枇杷叶多糖酶法提取工艺优化及其离子交换层析纯化

何传波,魏好程,熊何健*,吴国宏

(集美大学食品与生物工程学院,福建 厦门 361021)

摘 要:单因素试验和响应面试验得到酶法提取枇杷叶多糖最佳条件为提取时间2.95 h、提取温度41 ℃、酶用量15.6 mg/g,多糖提取率为8.03%。研究枇杷叶多糖在离子交换填料DEAE Sepharose CL-6B上的吸附行为,考察缓冲液pH值和离子强度对吸附等温线的影响。结果表明,在实验范围内,吸附平衡数据符合单分子层吸附的Langmuir方程,枇杷叶多糖在DEAE-Sepharose CL-6B上的吸附量随着缓冲液pH值的上升而增加,低离子强度的缓冲液有利于多糖的吸附。实验确定枇杷叶多糖离子交换柱层析进量条件为pH 8.0条件下,选取不含NaCl的缓冲液,通过离子交换柱层析后枇杷叶多糖被分为3 个组分,得率分别为32.66%、1.22%和3.12%。

关键词:枇杷叶多糖;酶解辅助;提取;离子交换层析

何传波, 魏好程, 熊何健, 等. 枇杷叶多糖酶法提取工艺优化及其离子交换层析纯化[J]. 食品科学, 2016, 37(8): 45-50.

HE Chuanbo, WEI Haocheng, XIONG Hejian, et al. Optimization of enzymatic extraction of polysaccharides from loquat leaves and purification by ion exchange chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(8): 45-50. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608008. http://www.spkx.net.cn

枇杷叶又名巴叶、芦橘叶,具有平咳祛痰的功效,对慢性支气管炎具有一定的治疗作用。有多篇报道 [1-3]证实,枇杷叶中的枇杷苷、乌苏酸、总三萜酸均能明显延长二氧化硫气体及枸橼酸喷雾所致豚鼠咳嗽的潜伏期,并明显减少咳嗽次数。目前对枇杷叶的利用较为粗放,主要是晒干后作为药用或食用原料,如枇杷露、枇杷酒、枇杷蜜等 [4],有针对性地对枇杷叶中活性成分的研究相对较少,如果不能确定其药理活性的物质基础,对于今后枇杷叶的应用具有很大的盲目性。由于枇杷叶的平咳祛痰功效可能与其机体免疫调节功能密切相关,而多糖物质的一个主要活性便是免疫调节 [5-8],因此,有必要对枇杷叶中多糖组分进行研究,以期对枇杷叶多糖药用价值的开发提供相关的理论依据。

常规多糖提取采用水提醇沉的方法,具有能耗高、提取率低等缺点,酶工程技术是近年来发展起来的新型破壁提取方法,与传统方法相比具有节能、快速、条件温和、提取效率高等优点,已广泛用于植物有效成分的提取 [9-11]。本研究以枇杷叶为原料,采用纤维素酶法辅助提取其中的多糖组分,并通过离子交换柱层析对提取的多糖成分进行初步纯化,研究结果不仅可以为后续的结构分析及构效关系研究提供数据支持,而且对枇杷叶多糖在食品、医药领域中的深层次开发利用具有一定的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枇杷叶摘于福建莆田,鲜叶干燥后备用;纤维素酶(酶活力>15 IU/mg) 广州酶制品厂;二乙氨基乙基(diethylaminoethyl,DEAE)-琼脂糖凝胶(Sepharose CL-6B)填料 美国GE公司;Tris(进口分装)上海伯奥生物技术有限公司;苯酚、硫酸、3,5-二硝基水杨酸、乙醇、氯仿等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

ZD-85气浴恒温振荡器 常州市国立试验设备研究所;WK-200B高速药物粉碎机 青州市精诚机械有限公司;UV-8000紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;BS/BT电子天平 德国赛多利斯股份公司;RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;JDG-0.2T真空冻干机 兰州科近真空冻干技术有限公司;TDL-5离心机 上海安亭科学仪器厂;3K3D高速冷冻离心机 德国Sigma公司;MSI微型漩涡振荡器 广州科技实验室技术有限公司;pH211台式酸度测定仪 北京哈纳科技有限公司;BTi-100蠕动泵、BSZ-100-LCD自动部份收集器 上海琪特分析仪器有限公司;TH-1000A梯度混合器 上海沪西分析仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 枇杷叶多糖的制备

枇杷叶粉碎过筛,经乙醚回流脱酯后,使用纤维素酶法浸提2 次,于90 ℃水浴加热10 min灭酶,抽滤,合并滤液,减压浓缩,加入5 倍体积的95%乙醇溶液沉淀,离心,按一定的体积比加入Sevag试剂脱蛋白5 次,活性炭脱色,浓缩,冷冻干燥,得到枇杷叶粗多糖量品,将多糖量品溶解,进行离子交换柱层析,收集不同洗脱组分,浓缩,透析,冻干,得到纯化的枇杷叶多糖量品 [12-13]

1.3.2 多糖提取率的计算

总糖含量测定采用苯酚-硫酸法;还原糖含量的测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法 [14];多糖提取率以1 g干品(粉末或者片状原料)中提取出多糖总量的百分含量表示,计算公式如下:

式中:0.9为单糖折算为葡萄糖的换算系数。

1.3.3 枇杷叶多糖提取单因素试验

为确定枇杷叶多糖的酶法提取工艺,通过单因素试验研究酶用量、提取温度、提取时间、料液比、颗粒度和pH值对枇杷叶多糖提取率的影响。

1.3.4 枇杷叶多糖提取的响应面试验

在单因素试验基础上,选取枇杷叶多糖的提取温度、提取时间、酶用量3 个因素,以枇杷叶多糖提取率为指标进行响应面试验,优化枇杷叶多糖提取工艺,通过Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行回归分析。其响应面因素与水平如表1所示。

表1 酶法提取响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels used in response surface design for the optimization of enzymatic extraction of polysaccharides

水平因素X 1提取温度/℃X 2提取时间/hX 3酶用量/(mg/g)-130212 0 40316 1 50420

1.3.5 吸附等温线绘制

以不同pH值和NaCl浓度的缓冲液分别配制质量浓度为0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mg/mL的枇杷叶多糖溶液,取2 mL加0.2 g填料,振荡24 h后离心,测定上清液多糖含量。以多糖质量浓度为横坐标,填料的平衡吸附量为纵坐标绘制吸附等温线 [15-16]

2 结果与分析

2.1 酶法提取枇杷叶多糖的单因素试验结果

2.1.1 酶用量对枇杷叶多糖提取率的影响

图1 酶用量对枇杷叶多糖提取率的影响
Fig.1 Effects of enzyme amount on the yield of crude polysaccharides

称取过40 目筛的枇杷叶1 g,料液比1∶20,纤维素酶用量分别为0.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0、20.0、25.0 mg/g,在50 ℃恒温水浴浸提2 h后,高温灭酶、离心过滤,测定吸光度,计算枇杷叶多糖提取率。从图1可看出,当加酶量为15 mg/g时,枇杷叶多糖提取率较高。这是因为随着酶用量的增加,酶与纤维素分子的接触机会增加,在同一时间内,纤维素水解速率提高,致使多糖更快地分离出来 [17]。当底物逐渐被酶分子饱和时,纤维素水解速率达到最大值,多糖提取率也达到最大。继续提高酶用量,可能会由于纤维降解物大量存在,使多糖的溶解变得困难,离心时沉降下来,导致上清液中的多糖提取率降低 [18]

2.1.2 料液比对枇杷叶多糖提取率的影响

图2 料液比对枇杷叶多糖提取率的影响
Fig.2 Effects of solid to solvent ratio on the yield of crude polysaccharides

纤维素酶用量15 mg/g,固定其他条件不变,改变料液比,如图2所示,在料液比为1∶30时,有最大提取率,之后随着溶剂用量增大,提取率呈下降趋势。多糖从植物细胞壁到溶剂中是一个质量浓度差推动的扩散过程,溶剂越多,细胞内外的多糖质量浓度差越大,推动力就越大,扩散到溶剂里的多糖越多。但是从细胞中提取多糖的过程除了简单的扩散过程外,还有受细胞膜结构影响的阻滞扩散过程,并且后一过程是控制整个扩散速率的关健 [19-20]。增加溶剂用量会使得酶质量浓度降低,进而影响到细胞膜结构,这可能就是当溶剂用量增加到一定程度时,再增加溶剂也不会提高溶剂中多糖含量的原因。

2.1.3 颗粒度对枇杷叶多糖提取率的影响

将粉碎后的枇杷叶分别过20、40、60、80、100、 200 目筛,固定其他条件不变,酶解提取,如图3所示,当量品颗粒度较大时,细胞壁破碎不够充分,多糖的溶解受到限制,导致提取率较低。但颗粒过小,由于多糖对量品颗粒的吸附效应增加,离心时与粉末一起沉降下来,导致溶液中的多糖含量也会减少 [21],多糖溶出量与吸附效应的最适结合点应在量品颗粒度60 目。

图3 颗粒度对枇杷叶多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of particle size of loquat leaf powder on the yield of crude polysaccharides

2.1.4 提取温度对枇杷叶多糖提取率的影响

图4 提取温度对枇杷叶多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of crude polysaccharides

如图4所示,固定其他条件不变,多糖提取率随着温度的升高呈现先升后降的变化趋势。酶解反应是一种化学反应,化学反应均以分子运动为基础,纤维素酶水解以酶分子与底物分子的吸附、络合、解离为基础,分子动能与温度直接相关。因此随着温度的升高,酶解反应速率不断提高,多糖提取率增加。但如果温度超过酶反应的最适温度,酶蛋白容易变性,导致纤维素酶失活,使反应速率减慢,故选择提取温度40 ℃为宜。

2.1.5 pH值对枇杷叶多糖提取率的影响

图5 pH值对枇杷叶多糖提取率的影响
Fig.5 Effect of initial hydrolysis pH on the yield of crude polysaccharides

如图5所示,固定其他条件不变,多糖提取率随pH值的升高先升后降。纤维素酶是一种蛋白质,它在水解体系中的解离状态和行为都受到pH值的影响。过高或过低的pH值会影响酶蛋白构象,使酶本身变性或失活;另外,pH值也会影响酶分子侧链上极性基团的解离,改变它们的带电状态,使酶活性中心的结构发生变化,从而影响酶活 [22];再次,pH值还会影响底物分子的解离,从而影响反应速率。本实验选用纤维素酶的适宜pH 4.0。

2.1.6 提取时间对多糖提取率的影响

图6 提取时间对枇杷叶多糖提取率的影响
Fig.6 Effect of hydrolysis time on the yield of crude polysaccharides

如图6所示,固定其他条件不变,酶解反应时间和酶解进行程度有着密切的关系,提取时间太短,酶解不充分,而当酶质量浓度达一定值时,酶促反应时间的延长并不能显著增加浸提率。在初期阶段,随酶解时间的延长,多糖提取率上升较快,到3 h以后多糖提取率反而下降。这可能是由于酶解时间过长引起糖结构变化甚至使大分子多糖的碳环裂解,导致多糖含量降低 [17],因此酶解作用时间选择在3 h较合适。

2.2 酶法提取枇杷叶多糖的响应面试验结果

在单因素试验基础上,选取提取温度(X 1)、提取时间(X 2)和酶用量(X 3)3 个因素,以多糖提取率(Y)为指标进行枇杷叶多糖提取的响应面试验。根据响应面Box-Behnken试验设计原理,得到试验方案和结果如表2所示。

通过Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行多元回归量合及对模型进行方差分析,得到的回归方程为

在该方程中,负的二次项系数表明会有极大值点的出现,可以对所建立的模型进行优化。对该模型进行方差分析,以找出对多糖提取率有显著影响的因素。由表3可知,回归模型F检验极显著(P<0.01),其失量项在α=0.05水平上不显著(P>0.05),相关系数R 2=0.980 0,表明此模型量合程度良好,其响应值的变化有98.00%来源于所选变量,即提取温度、提取时间和酶用量,回归方程能很好地描述各因素与响应值之间的关系。一次项中只有X 2对响应值没有显著影响;二次项 对响应值均有极显著影响(P<0.01),但3 个因素之间的交互项X 1X 2、X 1X 3和X 2X 3对响应值均没有显著影响(P>0.05)。

表2 枇杷叶多糖提取的响应面试验方案与结果
Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

试验号X 1提取温度/℃X 2提取时间/h X 3酶用量/(mg/g)Y多糖提取率/% 1 302164.86 2 502165.61 3 304164.98 4 504165.31 5 303124.92 6 503125.82 7 303204.59 8 503205.28 9 402125.91 10404125.49 11402205.34 12404205.01 13403168.02 14403168.32 15403167.96

表3 回归模型方差分析表
Table 3 Analysis of variance of the regression equation

注:**.差异极显著(P<0.01);*.差异显著(P<0.05)。

方差来源自由度平方和均方和F值P值X 1提取温度10.890.8929.400.002 9** X 2提取时间10.110.113.570.117 6 X 3酶用量10.460.4615.200.011 4* X 1X 210.0440.0441.450.281 7 X 1X 310.0110.0110.360.572 8 X 2X 312.0252.0250.0670.806 4 X1 2 19.429.42310.83<0.000 1** X2 2 16.366.36209.82<0.000 1** 16.736.73221.98<0.000 1**模型921.072.3477.21<0.000 1**残差50.150.030失量30.0770.0260.690.636 7纯误差20.0740.037 X3 2

由软件对试验结果进行分析处理,结合实际情况,得出酶法提取的最优条件为:提取时间2.95 h、提取温度41 ℃、酶用量15.6 mg/g。模型预测的最大提取率为8.13%。在此最优条件下进行3 次重复实验,平均提取率为8.03%,达到理论预测值的98.77%,标准偏差0.008 3%,相对标准偏差为0.003 1,说明验证实验的重复性和精密度良好。而实验平均值与模型预测值相差较小,也证实了模型具有良好的量合性,能较好地预测实际提取率。

2.3 枇杷叶多糖的离子交换柱层析纯化

2.3.1 pH值对吸附等温线的影响

图7 不同pH值条件下枇杷叶多糖在DEAE- Sepharose CL-6B上的吸附等温线
Fig.7 Adsorption isotherms of LLP on DEAE-Sepharose CL-6B at different pH values

表4 不同pH值条件下枇杷叶多糖在DEAE-Sepharose CL-6B上的吸附平衡参数
Table 4 Parameters for LLP adsorption equilibrium on DEAE-Sepharose CL-6B at different pH values

pH5.06.07.08.09.0最大吸附量/(mg/g)0.821.188.3515.2115.40表观解离常数/(mg/g)1.951.971.621.511.38相关系数R 20.9950.9800.9610.9490.940

由图7可以看出,平衡吸附量随多糖质量浓度的增加而增加,低质量浓度时增加较快,与Langmuir吸附等温线的变化类似。Langmuir模型是描述吸附过程最常用的单分子层吸附模型,它形式简单,对于各种类型的吸附,能和实验数据很好吻合,因此受到普遍采用 [23]。量合得到的填料最大吸附量和表观解离常数数据列于表4中,较高的相关系数R 2再次验证了枇杷叶多糖在填料上的吸附行为符合Langmuir吸附模型。图7和表4中的数据都反映出,随着pH值的升高,填料的吸附量有明显增加,而表观解离常数则呈下降趋势,这表明pH值的升高有利于多糖在填料上的吸附。这主要是由于缓冲液pH值会同时影响到多糖电离及填料上荷电基团的解离。pH值较高时,有利于填料上的荷电基团DEAE在水溶液中释放出OH -,使交换容量变小;另一方面,pH值升高,会使多糖所带的负电荷增加,与填料上电荷基团的结合作用增强,使吸附量增加 [24]。本实验中,可能是pH值对多糖电离的影响超过了其对填料本身的影响,因此导致了枇杷叶多糖在填料上的吸附量随pH值升高而明显上升。

2.3.2 离子强度对吸附等温线的影响

如图8所示,不同多糖质量浓度的平衡吸附量均随NaCl浓度增加而下降,表5中的数据也显示,最大吸附量随着NaCl浓度的增加而下降,表观解离常数则呈上升趋势,表明NaCl浓度的增加不利于枇杷叶多糖的吸附。R 2随NaCl浓度增加逐步下降,说明Langmuir模型的预测精度逐渐降低。实验用的离子交换填料以DEAE为功能基,主要是通过离子键结合在基质的表面和孔隙内,缓冲液中的阴离子会使荷电基团与填料基质结合更紧密,降低了与多糖分子结合的荷电基团数目,导致吸附量降低 [25]

图8 不同NaCl浓度条件下枇杷叶多糖在DEAE-Sepharose CL-6B上的吸附等温线
Fig.8 Adsorption isotherms of LLP on DEAE-Sepharose CL-6B at different NaCl concentrations

表5 不同NaCl浓度条件下枇杷叶多糖在DEAE-Sepharose CL-6B上的吸附平衡参数
Table 5 Parameters for LLP adsorption equilibrium on DEAE-Sepharose CL-6B at different NaCl concentrations

NaCl浓度/(mol/L)0.00.51.02.03.0最大吸附量/(mg/g)15.2413.8213.7012.4811.38表观解离常数/(mg/g)1.521.661.912.242.33相关系数R 20.9600.9430.9320.9180.901

2.3.3 离子交换柱层析条件的建立

图9 枇杷叶多糖在DEAE-Sepharose CL-6B上的洗脱曲线
Fig.9 Elution profile of LLP on DEAE Sepharose CL-6B column

比较离子强度线性梯度洗脱(NaCl浓度0~2 mol/L梯度变化)和阶段梯度洗脱(分别配制不同NaCl浓度的缓冲液洗脱)两种方式对枇杷叶多糖的分离效果。结果表明,线性梯度洗脱曲线只能得到一个多糖峰,无法进行有效分离,而在阶段梯度洗脱时,枇杷叶多糖被分为3 个组分。在高离子强度(>1 mol/L)的情况下,没有多糖被洗脱下来,这与静态脱附实验结果一致,因此只要使用中低离子强度的洗脱液即可。据此进行洗脱条件优化实验,配制NaCl浓度为0、0.1、0.5、1.0 mol/L的Tris-HCl缓冲液,分别进行洗脱,层析条件为:Ф26 mm×400 mm层析柱(填料高300 mm),流速1.5 mL/min,收集器以5 min/管收集流出液。苯酚-硫酸法检测,得到最终的洗脱曲线图9。由图9可以看到,使用不含Cl -的Tris-HCl缓冲液获得洗脱组分1,从出峰时间判断,该组分与填料结合最弱,随缓冲液直接流出;在缓冲液Cl -强度分别为0.1、0.5 mol/L时,获得了洗脱组分2和3。按照上述层析条件,进行重复层析操作,得到各组分占初始进量量(1 g)的百分比分别为75.14%、12.56%、1.62%(以多糖含量计算),多糖总回收率为89.33%,然后进行透析、冻干后3 组分的最后得率分别为32.66%、1.22%和3.12%。

3 结 论

单因素试验和响应面试验确定枇杷叶多糖酶法提取的最佳条件为提取时间2.95 h、提取温度41 ℃、酶用量15.6 mg/g,在此条件下,多糖提取率为8.03%。

枇杷叶多糖在离子交换填料上的吸附量随着缓冲液pH值的升高而增大,随着离子强度的增加而减小;在实验质量浓度范围内,吸附平衡数据符合Langmuir方程。pH值的升高有利于多糖在DEAE-Sepharose CL-6B填料上吸附,填料的最大吸附量明显增加;NaCl浓度的增加不利于枇杷叶多糖的吸附,填料的最大吸附量下降,并且随NaCl浓度增加,Langmuir方程的预测精度逐渐降低。

采用阶段梯度洗脱的方式对枇杷叶多糖进行柱层析分级纯化,确定进量条件为pH 8.0、缓冲液NaCl浓度0,通过离子交换柱层析后枇杷叶多糖被分为3 个组分,得率分别为32.66%、1.22%和3.12%。

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Optimization of Enzymatic Extraction of Polysaccharides from Loquat Leaves and Purification by Ion Exchange Chromatography

HE Chuanbo, WEI Haocheng, XIONG Hejian *, WU Guohong
(College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China)

Abstract:Using one-factor-at-a-time method and response surface methodology (RSM), the optimal conditions for enzymatic extraction of polysaccharides from loquat leaves with cellulase were determined as follows: temperature, 41 ℃; time, 2.95 h;and cellulase amount, 15.6 mg/g. Under these optimal conditions, the extraction yield of polysaccharides was 8.03%. The adsorption properties of loquat leaf polysaccharides (LLP) on the ion exchange adsorbent DEAE Sepharose CL-6B were studied. Effects of pH and ion strength on isotherms were examined through static adsorption experiments. The results showed that equilibrium sorption data could be described by the Langmuir isotherm equation with high correlation coefficients, implying the existence of the monomolecular sorption in these systems. After fitting the experimental data with Langmuir equation, several adsorption parameters, which directly reflected the influences of pH and ion strength, were obtained. The adsorbent exhibited better adsorption performance for LLP at higher pH and lower ion strength of buffer solution. The suitable conditions for ion chromatography were obtained with pH 8.0 of buffer solution without NaCl. Three fractions named as LLPS-1, LLPS-2 and LLPS-3 were obtained through ion chromatography, and their yields were 32.66%,1.22% and 3.12%, respectively.

Key words:loquat leaf polysaccharides; enzyme hydrolysis; extraction; ion exchange chromatography

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608008

中图分类号:TS218

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)08-0045-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608008. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2015-07-21

基金项目:福建省自然科学基金项目(2013J01134;2015J01141);福建省教育厅(面上)项目(JA13177)

作者简介:何传波(1978—),男,副教授,博士,研究方向为多糖物质及其综合利用。E-mail:hcbcc@jmu.edu.cn

*通信作者:熊何健(1968—),男,研究员,硕士,研究方向为食品化学与营养学。E-mail:hjxiong@jmu.edu.cn

引文格式: