高效液相色谱法同时测定葡萄酒中16 种添加剂

摘要：研究同时测定葡萄酒中16 种添加剂的高效液相色谱方法。该法主要采用CAPCELL PAK C 18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）分离，以甲醇-20 mmol/L乙酸铵溶液为流动相，采取梯度洗脱，在波长250 nm处进行测定。结果表明，在0.1～20 mg/L的质量浓度范围内线性相关系数良好，相关系数范围为0.999 3～0.999 7，方法检出限范围为0.01～0.5 mg/L，相对标准偏差在0.3%～6.3%之间，平均回收率范围在76.5%～108.5%之间。本方法简便、可靠，能满足对市场上葡萄酒中相关非法添加剂的检测监控要求。

吕梦莎，林能镖，梁玉英，等. 高效液相色谱法同时测定葡萄酒中16 种添加剂［J］. 食品科学， 2016， 37（8）: 222-225.

LÜ Mengsha， LIN Nengbiao， LIANG Yuying， et al. Simultaneous determination of 16 additives in wine by high performance liquid chromatography［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 222-225. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608040. http://www.spkx.net.cn

根据GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》［1］，葡萄酒中允许使用的食品添加剂仅有山梨酸（≤0.2 g/kg）、酒石酸（≤4.0 g/L）、二氧化硫（≤0.25 g/L）等。未明确规定允许添加的若有检出，均属于违法添加。但葡萄酒市场仍有不少违法使用添加剂或者添加剂超标的现象，甚至有不法商贩利用酒精、水和着色剂、甜味剂、香精等添加剂进行勾兑，制造假冒伪劣葡萄酒产品，扰乱葡萄酒市场，危害消费者健康。为了打击葡萄酒市场中的违法造假行为，保证人民食品安全，有必要建立一种准确、灵敏、便捷的葡萄酒中的禁用食品添加剂检测方法。

目前，国标［2-4］有针对葡萄酒中防腐剂、色素和甜味剂等不同类别的添加剂分别测定的检测方法，但检测程序繁杂，检测时间长，无法对葡萄酒中多种类别的添加剂进行同时快速的测定。其他检测方法还有毛细管电泳法［5-6］、近红外光谱法［7］、气相色谱-质谱联用法［8-10］、高效液相色谱法［11-16］和高效液相色谱-质谱联用法［17-25］等。前3 种检测方法测定的添加剂种类都有限制，无法同时测定多种类别的添加剂。后2 种检测方法以高效液相色谱为依托，适用性更广泛。高效液相色谱法已能对葡萄酒中多种添加剂进行检测，但目前该法在文献报道中检测的添加剂种类较少，而高效液相色谱-质谱联用法检测的添加剂种类较多，但设备昂贵、操作复杂，较少应用于日常检测。

因此，本实验基于高效液相色谱法，增加了葡萄酒中添加剂的检测种类，即针对葡萄酒中常见的可能添加16 种添加剂，通过方法优化，建立高效液相色谱同时测定葡萄酒中16 种添加剂的方法。

1　材料与方法

乙酸铵（分析纯）广州化学试剂厂；甲醇（色谱纯）德国Merker公司；安赛蜜（纯度99%）、苯甲酸（纯度99.5%）、山梨酸（纯度99%）、糖精钠（纯度99.9%）、新红（纯度92%）、靛蓝（纯度91%）、对羟基苯甲酸甲酯（纯度99.5%）、对羟基苯甲酸乙酯（纯度99.9%）、对羟基苯甲酸丙酯（纯度99.5%）、对羟基苯甲酸丁酯（纯度99.5%）德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；柠檬黄（0.5 mg/mL）、苋菜红（0.5 mg/mL）、胭脂红（0.5 mg/mL）、日落黄（0.5 mg/mL）、诱惑红（1.00 mg/mL）、赤藓红（0.5 mg/mL）中国计量科学研究院。

2695高效液相色谱仪（配有Waters 2998二级管阵列检测器）美国Waters公司。

准确称取0.050 5 g安赛蜜、0.050 3 g苯甲酸、0.050 5 g山梨酸、0.050 1 g糖精钠、0.054 3 g新红、0.054 9 g靛蓝、0.050 5 g对羟基苯甲酸甲酯、丙酯和丁酯、0.050 1 g对羟基苯甲酸乙酯标准品，用水溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成500 mg/L单标储备液；准确移取各标准储备液2 mL，混合于50 mL容量瓶中，用水定容，配制成20 mg/L的混合标准工作液。用水逐级稀释，制成质量浓度范围为0.1～20 mg/L系列混合标准工作溶液。

取葡萄酒量品10 mL于50 mL烧杯中，超声脱气5 min；取脱气后的量品5.0 mL于10 mL具塞试管中，用水定容至10 mL，过0.22 μm滤膜后分析。

色谱柱：CAPCELL PAK C 18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）+乙酸铵（B）（20 mmol/L，pH 5～6之间）；流速：1.0 mL/min；柱温：常温；检测波长范围：200～700 nm；进量量：10 μL；梯度洗脱程序见表1。

2　结果与分析

分别比较考察乙腈-20 mmol/L乙酸铵溶液和甲醇-20 mmol/L乙酸铵溶液2 种体系对16 种添加剂的分离效果的影响。实验表明：由于乙腈-20 mmol/L乙酸铵体系中乙腈的洗脱能力较强，同时待分离的16 种添加剂极性相近，保留时间相近。从而导致几个组分“共流出”，不能完全分离16 种添加剂（图1A）。然而，在甲醇-20 mmol/L乙酸铵体系中，甲醇相对乙腈的洗脱能力较弱，对16 种添加剂的分离效果较好。因此，选择甲醇-20 mmol/L乙酸铵作为流动相体系。

为得到所研究的16 种添加剂良好的分离效果，对甲醇（A）-20 mmol/L乙酸铵（B）为流动相的洗脱条件进行了优化。显然，等度洗脱也出现组分“共流出”的现象（图1B），为了获得更好的分离效果，需采用梯度洗脱，通过实验不断调整甲醇与乙酸铵的比例。最终，确定梯度洗脱程序见表1。

图1　乙腈-20 mmol/L乙酸铵（A）和体积分数50%甲醇（B）梯度洗脱色谱图
Fig.1 Chromatograms of 16 additives separated by gradient elution with acetonitrile-20 mmol/L ammonium acetate （A） and 50% methanol （B）

对安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、柠檬黄、新红、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红等16 种添加剂标准溶液分别进行紫外光谱扫描，见图2A，发现16 种添加剂的最大吸收波长均不相同。然而，在波长250 nm处16 种添加剂的峰形良好，同时，信号强度均能满足检测需求。因此，最后确定定量波长为250 nm。

按照以上优化后的色谱条件对16 种添加剂混合标准溶液和1号葡萄酒加标量品（经检测不含有待测组分的实际量品）进行检测，得到16 种添加剂的高效液相色谱图见图2B。16 种添加剂分离完全，峰形良好。

表2　葡萄酒中16 种添加剂的线性方程、相关系数及检测限
Table 2 Linear ranges， correlation coefficients （r） and limits of quantification （LOQs） for 16 additives in wine

序号组分名称保留时间/min质量浓度范围/（mg/L）线性方程相关系数（r）检出限/（mg/L）（R SN≥3）1安赛蜜4.570.1～20.0Y=10 400X+1330.999 40.1 2苯甲酸5.710.5～20.0Y=4 080X-1570.999 40.5 3山梨酸7.830.1～20.0Y=118 000X+1 0000.999 70.01 4糖精钠8.710.5～20.0Y = 2 760X-1800.999 70.5 5柠檬黄9.370.1～20.0Y=26 500X+97.60.999 60.05 6新红10.020.1～20.0Y=22 700X+2290.999 60.05 7苋菜红11.150.1～20.0Y = 28 400X+14.50.999 50.05 8靛蓝12.200.1～20.0Y=23 300X+7940.999 60.05 9胭脂红15.010.1～20.0Y=27 200X+3670.999 50.05 10日落黄17.180.1～20.0Y=23 200X+4690.999 60.05 11诱惑红20.000.1～20.0Y=26 000X+1190.999 60.05 12对羟基苯甲酸甲酯21.830.1～20.0Y=48 900X+1.730.999 70.03 13对羟基苯甲酸乙酯24.670.1～20.0Y=47 100X+1270.999 50.03 14对羟基苯甲酸丙酯26.930.1～20.0Y=42 400X+4060.999 60.03 15赤藓红27.690.1～20.0Y=16 000X+4770.999 30.05 16对羟基苯甲酸丁酯28.760.1～20.0Y=41 200X-1150.999 60.03

将标准储备液逐级稀释为0.1～20.0 mg/L标准工作溶液，用所建立的方法进行测定，外标法定量。以色谱峰面积为纵坐标，各添加剂的质量浓度为横坐标绘制工作曲线，结果见表2。结果表明：16 种添加剂的质量浓度与峰面积在0.1～20.0 mg/L范围内呈良好线性关系，相关系数在0.999 3～0.999 7之间，以16 种添加剂的信噪比为3时的进量质量浓度为检出限，得到检出限范围为0.01～0.5 mg/L。方法线性范围广，检出限低，符合实际量品的检测要求。

选取1号葡萄酒量品（经检测不含有待测组分的实际量品），分别添加0.5、4、10、16 mg/L 4个水平质量浓度的16 种添加剂的标准工作溶液，每个质量浓度水平取5 份量品进行实验，计算平均回收率及相对标准偏差。结果表明，16 种添加剂的平均回收率在76.5%～108.5%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在0.3%～6.3%之间，结果如表3所示。

表3　葡萄酒中16 种添加剂的回收率与相对标准偏差（n=5）
Table 3 Recoveries and relative standard deviation （RSD） of 16 additives in wine （n= 5）
%

注：*.添加质量浓度为1 mg/L。

序号化合物0.5 mg/L4 mg/L10 mg/L16 mg/L回收率RSD回收率RSD回收率RSD回收率RSD 1安赛蜜105.13.0106.90.9108.51.1102.40.6 2苯甲酸77.1*1.397.31.799.82.1104.02.1 3山梨酸99.60.998.60.399.91.398.90.4 4糖精钠76.5*4.392.91.793.66.397.94.0 5柠檬黄107.31.797.91.299.31.598.41.5 6新红101.22.291.90.496.70.898.43.7 7苋菜红88.61.4102.31.6101.61.099.40.6 8靛蓝76.53.896.51.583.90.889.61.8 9胭脂红104.63.999.10.891.80.8100.31.0 10日落黄102.54.0105.80.9102.12.5100.70.5 11诱惑红99.72.498.82.2103.21.199.70.9 12对羟基苯甲酸甲酯93.21.897.21.3101.91.497.80.5 13对羟基苯甲酸乙酯98.50.8105.60.699.00.6101.11.1 14对羟基苯甲酸丙酯97.30.5101.50.3102.20.799.70.4 15赤藓红89.64.091.01.399.41.377.83.9 16对羟基苯甲酸丁酯97.41.5101.23.289.12.099.20.6

应用本方法对市售10 种葡萄酒进行测定，根据添加剂的保留时间和光谱图进行定性分析后定量，其中3 个量品检出山梨酸，见表4。阳性量品色谱图如图3所示。

表4　葡萄酒阳性样品的检测结果
Table 4 Quantification results of additives in positive wine samples

葡萄酒量品编号检出添加剂质量浓度/（mg/L）2山梨酸89 4山梨酸101 5山梨酸100

3　结论

本实验采用CAPCELL PAK C 18色谱柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm）进行分离分析，采用高效液相色谱检测葡萄酒中安赛蜜等16 种常见添加剂，分别对流动相和梯度洗脱条件进行优化实验，结果表明：以甲醇-20 mmol/L乙酸铵溶液为流动相，采用优化后的梯度洗脱程序，在波长250 nm处进行检测，能获得16 种添加剂的有效分离。对本方法进行方法学验证，结果表明：本方法在0.1～20.0 mg/L质量浓度范围内线性良好，相关系数范围为0.999 3～0.999 7，方法检出限范围为0.01～0.5 mg/L，RSD在0.3%～6.3%之间，平均回收率范围在76.5%～108.5%之间。与文献［2-4，14，16］方法相比，本方法操作简便、检测种类多、分离效果好、线性范围广、回收率和精密度良好，适用于葡萄酒中多种添加剂的同时测定。

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Simultaneous Determination of 16 Additives in Wine by High Performance Liquid Chromatography

LÜ Mengsha， LIN Nengbiao， LIANG Yuying *， ZENG Junjie， PENG Bining， LI Weigang
（Inspection Technical Center of Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Zhuhai 519015， China）

Abstract：A high performance liquid chromatography （HPLC） method was developed in this study for the simultaneous determination of 16 additives in wine. Chromatographic separation was performed using gradient elution on CAPCELL PAK C 18column （150 mm × 4.6 mm， 5 μm） with methanol-20 mmol/L ammonium acetate as mobile phase， followed by detection at 250 nm. The results showed that the method exhibited an excellent linearity in the concentration range of 0.1-20 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 3-0.999 7 and had a good repeatability with relative standard deviation （RSD） of 0.3%-6.3%. The limits of detection （LOD） were between 0.01 and 0.5 mg/L， and average recoveries ranged from 76.5% to 108.5%. The present method is simple and accurate and can meet the requirements for the analysis of illicit additives in wines.

Key words：high performance liquid chromatography （HPLC）； additives； wine

作者简介：吕梦莎（1987—），女，硕士，研究方向为食品安全检测。E-mail：lv.mengsha@163.com

*通信作者：梁玉英（1965—），女，高级工程师，本科，研究方向为食品安全检测。E-mail：171275765@qq.com

高效液相色谱法同时测定葡萄酒中16 种添加剂

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　结论