孔树脂对香椿叶黄酮的解吸率和回收率分别达80.92%和80.28%,显著高于其他5 种大孔树脂(P<0.05),这是因为黄酮类化合物含有酚羟基和糖苷键,具有一定极性。综合考虑吸附率、解吸率及回收率,NKA-9大孔树脂适于香椿叶黄酮的纯化。

2.1.2 NKA-9型大孔树脂静态吸附动力学

图1 NKA-9型大孔树脂静态吸附动力学曲线
Fig.1 Static desorption curve of NKA-9 resin

由图1可以看出,在0~3 h范围内,NKA-9大孔树脂对香椿叶黄酮吸附量随时间的延长而迅速增大,在3 h时吸附量接近平衡,表明NKA-9大孔树脂可以快速吸附香椿叶黄酮类物质,节约时间,且吸附效果好,能满足工业化生产要求。

2.1.3 上量液质量浓度对大孔树脂吸附效果的影响

图2 上样液质量浓度对大孔树脂吸附效果的影响
Fig.2 Effect of sample concentration on the adsorption efficiency

上量液质量浓度过低会使大孔树脂的纯化效率降低,纯化时间较长,反之上量液质量浓度过高会导致大孔树脂吸附不充分,浪费材料,因此需要选择合适的上量质量浓度 [21]。由图2可知,随着上量液质量浓度的增大,大孔树脂对香椿叶黄酮的吸附量迅速增加,当上量液质量浓度大于7 mg/mL时,黄酮吸附量的增加变缓,质量浓度10 mg/mL时大孔树脂对香椿叶黄酮的吸附接近饱和。其原因是上量液中黄酮质量浓度越高,单位表面积内与大孔树脂接触量亦越大,吸附量也就越大,当黄酮质量浓度继续增加,传质速率变慢,大孔树脂表面吸附趋于饱和,部分黄酮未被吸附就流出来,泄漏提前 [22]。因此选取上量液质量浓度为7 mg/mL。

2.1.4 上量液pH值对大孔树脂吸附效果的影响

上量液pH值会影响黄酮类物质的电离程度,改变其存在形式和溶解度,进而影响黄酮类化合物与大孔树脂之间的作用力,从而影响大孔树脂对黄酮类化合物的吸附效果 [23]。由图3可知,随着上量液pH值的升高,大孔树脂对香椿叶黄酮的吸附率呈先升高后降低的趋势。上量液pH值在2~4范围内,随着pH值升高,黄酮吸附率增加,pH值为4时黄酮吸附率达最高值(98.42%)。上量液pH值大于4,大孔树脂对香椿叶黄酮的吸附率随pH值的升高而降低。这是因为当pH值较小时,黄酮类物质的糖苷键易水解,影响大孔树脂对黄酮类的吸附;另外,由于黄酮类化合物含酚羟基,呈弱酸性,因此随着pH值升高,黄酮类化合物在酸性条件下以分子状态存在,主要借助范德华力与大孔树脂进行物理吸附;而在碱性条件下,黄酮类化合物以离子状态存在,不易与大孔树脂发生物理吸附作用 [24]。方差分析表明,上量液pH值为2、3、4、5、6时,黄酮解吸率无显著性差异,香椿叶提取物原液pH值为5.2,因而不需要调节上量液pH值。

图3 上样液pH值对大孔树脂吸附效果的影响
Fig.3 Effect of sample pH on the adsorption efficiency of resin

2.1.5 上量液中NaCl浓度对大孔树脂吸附效果的影响

图4 上样液中NaCl浓度对大孔树脂吸附效果的影响
Fig.4 Effect of NaCl concentration on the adsorption efficiency of resin

上量液中加入NaCl会改变溶液的离子强度,不同离子强度会影响大孔树脂对目标物质的吸附 [25]。由图4可知,上量液中加入一定浓度NaCl,可以明显提高大孔树脂对香椿叶黄酮类化合物的吸附率,当NaCl浓度达到3 mol/L时,黄酮吸附率达到最高,为99.7%,与未加NaCl相比,黄酮吸附率提高了3%(P<0.05),再进一步增加NaCl浓度,黄酮吸附率反而下降,因此上量液中以NaCl浓度3 mol/L为宜。

2.1.6 解吸剂乙醇体积分数对大孔树脂解吸效果的影响

由图5可知,乙醇体积分数过小,极性偏大,解吸效果差。随着乙醇体积分数的增加,黄酮解吸率迅速增大,当乙醇体积分数为60%时,黄酮解吸率最高为67.23%,再继续增加乙醇体积分数,解吸率无明显变化。考虑到乙醇体积分数越大,即极性越小,容易将杂质洗脱下来 [26],且乙醇体积分数越大,挥发性越强,增加溶剂成本,故选择60%乙醇溶液为解吸剂。

图5 乙醇体积分数对大孔树脂解吸效果的影响
Fig.5 Effect of eluent concentration on the desorption efficiency

2.1.7 解吸液pH值对大孔树脂解吸效果的影响

图6 解吸液pH值对大孔树脂解吸效果的影响
Fig.6 Effect of eluent pH on the desorption efficiency

由图6可知,解吸液在酸性至中性条件下,随着pH值的升高,香椿叶黄酮解吸率增加,当pH值升至6时,黄酮解吸率达最大值,为76.52%。pH值大于6,黄酮解吸率明显下降,这与香椿叶黄酮提取物呈弱酸性有密切关系。故选取解吸液pH值为6。

2.2 动态吸附、洗脱实验结果

2.2.1 上量流速和体积的确定

图7 NKA-9大孔树脂对香椿叶黄酮动态穿透曲线Fig.7 Dynamic breakthrough curves of NKA-9 resin

通常依据泄漏点出现的时间来确定上量流速,泄漏点出现时间愈早,表明上量液经大孔树脂吸附后愈早出现吸附不充分的现象。由图7可知,上量流速为1 BV/h时,泄漏点(80 mL)出现较晚,而当上量流速为3 BV/h时,泄漏点(50 mL)出现最早,流速为2 BV/h时泄漏点(70 mL)出现时间居中,这是因为增加上量流速,量品在大孔树脂柱中停留的时间缩短,会导致其尚未及时充分吸附量品,量品较快地通过 [27]。因此,较慢流速有利于大孔树脂对量品的吸附,然而流速过慢亦会导致生产效率低,周期延长。综合考虑上量流速应选择2 BV/h。上量体积过大,由于大孔树脂吸附不完全会导致物料损失较多,且大孔树脂再生困难,容易中毒,影响大孔树脂的重复利用 [28]。反之,上量体积过小会使大孔树脂利用不充分,增加成本,同时降低效率。因此,应选择合适的上量体积。由图7大孔树脂动态穿透曲线可知,当上量流速2 BV/h、上柱量品体积70 mL时,流出液质量浓度达到上量液质量浓度的10%,因此确定上量体积为70 mL。

2.2.2 洗脱流速的确定

图8 洗脱流速对洗脱效果的影响
Fig.8 Effect of elution rate on the elution efficiency

洗脱流速是影响洗脱时间与目标物质回收率的重要因素,洗脱流速太慢会延长生产周期,反之,过快会导致洗脱剂还未来得及带走吸附在大孔树脂上的目标物质就离开大孔树脂,洗脱不完全 [28]。以60%乙醇溶液为洗脱剂,对吸附平衡后的大孔树脂洗脱,由图8可知,洗脱流速为2 BV/h时黄酮洗脱率显著高于其他两个洗脱流速(P<0.05)。因而选择2 BV/h的洗脱流速进行洗脱。

2.2.3 洗脱体积的确定

图9 NKA-9大孔树脂对香椿叶黄酮的洗脱曲线Fig.9 Desorption curve of NKA-9 resin

由图9可以看出,随着洗脱剂(60%乙醇溶液)体积的增加,洗脱得到的香椿叶黄酮质量浓度逐渐升高。当洗脱体积为38 mL时,洗脱得到的黄酮质量浓度达到最大值。之后再增加洗脱体积,洗脱得到的黄酮质量浓度逐渐下降,洗脱体积为80 mL时,黄酮质量浓度几乎不变,说明富集的黄酮已基本被洗脱完全,故洗脱剂适宜体积为80 mL。

2.3 大孔树脂纯化前后香椿叶黄酮含量的比较

2.3.1 黄酮含量的比较

以本实验选取的NKA-9大孔树脂纯化香椿叶黄酮的最佳工艺条件:70 mL 7 mg/mL香椿叶提取物(含3 mol/L NaCl)为上量液,以流速为2 BV/h上量,用80 mL 60%乙醇溶液(pH6)为洗脱剂,以2 BV/h的速率洗脱,纯化香椿叶提取物。结果表明,经NKA-9大孔树脂纯化后香椿叶黄酮含量由81.272 3 mg/g增加到219.970 2 mg/g,黄酮含量为纯化前的2.71 倍。

2.3.2 NKA-9大孔树脂处理对香椿叶黄酮提取物中黄酮类单体化合物含量的影响

表2 经NKA-9大孔树脂处理前与处理后香椿叶黄酮类单体物质含量
Table 2 Contents of flavonoid compounds in extracts before and after purification
mg/g

处理芦丁金丝桃苷异槲皮苷槲皮苷阿福豆苷纯化前3.312 3±0.091 1 b1.989 6±0.049 4 b6.121 7±0.040 7 b25.548 4±1.226 1 b5.322 4±0.127 7 b纯化后10.776 1±0.289 9 a5.193 3±0.339 6 a19.623 4±0.313 0 a82.111 8±1.283 2 a15.001 0±0.247 3 a

图10 经NKA-9大孔树脂纯化前后香椿叶黄酮类物质高效液相色谱图
Fig.10 HPLC chromatograms of flavonoids in extracts before and after purification

由表2和图10可知,香椿叶提取物经NKA-9大孔树脂纯化后,芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、阿福豆苷5 种黄酮类单体物质含量均提高到纯化前的3 倍以上,表明NKA-9大孔树脂可有效地分离纯化香椿叶黄酮类化合物。且该香椿叶黄酮类化合物主要组分为槲皮苷,其含量为其他4 种单体总和的2 倍左右。

3 结 论

本实验采用9 种大孔树脂对香椿叶黄酮类化合物进行纯化,结果表明NKA-9大孔树脂适宜于纯化香椿叶黄酮类物质,其最佳工艺条件为:70 mL 7 mg/mL香椿叶黄酮提取物(不需调pH值,含3 mol/L NaCl)为上量液,上量流速2 BV/h,用80 mL 60%乙醇溶液(pH 6)以2 BV/h的流速洗脱。在此工艺条件下,香椿叶提取物中黄酮含量由81.272 3 mg/g增加到219.970 2 mg/g,提高了1.71 倍。纯化后5 种黄酮类单体物质含量均明显增加,是纯化前的3 倍以上,此香椿叶黄酮类化合物主要组分为槲皮苷,其含量是其他4 种单体物质含量的2 倍左右。该工艺条件科学合理,适用于从香椿老叶中获得天然的纯度较高的组成成分明确的黄酮类化合物,有望用于香椿叶黄酮类化合物规模化生产。

参考文献:

[1] WANG Kaijin, YANG Chongren, ZHANG Yingjun. Phenolic antioxidants from Chinese toon (fresh young leaves and shoots of Toona sinensis)[J]. Food Chemistry, 2007, 101: 365-371. DOI:10.1016/j.foodchem.2006.01.044.

[2] WU C C, LIU C H, CHANG Y P, et al. Effects of hot-water extract of Toona sinensis on immune response and resistance to Aeromonas hydrophila in Oreochromis mossambicus[J]. Fish and Shellfish Immunology, 2010, 29: 258-263. DOI:10.1016/j.fsi.2010.04.021.

[3] HSIEH T J, TSAI Y H, LIAO M C, et al. Anti-diabetic properties of non-polar Toona sinensis extract prepared by supercritical-CO 2fluid[J]. Food Chemical Toxicology, 2012, 50: 779-789. DOI:10.1016/ j.fct.2011.12.023.

[4] 张京芳, 张强, 陆刚, 等. 香椿叶提取物对高血脂症小鼠脂质代谢的调节作用及抗氧化功能的影响[J]. 中国食品学报, 2007, 7(4): 3-7. DOI:10.3969/j.issn.1009-7848.2007.04.002.

[5] YANG Shengjie, ZHAO Qi, XIANG Hongmei, et al. Antiproliferative activity and apoptosis-inducing mechanism of constituents from Toona sinensis on human cancer cells[J]. Cancer Cell International, 2013, 13: 1-12. DOI:10.1186/1475-2867-13-12.

[6] CHEN C J, MARTIN M, HSU H K, et al. Toona sinensis Roem tender leaf extract inhibits SARS coronavirus replication[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2008, 120: 108-111. DOI:10.1016/ j.jep.2008.07.048.

[7] CHENG Kawing, YANG R Y, TSOU S C S, et al. Analysis of antioxidant activity and antioxidant constituents of Chinese toon[J]. Journal of Functional Foods, 2009, 1: 253-259. DOI:10.1016/ j.jff.2009.01.013.

[8] 陈丛瑾, 黄克瀛, 杨国恩, 等. 香椿叶总黄酮的微波提取及其清除DPPH自由基能力的研究[J]. 中国食品学报, 2008, 8(4): 33-38. DOI:10.3969/j.issn.1009-7848.2008.04.006.

[9] 陈丛瑾, 黄克瀛, 杨国恩. 香椿叶总黄酮不同提取方法的比较[J]. 食品研究与开发, 2008, 29(3): 57-60. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2008.03.018.

[10] 王昌禄, 江慎华, 陈志强, 等. 香椿老叶总黄酮提取工艺及其抗氧化活性的研究[J]. 北京林业大学学报, 2008, 30(4): 28-33. DOI:10.3321/j.issn:1000-1522.2008.04.006.

[11] 张京芳, 王冬梅. 应用大孔吸附树脂分离纯化香椿叶总黄酮[J].园艺学报, 2007, 34(6): 1585-1588. DOI:10.3321/j.issn:0513-353x.2007.06.042.

[12] 陈丛瑾. 香椿有效成分的提取纯化和生物活性研究[D]. 长沙: 中南林业科技大学, 2010.

[13] 徐志红, 肖泽仪, 李磊, 等. 超滤深度提纯银杏黄酮[J]. 精细化工,2004, 21(2): 112-114. DOI:10.3321/j.issn:1003-5214.2004.02.009.

[14] LIU Yu, HAN Juan, WANG Yun, et al. Selective separation of flavones and sugars from honeysuckle by alcohol/salt aqueous twophase system and optimization of extraction process[J]. Separation and Purification Technology, 2013, 118: 776-783. DOI:10.1016/ j.seppur.2013.08.018.

[15] 汪洪武, 刘艳清. 大孔吸附树脂的应用研究进展[J]. 中药材, 2005,28(4): 353-356. DOI:10.3321/j.issn:1001-4454.2005.04.040.

[16] 郑红岩, 于华忠, 刘建兰, 等. 大孔吸附树脂对蓝莓花色苷的分离工艺[J]. 林产化学与工业, 2014, 34(4): 59-65. DOI:10.3969/ j.issn.0253-2417.2014.04.010.

[17] 吴彩娥, 方升佐, 冯宗帅, 等. 青钱柳叶总黄酮大孔树脂纯化工艺[J].农业机械学报, 2009, 40(6): 133-137.

[18] BAO Jinsong, CAI Yizhong, SUN Mei, et al. Anthocyanins,Flavonols, and free radical scavenging activity of Chinese bayberry(Myrica rubra) extracts and their color properties and stability[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(6): 2327-2332. DOI:10.1021/jf048312z.

[19] XIAO Ruan, ZHAN Limei, GAO Xingxing, et al. Separation and purification of flavonoid from Taxus remainder extracts free of taxoids using polystyrene and polyamide resin[J]. Journal of Separation Science, 2013, 36: 1925-1934. DOI:10.1002/jssc.201201189.

[20] WANG Pengfei, SHENG Zunlai, HAN Qiang, et al. Enrichment and purification of total flavonoids from flos populi extracts with macroporous resins and evaluation of antioxidant activities in vitro[J]. Journal of Chromatography B, 2014, 945/946(2): 68-74. DOI:10.1016/ j.jchromb.2013.11.033.

[21] 吴海霞, 吴彩娥, 李婷婷, 等. 大孔树脂纯化银杏叶黄酮的研究[J]. 现代食品科技, 2013, 29(12): 2964-2969. DOI:10.13982/ j.mfst.1673-9078.2013.12.012.

[22] 娄嵩, 刘永峰, 白清清, 等. 大孔吸附树脂的吸附机理[J]. 化学进展,2012, 24(8): 1427-1436.

[23] LI Cen, ZHENG Yuanyuan, WANG Xiaofei, et al. Simultaneous separation and purification of flavonoids and oleuropein from Olea europaea L. (olive) leaves using macroporous resin[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2011, 91: 2826-2834. DOI:10.1002/ jsfa.4528.

[24] 王冬梅, 李玫, 杨秀萍, 等. 大孔吸附树脂提取分离翅果油树叶总黄酮的研究[J]. 西北植物学报, 2003, 23(9): 1621-1624. DOI:10.3321/ j.issn:1000-4025.2003.09.028.

[25] 孙瑛, 朱家文, 陈葵, 等. 离子强度与温度对大孔树脂吸附红霉素A的影响[J]. 华东理工大学学报(自然科学版), 2009, 35(1): 15-20. DOI:10.14135/j.cnki.1006-3080.2009.01.014.

[26] 吴娜, 张瑞巧, 余婷, 等. 大孔树脂分离纯化艾蒿黄酮的研究[J]. 食品科技, 2008, 33(1): 160-163. DOI:10.3969/ j.issn.1005-9989.2008.01.044.

[27] JIA Dongdong, LI Shufen, GU Zhipeng. Preparative isolation of flavonoids from mulbery (Morus alba L.) leaves by macroporous resin adsorption[J]. Journal of Food Process Engineering, 2011, 34: 1319-1337. DOI:10.1111/j.1745-4530.2009.00427.

[28] 杨芙莲, 夏银, 任蓓蕾. 大孔树脂对甜荞麦壳类黄酮的纯化研究[J]. 食品科技, 2009, 34(1): 135-139. DOI:10.13684/j.cnki. spkj.2009.01.006.

Purification of Flavonoids from Toona sinensis Leaves with NKA-9 Macroporous Resin

MIAO Xiugang, YU Xiang, ZHANG Beibei, ZHANG Jingfang *, LIANG Junbin
(College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Abstract:In order to find the most appropriate macroporous resin to purify total flavonoids from Toona sinensis leaf extract,the adsorption and desorption performance of nine kinds of macroporous resins for flavonoids from Toona sinensis leaves were investigated based on adsorption and desorption ratios, and kinetic studies of the static adsorption of flavonoids were also performed. NKA-9 resin was found to be suitable for the purification of total flavonoids from Toona sinensis leaves. By using dynamic adsorption and desorption experiments, the optimum purification conditions were obtained as follows: 70 mL of 7 mg/mL Toona sinensis leaf extract (containing 3 mol/L NaCl) was loaded onto the column at a flow rate of 2 BV/h and eluted with 80 mL of 60% ethanol (pH 6) at a flow rate of 2 BV/h. Under these conditions, the content of total flavonoids was increased from 81.272 3 to 219.970 2 mg/g. The results of high performance liquid chromatography (HPLC) analysis indicated that the contents of rutin, hyperoside, isoquercitrin, quercitrin and afzelinare were increased by more than 3 folds,respectively, compared with those before purification. The approach presented in this study enables effective enrichment of total flavonoids from Toona sinensis leaves. Quercitrin, which is two times more abundant than four other compounds, is the main flavonoid compound from Toona sinensis leaves.

Key words:Toona sinensis leaves; flavonoids; macroporous resin; purification; high performance liquid chromatography (HPLC)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608006

中图分类号:TS201.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)08-0032-07

收稿日期:2015-08-21

基金项目:公益性行业(林业)科研专项(201304811);国家自然科学基金面上项目(31071584)

作者简介:苗修港(1989—),男,硕士研究生,研究方向为植物资源化学与生物活性物质。E-mail:miaoxiugang678@163.com

*通信作者:张京芳(1965—),女,教授,博士,研究方向为食品资源精深加工及功能食品。E-mail:z_jf008@163.com

引文格式: