王 凯，叶可萍，白红武，周光宏*
（南京农业大学 教育部肉品加工与质量控制重点实验室，食品安全与营养协同创新中心，江苏 南京 210095）
摘 要：目的：建立冷却猪肉中单增李斯特菌的暴露评估模型。方法：通过前期对某市冷却猪肉中单增李斯特菌污染情况的调查获取初始污染水平数据，结合建立的生长模型，利用@Risk 5.5软件，定量模拟从销售到家庭贮藏阶段冷却猪肉中单增李斯特菌的暴露情况。结果：大约有1.2%的冷却猪肉中单增李斯特菌超过了风险阈值4（lg（CFU/g）），但是由于其最大值达到了6.29（lg（CFU/g）），不能忽视其潜在的风险。敏感性分析结果显示：单增李斯特菌的初始污染水平与最终暴露量的相关性最高，相关系数为0.90，其次是家庭贮藏 时间和家庭贮藏温度，相关系数分别为0.34和0.21。结论：本研究可为相关部门及消费者采取相应的风险管理措施提供参考。
关键词：冷却猪肉；单增李斯特菌；暴露评估
作为食品安全的一种新模式，风险评估是制定完善食品安全标准和解决国际食品贸易争端的重要依据，有助于提高食品安全水平，改善公众健康状况，在食品安全管理中处于基础地位 [1]。暴露评估是风险评估的核心内容，从微生物危害的角度来说，暴露评估是对某个个体或者群体暴露于致病菌的可能性的估计和对摄入的菌数的估计 [2]。目前，国外已在各类即食食品、水产品、奶制品等领域开展了单增李斯特菌的暴露评估工作 [3-5]，由于暴露评估存在较大的地区差异性，如果直接参考国外的暴露评估结果对风险进行分析，存在较大的局限性。我国在这方面的研究还相对较少，田静 [6]、董庆利 [7]等分别对散装熟肉制品和即食凉拌菜中的单增李斯特菌的暴露风险评估进行了初步研究。由于污染状况调查，生长模型等数据的限制，对冷却猪肉中单增李斯特菌的暴露评估研究尚未报道。
单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，以下简称单增李斯特菌）是一种重要的人畜共患病原菌，广泛分布于自然界中，是冷却猪肉中最常见的、公共卫生学上最重要的食源性病原菌之一。该菌可穿透肠道、血脑、胎盘三大屏障，能引起人类腹泻、脑膜炎、败血症等疾患 [8]，一旦感染死亡率高达30% [9-11]。易感人群主要是新生儿、孕妇及40 岁以上的成人 [12]。发病高峰在夏季和冬季，潜伏期较长，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者感染后可能引发呕吐、化脓性结膜炎、自然流产、败血症直至死亡 [13]。2014年国家食源性疾病监测工作将单增李斯特菌感染病例列为专项监测内容，根据国家食品安全风险评估中心的数据显示，截止至2014年5月，北京市共上报3 例围产期病例，山东省1 例围产期病例。我国食源性疾病监测网近几年的数据显示 [14]，我国在生肉、熟肉、水产品等中均受到单增李斯特菌不同程度的污染。对冷却猪肉中单增李斯特菌进行定量暴露评估对肉品安全控制、降低居民患病风险具有重要意义。
本研究模拟了冷却猪肉中的单增李斯特菌在销售、运输、贮藏环节的变化，对其过程中会产生的数量变化用概率分布进行描述，并通过敏感性分析来确定各个因素对最终风险的影响程度，为相关部门对生鲜食品中病原微生物的控制采取相应的措施提供标准和研究基础。
1.1 冷却猪肉中单增李斯特菌的污染情况
污染资料来源于本实验室2014—2015年的调查数据 [15]，为了使调查数据具有一定的代表意义，以随机抽样方式，从某市4 个大区（人口数占该市总人口50%以上）人口密集区的大型超市及农贸市场采集冷却猪肉样品476 份，对其进行定量检测，获得污染率和污染水平。定性检验方法采用国标法GB 4789.30—2010《食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》结合聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR） [16]的方法，定量检测方法采用最大可能数（most probable number，MPN）法。
1.2 生长动力学模型
许多研究表明菌株特异性及背景微生物对建立的生长模型有一定的影响 [17-19]，为了最大程度模拟自然条件下冷却猪肉中单增李斯特菌的生长规律。本实验在背景菌存在条件下的冷却猪肉中接种26 株肉源性单增李斯特菌分离株混合菌液，研究不同温度（4、10、16、22、28 ℃）下单增李斯特菌的生长状况，初级模型选用Baranyi模型，采用DMFit软件进行拟合，在此基础上采用平方根（Belehradek）模型描述温度对单增李斯特菌生长动力学参数的影响，并且运用精确因子（accurate factor，A f）、偏差因子（bias factor，B f）及均方误差（mean squared error，MSE）等参数对模型进行评估。
Baranyi模型是近几年来广泛应用的一种模型，其既描述了微生物随时间的变化，也描述了微生物的生理状态和对新环境的适应即调整函数A（t），对迟滞期的估计以及曲线的拟合较为准确 [20]，其表达式为：
式中：N t为时间t时的平均菌落数（lg（CFU/mL））；N 0为N t的初始值（lg（CFU/mL））；N max是N t的最大值（lg（CFU/mL））；λ为迟滞期/h；μ max为最大比生长速率/（lg（CFU/mL）/h）。
平方根（Belehradek） [21]模型的表达式如下：
式中：T为培养温度/℃；T min为指理论上微生物细胞能够代谢的最低温度/℃；a、b为方程常数。
1.3 暴露评估
本研究采用概率函数模拟冷却猪肉中的单增李斯特菌从销售、运输到家庭贮藏环节的变化，运用美国Palisade公司的@Risk 5.5软件，采用蒙特卡洛模拟方法，对单增李斯特菌的生长情况进行评估。
1.3.1 销售阶段冷却猪肉中单增李斯特菌的初始污染情况
1.3.1.1 冷却猪肉中单增李斯特菌的污染率（Pp）
为了模拟微生物存在于食品中的不确定性，污染率用Beta分布的形式进行描述，公式为Beta（s＋1, n－s＋1），其中n表示样品总数，s表示阳性样品数。在本研究中，样本总数为476，阳性样本数为26，所以描述为Beta（26, 451）。
1.3.1.2 阳性样品中单增李斯特菌的污染率（Lp）
本研究样本中单增李斯特菌的浓度均低于100 MPN/g，其中仅有23.1%的样品中浓度超过10 MPN/g。用累积分布函数描述阳性样品中单增李斯特菌的污染水平，本实验参照田静 [6]、姬华 [22]等研究，假设MPN/g与CFU/g等同。
1.3.1.3 阴性样品中单增李斯特菌的污染水平（Ln）
为了估计阴性样品中单增李斯特菌的浓度，本研究采用Jarvis [23]公式计算其污染水平，表达式为：
式中：M为样品中的真实浓度（lg（CFU/g））；Z为阴性样品的数量/个；N为样品的总数量/个；m为检测时所用样品量/g。
本研究中，检测时用的样品量为25 g，阴性样品数量为450，样品总数量为476，可以计算出阴性样品中单增李斯特菌的未检出浓度为－2.65（lg（CFU/g）），将其假设为平均值，用反向偏斜累积概率分布（left-hand-tailed cumulative）描述阴性试样中单增李斯特菌的浓度 [24]，则－5.46（lg（CFU/g））的最小值（l.0%）和最大值0.48（lg（CFU/g））（99.0%）可以表示阴性样品中单增李斯特菌实际浓度的不确定性。
1.3.1.4 冷却猪肉中单增李斯特菌的污染水平（N 0）
用离散函数描述冷却猪肉中单增李斯特菌的污染水平 [25]，冷却猪肉销售时单增李斯特菌量的表达式为Discrete（Lp∶Ln, Pp∶（1－Pp））。
1.3.2 销售至食用阶段冷却猪肉中单增李斯特菌的生长
1.3.2.1 销售阶段的时间和温度
冷却猪肉在销售阶段的时间t 1和温度T 1用Pert函数进行描述，其最大值、最可能值和最小值结合国内相关文献[7,24]与实地调研情况确定。
1.3.2.2 运输阶段的时间和温度
冷却猪肉从销售点到消费者家中的运输时间t 2，按照联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）对液态奶调查的平均值和标准差，应用Normal函数描述；温度T 2采用某市2014年4—10月每月的平均最低温度（minimun），月平均温度（mean）和平均最高温度（maximum）代入模型，本研究假设月平均温度为最可能出现的温度，采用Pert函数进行描述。
1.3.2.3 家庭贮藏阶段的时间和温度
家庭贮藏时间t 3通常根据市场调查确定，大部分家庭购买冷却猪肉后于两日内食用完毕。本实验假设贮藏时间为0～48 h，并服从均匀分布，以Uniform函数描述；消费者家庭贮藏温度T 2，根据GB/T 8059.2—1995《家用制冷器具 冷藏冷冻箱》中规定冰箱冷藏室的温度范围为0～10 ℃，而常规冰箱冷藏室的温度为4 ℃，用Pert函数描述。
1.3.3 预测模型的选用
本研究建立的Baranyi模型来模拟冷却猪肉中单增李斯特菌在销售、运输、贮藏中的变化情况，用平方根模型用来评估温度对单增李斯特菌生长的影响，以上所有的参数设置见表1。
表1 冷却猪肉中单增李斯特菌暴露评估模型的参数设置
Table 1 Parameter settings of exposure assessment models for Listeerriiaa monocytogeenneess in chilled pork
阶段定义变量公式单增李斯特菌的阳性率/%PpBeta（27, 451）阳性样品的污染水平（lg（CFU/g））Lp Cumulative（0.48, 2, {0.48, 0.56, 0.58, 0.87, 0.96, 0.97, 1.18, 1.32, 1.36}, {0.385, 0.538, 0.577, 0.654, 0.731, 0.769, 0.885, 0.923, 0.990}）销售阴性样品的污染水平（lg（CFU/g））LnCumulative（－5.46, 0.48, {－5.46, －2.82, 0.48}, {0.01, 0.50, 0.99}）单增李斯特菌的初始污染水平（lg（CFU/g））N
0Discrete（Lp∶Ln, Pp∶（1－Pp））销售时间/htPert（2, 4, 12）销售温度/℃T
1Pert（1, 4, 7）运输运输时间/ht
2Normal （1.06, 0.42）运输温度/℃T
2Pert（12.5, 22.9, 31.5）家庭贮藏家庭贮藏时间/ ht
3Uniform （0, 48）家庭贮藏温度/℃T
3Pert （0, 4, 10）最大生长速率/h
－1μ
maxμ
max＝0.024×
T
4.913 7
迟滞期/hλ1
λ
0.011 06
T
12.727 6
生长模型N
t＝N
0＋μ
max×{t＋ln[exp
μ
max
t
exp
μ
max
单增李斯特菌的最终污染水平（lg（CFU/g））N
tλ
exp
μ
max
t
μ
max
λ
A
t
其中：A
t
ln
1
exp
μ
max
t
μ
max
λ
exp
μ
max
λ
exp
N
max
N
0
暴露评估模型构建完成后，运用@Risk软件中的蒙特卡罗取样方法运行迭代10 000 次，对模型的参数进行分析，评估的结果以概率分布的形式描述。
2.1 冷却猪肉中单增李斯特菌的污染水平
所有冷却猪肉中单增李斯特菌的污染水平表示为Discrete（Lp∶Ln, Pp∶（1－Pp）），通过@Risk软件进行模拟分析后得到图1。可以看出，冷却猪肉中单增李斯特菌的污染水平在95%置信区间为0.48（lg（CFU/g）），说明其平均污染水平处于一个较低的范围内，但是仍检测到一些较大的污染水平的值。
图1 冷却猪肉样品中单增李斯特菌的初始污染水平分布
Fig. 1 Probability distribution of Listeria monocytogenes initial contamination level in chilled pork
2.2 销售至食用前阶段时间和温度的概率分布
表2 各阶段时间和温度的概率分布
Table 2 Probability distribution of time and temperature in each stage
?
销售至食用前阶段时间和温度的概率分布如表2所示。经过对3 个品牌冷却肉在销售点的情况调查发现，冷却猪肉在大型超市或农贸市场的销售时间均不超过12 h，当天未销售出的猪肉将作其他处理，所以表示为Pert（2, 4, 12）。通过模拟，销售时间在95%置信区间为8.21 h，销售温度在95%置信区间为5.86 ℃。可以看出，该市冷却猪肉销售阶段的冷链较为完善，基本符合冷却肉销售的标准。消费者购买冷却猪肉到家中运输时间从0.369 h（5%置信区间）到1.751 h（95%置信区间）。运输温度在95%置信区间为28.37 ℃。而冷却猪肉在消费者家中的贮藏时间从2.4 h（5%置信区间）到45.6 h（95%置信区间）。贮藏温度在95%置信区间为7.54 ℃。
2.3 最终冷却猪肉中单增李斯特菌的污染水平
由上述研究结果可知在冷却猪肉的销售阶段单增李斯特菌初始污染水平最小值为－5.46（lg（CFU/g）），最大值为1.71（lg（CFU/g）），平均值为－2.46（lg（CFU/g））。按照表1的各项参数作为输入变量，最终污染水平作为输出变量运行模型，最终污染水平的概率分布如图2所示，冷却猪肉中单增李斯特菌的最终污染水平从－5.11（lg（CFU/g））到6.29（lg（CFU/g）），平均值为－0.56（lg（CFU/g）），说明经过销售、运输、贮藏后，冷却猪肉中单增李斯特菌的平均污染水平仍处于一个较低的范围内，但是由于其最大值达到了6.29（lg（CFU/g）），并且有1.2%的机率超过了限量标准（4（lg（CFU/g））） [26]，所以不能忽视其潜在的风险。
图2 最终冷却猪肉样品中单增李斯特菌的污染水平分布
Fig. 2 Probability distribution of Listeria monocytogenes fi nal contamination level in chilled pork
2.4 敏感性分析
敏感性分析主要用于分析模型各风险因子对模型结果的影响 [27]，本研究中以Spearman等级相关系数表示（图3），相关系数在－1和＋1之间，＋1表示正相关，－1表示负相关，相关系数越接近0表示这一因子与风险的相关性越低，反之亦然。图中B3表示初始污染水平；B8表示家庭贮藏时间；B9表示家庭贮藏温度；B6表示运输时间；B7表示运输温度；B4表示销售时间；B5表示销售温度。可以看出，以上变量中初始污染水平与最终暴露量的相关性最大，相关系数为0.90，这一结论与骆璇等 [28]研究结果一致。其次是家庭贮藏时间和温度，相关系数分别为0.34和0.21，销售时间和销售温度对风险的影响最小，均为0.03。
图3 冷却猪肉中单增李斯特菌暴露评估的敏感性分析
Fig. 3 Sensitivity analysis of exposure assessment for Listeria monocytogenes level in chilled pork
本研究初步构建了某市冷却猪肉中单增李斯特菌的暴露评估模型，根据前期实验及文献数据、专家意见等对模型的输入量进行分布拟合，模拟了从销售到家庭贮藏过程冷却猪肉中单增李斯特菌污染水平的变化过程。由于微生物本身的特异性及其在食品等基质中不断变化等特点，导致对其进行的风险评估必然比化学性评估更为复杂，导致模型存在一定的不确定性。数据方面，本研究按照FAO对液态奶调查数据描述运输时间，主要考虑消费者购买这两种产品后运输时间的相似性，均趋向于尽快回到家中进行贮藏，尽管如此，仍无法准确地进行替代，会对评估结果造成一定的影响。预测模型方面，本研究采用的生长模型是基于肉源性单增李斯特菌分离株建立的，相对于标准菌株，更符合自然条件下冷却猪肉中单增李斯特菌的生长，但菌株之间生长特性的差异性也是导致模型不确定性的来源之一。此外，目前我国尚未出台关于生鲜食品中单增李斯特菌的限量标准，故本研究选择4（lg（CFU/g））作为风险阈值，这会导致模型存在一定的不确定性。
敏感性分析结果表明初始污染水平与最终暴露量的相关性最高，相关系数达到0.90。因此，对李斯特菌病采取控制措施时，首先要考虑减少冷却猪肉中单增李斯特菌的含量。政府及相关部门有必要加强对冷却猪肉中单增李斯特菌污染状况的监管，对各大销售点定期进行检查，对卫生条件、销售环境不符合标准的销售点进行治理，甚至关闭，最大程度避免消费者购买到被污染的猪肉。销售商家应遵守冷却肉销售的规章制度，同时定期对砧板、刀具、称量托盘等进行清洗杀菌，避免交叉污染的发生。消费者在购买冷却猪肉后应尽快食用，缩短冷藏的时间，减缓病原菌的生长，降低被感染的风险。此外，应尽快出台食品中单增李斯特菌的限量标准，完善单增李斯特菌的监控体系，从源头降低消费者摄入单增李斯特菌导致患病的风险。
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Quantitative Exposure Assessment of Listeria monocytogenes in Chilled Pork
WANG Kai, YE Keping, BAI Hongwu, ZHOU Guanghong*
(Collaborative Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract：Objective: To establish an exposure assessment model of Listeria monocytogenes in chilled pork. Methods: In the present study, we obtained the data of L. monocytogenes initial contamination level in chilled pork from our previous survey. The mathematical models established in our previous work were employed to fi t the growth kinetics of L. monocytogenes in chilled pork. The @Risk software was applied to simulate L. monocytogenes level in chilled pork from retail to home. Results: One point two percent of chilled pork contained more than 4 (lg(CFU/g)) L. monocytogenes (risk threshold), and the maximum value reached 6.29 (lg(CFU/g)), implying that the potential risk should not be ignored. Sensitivity analysis i ndicated that initial contamination level was the main risk control factor with correlation coeffi cient of 0.90, followed by home storage time and storage temperature with correlation coefficient of 0.34 and 0.21, respectively. Conclusion: This study could provide
references：for consumers and stakeholders to take measures for risk management.
Key words：chilled pork; Listeria monocytogenes; exposure assessment
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201611014
中图分类号：TS251.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）11-0079-05
引文格式：
王凯, 叶可萍, 白红武, 等. 冷却猪肉中单增李斯特菌的定量暴露评估[J]. 食品科学, 2016, 37(11): 79-83. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611014. http://www.spkx.net.cn
WANG Kai, YE Keping, BAI Hongwu, et al. Quantitative exposure assessment of Listeria monocytogenes in chilled pork[J]. Food Science, 2016, 37(11): 79-83. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611014. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2015-07-28
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31401558）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（KJQN201548）；国家现代农业（生猪）产业技术体系建设专项（CARS-36-11）；“十二五”农村领域国家科技计划项目（2013BAD19B09）
作者简介：王凯（1990—），男，硕士研究生，研究方向为肉品质量安全控制。E-mail：2013108015@njau.edu.cn
*通信作者：周光宏（1960—），男，教授，博士，研究方向为肉品加工及质量控制。E-mail：guanghong.zhou@hotmail.com