基于宽谱特异性抗体的β 2-激动剂多残留电化学免疫传感器的研制

任鹏飞 1,邵科峰 1,张 洁 1,张红琳 2,赵 波 1,*

(1.江苏省生物医药功能材料协同创新中心,江苏省生物功能材料重点实验室,南京师范大学化学与材料科学学院,江苏 南京 210023;2.南京晓庄学院食品科学学院,江苏 南京 211171)

摘 要:制备了沙丁胺醇-莱克多巴胺-牛血清蛋白偶联物,并通过动物免疫获得了抗沙丁胺醇-莱克多巴胺-牛血清蛋白宽谱特异性抗体,同时制备了石墨烯-壳聚糖/沙丁胺醇修饰的电化学免疫传感器,并采用循环伏安法和交流阻抗法对电极的电化学性质进行研究。采用间接竞争法进行了克伦特罗、沙丁胺醇和特布他林3 种β 2-激动剂的同时检测,检出限依次为0.2、0.3 ng/mL和0.3 ng/mL,线性范围依次为50~7 000、1~1 500 ng/mL和100~6 000 ng/mL。将传感器应用于猪瘦肉、猪脂肪和猪肝3 种实际量品中克伦特罗的加标检测,回收率为84.7%~106%。实现了β 2-激动剂的高灵敏多残留免疫检测。

关键词:宽谱特异性抗体;β 2-激动剂;多残留;电化学免疫传感器

任鹏飞, 邵科峰, 张洁, 等. 基于宽谱特异性抗体的β 2-激动剂多残留电化学免疫传感器的研制[J]. 食品科学, 2016,37(8): 236-241. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608043. http://www.spkx.net.cn

REN Pengfei, SHAO Kefeng, ZHANG Jie, et al. Development of a multi-residue electrochemical immunoassay based on broad-spectrum specific antibody for determination of β 2-agonists[J]. Food Science, 2016, 37(8): 236-241. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608043. http://www.spkx.net.cn

β 2-激动剂类兽药(俗称“瘦肉精”)是目前动物源性食品中检出率最高、危害最严重的化学性残留危害物之一。β 2-激动剂曾作为动物饲料的添加剂使用,旨在降低动物脂肪含量、提高蛋白质含量。然而,当人食用含有β 2-激动剂的肉类后,会出现心悸、肌肉颤动、头晕、乏力等异常情况。长期食用会增加染色体畸变的可能性并诱发恶性肿瘤 [1-2],因此我国和世界上大多数国家都规定在动物性食品中不得检出,这就对分析方法的检测灵敏度提出了非常高的要求。目前常用的检测方法可分为色谱分析法 [3-6]、电化学法 [7-9]、免疫分析法 [10-12]等。现有检测技术由于仪器具有局限性而不适合作为高通量快速筛选方法,因此能够高通量、高灵敏检测多种β 2-激动剂的分析方法成为当前该领域的急需。

电化学传感器是一种快速、便捷且成本低廉的检测技术;免疫分析法具有准确性好、灵敏度高和量品前处理简单等优点。电化学免疫传感器 [13-17]结合了电化学传感器和免疫分析法的优点,是目前较为先进的一种检测方法。石墨烯具有优异的导电性能 [18],在电化学传感器的研制中得到大量应用 [19-20];壳聚糖含有大量羟基和氨基且具有良好的成膜性和生物相容性,常被用于固定生物大分子 [21];本实验将石墨烯优良的电化学性质、壳聚糖良好的成膜性能以及宽谱特异性抗体相结合,研制出一种β 2-激动剂多残留电化学免疫传感器,进行了3 种激动剂(克伦特罗、沙丁胺醇和特布他林)的同时检测,并对实际量品进行了加标检测。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

猪肉实际量品购自南京市超市。

克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林(纯度>99%) 中国食品药品检定研究院;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 北京元亨圣马生物技术研究所;抗沙丁胺醇-莱克多巴胺-牛血清蛋白偶联物(salbutamol-ractopamine-bovine serum albumin conjugate,SAL-RAC-BSA)抗体 南京晓庄学院生物化工与环境工程学院;磷酸缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS,pH 7.4)由0.1 mol/L的磷酸氢二钠和0.1 mol/L的磷酸二氢钠按一定比例配得;提取液由乙腈和丙酮(均为分析纯)按1∶1的体积比配制;其他试剂均为分析纯,实验用水均为二次蒸馏水。

FA-1004电子分析天平 上海良平仪器仪表有限公司;KQ-50E超声波清洗器 昆山超声波仪器有限公司;PHS-3E pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;CHI 852C和660E电化学分析仪(配三电极体系:工作电极为玻碳电极,对电极为铂电极,参比电极为Ag/AgCl电极) 上海辰华仪器有限公司;UV-1700PC紫外-可见分光光度计 上海凤凰光学科仪有限公司;H7650透射电子显微镜 日本日立公司;JSM-7600F高分辨热场发射扫描电子显微镜 日本电子株式会社。

1.2 方法

1.2.1 石墨烯-壳聚糖分散液制备

采用改良的Hummers法 [22-23]制备石墨烯;将石墨烯分散于壳聚糖溶液制得分散均匀的石墨烯-壳聚糖分散液 [23]

1.2.2 石墨烯-壳聚糖/沙丁胺醇修饰的多残留免疫传感器的制备

电极抛光及处理:依次使用直径为1.0、0.3 μm和0.05 μm的γ-氧化铝粉将玻碳电极抛光至表面呈现镜面光泽,用大量水冲洗,然后依次用无水乙醇:二次蒸馏水(1∶1,V/V)、二次蒸馏水清洗,室温晾干。

取上述玻碳电极,在其表面滴涂4 μL制备好的石墨烯-壳聚糖分散液,再滴涂2 μL 0.2 g/L的沙丁胺醇标准溶液,在37 ℃烘箱中干燥30 min,使石墨烯-壳聚糖和沙丁胺醇完全固定于电极表面;然后将电极置于质量分数为0.05%的BSA溶液中浸泡30 min,以封闭石墨烯-壳聚糖表面未被沙丁胺醇结合的活性位点,从而减少非特异性吸附;封闭完成后用pH 7.4的PBS冲洗电极,制得石墨烯-壳聚糖/沙丁胺醇修饰的电化学免疫传感器。

1.2.3 免疫传感器的表征

采用紫外-可见吸收光谱法、循环伏安法和交流阻抗法对裸电极以及电极在修饰过程中的电化学性质变化进行了研究。紫外-可见吸收光谱的测定过程为:取干净的石英玻片,模量在电极表面的修饰过程,在其表面滴涂600 μL的石墨烯-壳聚糖分散液,再滴涂300 μL 0.2 g/L的沙丁胺醇标准溶液(石墨烯-壳聚糖和标准溶液量的比例与电极修饰相同)。37 ℃烘箱中晾干,用干净的刀片刮下置于蒸馏水中分散均匀后测得其吸收光谱。

所有电化学实验均采用三电极系统(玻碳电极为工作电极,铂丝为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极)在含有2 mmol/L K 3[Fe(CN) 6]/K 4[Fe(CN) 6]和0.1 mol/L KCl的PBS(pH 7.4)中进行。循环伏安法扫描范围为-0.2~0.8 V,扫描速率为100 mV/s;扫描频率为0.01~10 6Hz,振幅为0.005 V,等待时间为2 s。

1.2.4 反应条件优化

对免疫反应的条件,包括免疫反应时间和抗体用量进行了优化。孵育液中抗体量优化:在50 μL孵育液中,分别加入不同体积的抗体,每次孵育30 min,完成后用PBS冲洗,测差分脉冲伏安法峰电流,至峰电流基本不变时停止。

孵育时间优化:抗体量优化完成后,在50 μL孵育液中,加入上述最佳体积的抗体,将传感器置入其中进行孵育,每5 min测一次DPV峰电流,至峰电流基本不变时停止。

1.2.5 标准量品及实际量品检测

将免疫传感器浸于总体积为50 L的含有一系列质量浓度的β 2-激动剂标准量品和固定用量抗体的孵育液中,37 ℃烘箱中恒温孵育。完成后,用PBS缓冲液冲洗电极表面,置于含有2 mmol/L K 3[Fe(CN) 6]/K 4[Fe(CN) 6]的PBS中,采用DPV测定电流变化与β 2-激动剂质量浓度的定量关系。

实际量品的加标分析:分别称取(1±0.005) g的猪瘦肉、猪脂肪和猪肝(均为经过高效液相色谱法验证过的阴性量品),每种实际量品各称取3 份,加入定量的克伦特罗标准溶液。完成后,每份加入3 mL提取液乙腈-丙酮(1∶1,V/V),超声提取20 min,4 000 r/min离心5 min,取上层清液用氮气吹干,浓缩物用PBS溶解并定容至1 mL,采用DPV测定克伦特罗质量浓度。

2 结果与分析

2.1 多残留免疫传感器原理

图1 免疫传感器的制备及检测原理
Fig.1 Schematic illustration forpreparation and application of the immunosensor

传感器制备及免疫检测原理如图1所示,将制备完成的传感器浸于孵育液中进行孵育,电极上固定的沙丁胺醇与溶液中游离的β 2-激动剂竞争结合溶液中的定量抗体(图1B中1过程),测定DPV峰电流I x;以不含有β 2-激动剂只含有抗体的孵育液为空白(图1B中2过程),测定DPV峰电流I 0。随着溶液中游离β 2-激动剂质量浓度的降低,与其结合的抗体相应减少,则结合到电极表面的抗体相应增加,对电子传递的阻碍随之增强,因此DPV也随之降低。将DPV峰电流之差值ΔI(ΔI=I x-I 0,I x为量品检测对应峰电流;I 0为空白检测对应峰电流)与β 2-激动剂质量浓度建立定量关系,线性量合后即可得到工作曲线。

2.2 石墨烯的表征

图2 石墨烯分别分散在水中(A1)和壳聚糖溶液(A2)中以及石墨烯-壳聚糖的透射电子显微镜(B)
Fig.2 Dispersed graphene in water (A1) and chitosan (A2), and transmission electron microscopic observation of graphenechitosan dispersion (B)

石墨烯在水和壳聚糖溶液中分散状态如图2A所示,分散于水中的石墨烯经一段时间放置后即发生聚沉(图2A1),分散于壳聚糖溶液中的石墨烯经过较长时间后依然均匀分散(图2A2),表明壳聚糖对石墨烯在水中的分散起着重要作用 [24]。图2B为分散于壳聚糖溶液中的石墨烯的透射电子显微镜照片,其中石墨烯片层状结构清晰可见,且片层以褶皱状态存在并未完全铺展开。褶皱可以降低单层石墨烯的表面能,增加其稳定性,阻止形貌由二维向三维转变,是二维石墨烯存在的必要条件 [25]。图2B显示出分散在壳聚糖中的石墨烯并未发生较大程度的团聚,表明壳聚糖对石墨烯具有很好的稳定作用 [26],与图1结论一致。

2.3 免疫传感器的表征

由图3A可以看出,沙丁胺醇标准溶液在223.6 nm和275.0 nm波长处有两个特征吸收峰 [27],石墨烯-壳聚糖复合物在271.8 nm波长处有一个宽峰。石墨烯-壳聚糖/沙丁胺醇修饰层在223.6nm处出现一个“平台状”吸收峰,与沙丁胺醇标准溶液的吸收峰之一吻合完全,此外,该修饰层在273.4nm波长处出现的吸收峰应为石墨烯-壳聚糖复合物(271.8 nm)与沙丁胺醇(275.0 nm)的叠加所形成,说明沙丁胺醇已经成功修饰到电极上。

图3B显示处理干净的裸电极有一对稳定、明显的[Fe(CN) 63-/[Fe(CN) 64-氧化还原可逆峰(曲线a)。电极经过石墨烯-壳聚糖复合物修饰后,氧化还原电流响应较裸电极有明显的升高(曲线b),这是由于石墨烯具有优异的导电性,大大加速了电极表面的电子传递。经过沙丁胺醇修饰后,传感器的电流响应有微弱变化(曲线c),表明沙丁胺醇对电子传递速率的影响不大。传感器经过抗体孵育后,循环伏安法峰电流又有明显下降(曲线d),这是由于抗体与电极表面的沙丁胺醇可以特异性结合而被吸附到电极上,对电子传递产生明显阻碍作用。上述循环伏安法曲线也可以表明沙丁胺醇已被成功修饰到电极上。

图3C为交流阻抗谱图,图中曲线半圆部分的直径为电子从[Fe(CN) 63-/[Fe(CN) 64-转移到电极表面的阻抗值(R et),该数值由电极表面材料的导电性能决定。裸玻碳电极的阻抗值约126 Ω(曲线a);经石墨烯-壳聚糖修饰后,R et几乎为零(曲线b),表明电子在电极表面传输极快,这得益于石墨烯材料极高的电子传递速率;沙丁胺醇修饰并经过BSA封闭后电极阻抗值大约为600 Ω(曲线c);抗体孵育后电极阻抗值大约为1600 Ω(曲线d)。由不同电极阻抗值可知,随着沙丁胺醇、BSA的修饰以及抗体在电极表面的吸附,电极表面电子传导的阻碍作用不断增强,这也从另一个侧面说明传感器上材料修饰的成功。

图3 电极修饰过程的紫外-可见吸收光谱(A)、循环伏安谱(B)和交流阻抗谱(C)图
Fig.3 Ultraviolet visible absorption spectra (A), cyclic voltammetry spectrum (B) and electrochemical impedance spectrum (C) of the glassy carbon electrode during the modifying procedure

2.4 反应条件优化

从图4A可得,孵育液中抗体体积在1~5 μL范围内时,峰电流随抗体量增加而下降;在抗体体积为7 μL时,峰电流略有升高。表明抗体量为5 μL时抗体结合基本达到饱和,传感器检测效果达到最佳。故抗体量选择为5 μL。

图4B显示,孵育时间在5~30 min范围内时,峰电流随孵育时间延长而下降;其后基本保持不变,表明当孵育时间为30 min时抗体结合基本达到饱和,传感器检测效果达到最佳。故选择30 min为最佳孵育时间。

图4 免疫优化反应抗体量(A)和孵育时间(B)的优化
Fig.4 Optimization of immunoreaction conditions: antibody volume (A)and incubation time (B)

2.5 β 2-激动剂的多残留检测结果

在优化的条件下,进行β 2-激动剂标准溶液的检测,以峰电流差值ΔI与量品质量浓度建立线性关系,然后进行线性量合,建立标准曲线,见表1。

表1 石墨烯-壳聚糖/沙丁胺醇传感器对沙丁胺醇、克伦特罗和特布他林的工作曲线
Table 1 Standard curves for the detection of SAL, CL and TB

注:Y为DPV峰电流差值/μA;X为量品质量浓度/(ng/mL)。

相关系数R沙丁胺醇Y=2.867 36+0.005 98X1~1 5000.993 1克伦特罗Y=3.162 22+0.000 85X50~7 0000.992 4特布他林Y=4.424 36+0.001 05X100~6 0000.987 9检测量品工作曲线线性范围/(ng/mL)

图5 石墨烯-壳聚糖/沙丁胺醇修饰电极对沙丁胺醇(A)、克伦特罗(B)和特布他林(C)检测的DPV检测图
Fig.5 DPV spectra of reduced graphene oxide-chitosan composite/SAL modified electrode for the detection of SAL (A), CL (B) and TB (C)

传感器对3 种β 2-激动剂检测的DPV图以及标准曲线如图5所示,结果表明传感器对克伦特罗、沙丁胺醇和特布他林的检出限都较低,依次为0.2、0.3 ng/mL和0.3 ng/mL;线性相关系数除特布他林略低(R= 0.987)外,其余两种都较高(R>0.992),并且线性范围都较宽。本实验采用的宽谱特异性抗体为抗-SAL-RAC-BSA抗体,而沙丁胺醇与克伦特罗和特布他林都具有很大程度的相似结构,所以抗-SAL-RAC-BSA抗体对克伦特罗和特布他林具有一定的交叉反应性,因而能够实现上述3 种β 2-激动剂的同时检测。遗憾的是,该传感器未能检测莱克多巴胺,原因可能是在动物免疫时,SAL-RACBSA抗原中莱克多巴胺结构部分未充分暴露于载体蛋白外部而丧失了其抗原决定簇的作用,导致获得的抗-SALRAC-BSA抗体不能识别莱克多巴胺,从而最终影响了传感器检测效果。

2.6 传感器重复性和稳定性

传感器制备完成后连续测定20 次电流响应,20 次结果相对标准偏差小于10%,表明所制备的石墨烯/壳聚糖/沙丁胺醇传感器具有良好的重复性。将制备好的传感器保存于4℃冰箱中,每天测定3 次电流响应,连续测定7 d,7 d测定结果相对标准偏差小于10%,表明该传感器在相对较长时间内具有较好的稳定性。

2.7 实际量品检测结果

表2 石墨烯-壳聚糖/沙丁胺醇传感器对实际样品中克伦特罗的检测结果
Table 2 Analytical results for the determination of clenbuterol in real samples using graphene-chitosan/salbutamol sensor

量品克伦特罗实际添加量/(ng/mL)克伦特罗实际检出量/(ng/mL)相对标准偏差/%平均回收率/%猪瘦肉500584.8561.3443.814.3106 2 0001 618.61 700.91 759.64.284.7 6 0004 814.15 213.55 260.54.884.9猪脂肪500490.8596.5502.610.9106 2 0001 653.91 747.81 935.88.189 6 0004 990.35 331.05 307.53.786.8猪肝500408.6573.0549.517.4102.1 2 0001 747.82 288.32 276.514.7105.2 6 0005 601.26 435.36 270.87.2101.7

表2为猪瘦肉、猪脂肪和猪肝3 种实际量品中加标克伦特罗的检测结果,3 种量品的回收率都在84.7%~106%之间,相对标准偏差在3.7%~17.4%之间,表明传感器对实际量品具有良好的检测性。此外,猪瘦肉和猪脂肪的回收率稍差于猪肝,这可能是因为其中含有更大量的蛋白质和油脂等成分,因此对结果影响较大。

3 结 论

本实验制备了石墨烯-壳聚糖/沙丁胺醇修饰的电化学免疫传感器。在最优化条件下实现了对克伦特罗、沙丁胺醇和特布他林3 种β 2-激动剂标准溶液的检测,具有较低的检出限(0.2~0.3 ng/mL)和较宽的线性范围(依次为50~7 000、1~1 500 ng/mL和100~6 000 ng/mL)。将传感器应用于猪瘦肉等实际量品中克伦特罗的检测,拥有满意的回收率(84.7%~106%)和较小的相对标准偏差(3.7%~17.4%),对实际量品检测效果良好。

参考文献:

[1] 张桂英. “瘦肉精”的危害及监管探讨[J]. 中国动物检疫, 2011, 28(5): 10-11. DOI:1005-944X(2011)05-0010-02.

[2] 庞苏纳, 于芳. “瘦肉精”及其危害简介[J]. 新疆畜牧业, 2009(3): 17. DOI:1003-4889 (2009) 03-0017-01.

[3] DOMINGUEZ R J C, GARCIA R J F, MARTINEZ R R, et al. Detection of main urinary metabolites of beta(2)-agonists clenbuterol,salbutamol and terbutaline by liquid chromatography high resolution mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2013, 923/924: 128-135. DOI:10.1016/j.jchromb.2013.02.008.

[4] LEPORATI M, BERGOGLIO M, CAPRA P, et al. Development,validation and application to real samples of a multiresidue LC-MS/ MS method for determination of β 2-agonists and anabolic steroids in bovine hair[J]. Journal of Mass Spectrometry, 2014, 49(9): 936-946. DOI:10.1002/jms.3467.

[5] MURO D, CIARDUULLO S, CIVITAREALE C, et al. Development and validation of a multi-residue method for determination of 18 β-agonists in bovine urine by UPLC-MS/MS[J]. Microchemical Journal, 2014, 115: 70-77. DOI:10.1016/j.microc.2014.02.012.

[6] WANG X J, ZHANG F G, DING F, et al. Simultaneous determination of 12 β-agonists in feeds by ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2013, 1278: 82-88. DOI:10.1016/ j.chroma.2012.12.060.

[7] LIN X Y, NI Y N, LI S Z, et al. A novel method for simultaneous analysis of three β 2-agonists in foods with the use of a goldnanoparticle modified glassy carbon electrode and chemometrics[J]. Analyst, 2012, 137(9): 2086-2094. DOI:10.1039/c2an16062e.

[8] BO B, ZHU X J, MIAO P, et al. An electrochemical biosensor for clenbuterol detection and pharmacokinetics investigation[J]. Talanta,2013, 113: 36-40. DOI:10.1016/j.talanta.2013.03.056.

[9] WANG H, ZHANG Y, LI H, et al. A silver-palladium alloy nanoparticle-based electrochemical biosensor for simultaneous detection of ractopamine, clenbuterol and salbutamol[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2013, 49: 14-19. DOI:10.1016/j.bios.2013.04.041.

[10] 袁利鹏, 杨金易, 徐振林, 等. 荧光偏振免疫分析法检测沙丁胺醇[J].食品科学, 2013, 34(16): 139-142. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201316028.

[11] 陈小锋, 李瑞芳, 刘曙照. 对克伦特罗具有高特异性的酶联免疫吸附分析法研究[J]. 分析化学, 2013, 41(6): 940-943. DOI:10.3724/ SP.J.1096.2013.20387.

[12] ZHANG L L, GONG Y F, ZHANG M Z, et al. Development of a monoclonal antibody-based direct competitive enzymelinked immunosorbent assay for a new β-adrenergic agonist phenylethanolamine A[J]. Analytical Methods, 2014, 6(15): 5942-5950. DOI:10.1039/c4ay00682h.

[13] SHEN W J, ZHUO Y, CHAI Y Q, et al. Enzyme-free electrochemical immunosensor based on host-guest nanonets catalyzing amplification for procalcitonin detection[J]. Acs Applied Materials and Interfaces,2015, 7(7): 4127-4134. DOI:10.1021/am508137t.

[14] CHEN X J, WANG Y Y, ZHOU J J, et al. Electrochemical impedance immunosensor based on three-dimensionally ordered macroporous gold film[J]. Analytical Chemistry, 2008, 80(6): 2133-2140. DOI:10.1021/ac7021376.

[15] FANG Y S, WANG H Y, WANG L S, et al. Electrochemical immunoassay for procalcitonin antigen detection based on signal amplification strategy of multiple nanocomposites[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2014, 51: 310-316. DOI:10.1016/j.bios.2013.07.035.

[16] FENG R, ZHANG Y, MA H M, et al. Ultrasensitive non-enzymatic and non-mediator electrochemical biosensor using nitrogen-doped graphene sheets for signal amplification and nanoporous alloy as carrier[J]. Electrochimica Acta, 2013, 97: 105-111. DOI:10.1016/ j.electacta.2013.02.093.

[17] BAI J, LAI Y J, JIANG D W, et al. Ultrasensitive electrochemical immunoassay based on graphene oxide-Ag composites for rapid determination of clenbuterol[J]. Analyst, 2012, 137(18): 4349-4355. DOI:10.1039/C2AN35473J.

[18] AMBROSI A, PUMERA M. Nanographite impurities dominate electrochemistry of carbon nanotubes[J]. Chemistry-A European Journal, 2010, 16(36): 10946-10949. DOI:10.1002/chem.201001584.

[19] FU L, ZHENG Y H, WANG A W, et al. Sensitive determination of quinoline yellow using poly (diallyldimethylammonium chloride)functionalized reduced graphene oxide modified grassy carbon electrode[J]. Food Chemistry, 2015, 181: 127-132. DOI:10.1016/ j.foodchem.2015.02.032.

[20] ZHANG H S, BO X J, GUO L P. Electrochemical preparation of porous graphene and itselectrochemical application in the simultaneous determination ofhydroquinone, catechol, and resorcinol[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2015, 220: 919-926. DOI:10.1016/ j.snb.2015.06.035.

[21] WARNER J, ANDREESCU S. An acetylcholinesterase (AChE)biosensor with enhanced solvent resistance based on chitosan for the detection of pesticides[J]. Talanta, 2016, 146: 279-284. DOI:10.1016/ j.talanta.2015.08.030.

[22] HUMMERS W S, OFFEMAN R E. Preparation of graphitic oxide[J]. Journal of the American Chemical Society, 1958, 80(6): 1339-1339. DOI:10.1021/ja01539a017.

[23] 邵科峰, 陈昌云, 颜妍, 等. 基于石墨烯-壳聚糖修饰电极的免疫传感器检测三聚氰胺[J]. 食品科学, 2013, 34(16): 221-225. DOI:1002-6630(2013)16-0221-05.

[24] FANG M, LONG J, ZHAO W, et al. pH-responsive chitosan-mediated graphene dispersions[J]. Langmuir, 2010, 26(22): 16771-16774. DOI:10.1021/la102703b.

[25] MEYER J C, GEIM A K, KATSNELSON M I, et al. The structure of suspended graphene sheets[J]. Nature, 2007, 446: 60-63. DOI:10.1038/ nature05545.

[26] YIN H H, MA Q, ZHOU Y L, et al. Electrochemical behavior and voltammetric determination of 4-aminophenol based on graphene-chitosan composite film modified glassy carbon electrode[J]. Electrochim Acta, 2010, 55: 7102-7108. DOI:10.1016/ j.electacta.2010.06.072.

[27] LIN K C, HONG C P, CHEN S M. Simultaneous determination for toxic ractopamine and salbutamol in pork sample using hybrid carbon nanotubes[J]. Sensors and Actuators B-Chemical, 2013, 177: 428-436. DOI:10.1016/j.snb.2012.11.052.

Development of A Multi-Residue Electrochemical Immunoassay Based on Broad-Spectrum Specific Antibody for Determination of β 2-Agonists

REN Pengfei 1, SHAO Kefeng 1, ZHANG Jie 1, ZHANG Honglin 2, ZHAO Bo 1,*
(1. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Material, Jiangsu Key Laboratory of Biofunctional Materials,College of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China;2. College of Food Science, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China)

Abstract:Salbutamol-ractopamine-bovine serum albumin conjugate (SAL-RAC-BSA) was prepared and served as immunogen to obtain a broad-spectrum specific antibody (anti-SAL-RAC-BSA Abs) through immunization of rabbits. Electrochemical immunosensor modified with reduced graphene oxide-chitosan composite and SAL was constructed and its electrochemical behavior was studied by cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. Indirect competitive electrochemical immunoassay was carried out for the simultaneous determination of three β 2-agonis, including clenbuterol (CL), salbutamol (SAL) and terbutaline (TB). The proposed method indicated a linearity in the range from 50 to 7 000 ng/mL, 1 to 1 500 ng/mL and 100 to 6 000 ng/mL for CL, SAL and TB, respectively, and the limits of detection were 0.2, 0.3 and 0.3 ng/mL, respectively. The recovery rates of clenbuterol in spiked pork, fat and liver samples ranged from 84.7% to 106%. In summary, a sensitive, rapid and simple electrochemical immunoassay was successfully developed for the determination of three β 2-agonists.

Key words:broad-spectrum specific antibodies; β 2-agonists; multi-residue; electrochemical immunosensor

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608043

中图分类号:TS202.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)08-0236-06

收稿日期:2015-10-12

作者简介:任鹏飞(1987—),男,硕士,研究方向为食品安全分析与检测。E-mail:905587856@qq.com

*通信作者:赵波(1969—),男,教授,博士,研究方向为食品安全检测与预警。E-mail:zbchem@126.com

引文格式: