四川区域自然发酵香肠及人工接种牦牛肉发酵香肠中生物胺含量的研究

李思宁，唐善虎*，王柳，赵亮，赵燕英
（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

摘要：以四川省10 区域自然发酵香肠及人工接种发酵剂的牦牛肉香肠共21 个样品为研究对象，测定发酵香肠中的生物胺含量。结果发现，21个发酵香肠样品中均检测到酪胺、亚精胺、精胺、尸胺、腐胺、色胺及组胺，β-苯乙胺均未检出；生物胺总量在57.34～411.12 mg/kg，除采自凉山州西昌的自然发酵牦牛肉香肠和广安的自然发酵猪肉香肠中酪胺含量超过了美国食品及药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）规定标准（酪胺含量≤100 mg/kg），其余均不存在生物胺安全问题。

李思宁, 唐善虎, 王柳, 等. 四川区域自然发酵香肠及人工接种牦牛肉发酵香肠中生物胺含量的研究[J]. 食品科学, 2016, 37(11): 197-201. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611034. http://www.spkx.net.cn

LI Sining, TANG Shanhu, WANG Liu, et al. Biogenic amine contents of naturally fermented sausage and starter culture fermented yak meat sausage in Sichuan area[J]. Food Science, 2016, 37(11): 197-201. (in Chinese with English abstract)

生物胺（biogenic amine，BA）是一类具有生物活性的低分子含氮化合物的统称 [1]，广泛存在于食品中，特别是腐败食品和发酵食品中含量较高，是强致癌物亚硝胺的前体。少量的生物胺对人体具有重要的生理作用，但是摄取过量后会引起不良反应，如呕吐、头晕、心悸、呼吸困难和高血压等 [2-3]。当食品中的生物胺积累到一定浓度时具有潜在的毒性作用，产生食品安全隐患 [4]。

香肠是传统发酵肉制品的代表，因其营养价值高、口味独特、食用方便而深受消费者的喜爱。香肠在发酵过程中会产生生物胺，主要是原料肉中的内源酶和外来接种或污染的微生物由其产生的脱羧酶的作用，使蛋白质分解产生生物胺的前体物质氨基酸，进而转化成生物胺。香肠中最普遍的生物胺是尸胺、腐胺和酪胺。目前，国内外已经有一些关于不同发酵剂、添加剂及发酵条件对发酵香肠生物胺含量影响的研究。Latorre-Moratalla等 [5]研究发现，将清酒乳杆菌接种于希腊aeros thasou香肠中，总腐胺减少，酪胺和组胺也分别减少62%和71%。杨秀娟等 [6]研究发现，采用植物乳杆菌与戊糖片球菌按比例1∶1制备的发酵剂可以降低香肠中生物胺的含量，而且复合菌种比单一菌种抑制生物胺生成的效果更好。朱志远等 [7]研究发现，香肠乳杆菌和肉糖葡萄球菌混合微生物发酵剂的添加可以有效抑制香肠中色胺、腐胺、尸胺、组胺的生成，而肠膜明串珠菌和肉糖葡萄球菌的混合微生物发酵剂的添加可以降低β-苯乙胺和酪胺的含量。Komprda等 [8]研究了发酵剂、调料、贮藏时间和温度对干发酵香肠生物胺含量的影响，发现在室温下贮藏到达保质期一半时间时，生物胺含量为425 mg/kg，到达保质期时其含量达到1 029 mg/kg，结果表明，发酵香肠的贮藏条件对生物胺含量造成很大影响。Lorenzo等 [9]研究了在生产过程中使用葡萄糖、亚硝酸钠、硝酸钠、抗坏血酸和柠檬酸钠5种添加剂对西班牙北部传统干腌成熟的肉制品中生物胺含量的影响，结果表明色胺和尸胺是生产结束后含量最丰富的生物胺，使用添加剂显著增加了总胺含量以及色胺、酪胺、组胺的含量。

目前关于添加植物乳杆菌、戊糖片球菌菌株及不同发酵温度、葡萄糖添加量对牦牛肉和四川区域自然发酵香肠中生物胺含量的研究还未见报道。本实验以四川10 区域自然发酵香肠和自制的不同发酵时间、菌种配比和葡萄糖添加量的牦牛肉发酵香肠为研究对象，通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、丹磺酰氯柱前衍生方法测定其生物胺含量，为客观评价香肠的食用安全性及发酵香肠的开发和生产提供理论依据和借鉴。

1 材料与方法

牦牛肉，购于阿坝红原县四川红原牦牛肉食品有限责任公司，实验前于－18 ℃冰箱中贮藏7 个月。自然发酵香肠，由专人专程采样，于9月份到四川省成都武侯区、凉山州西昌、眉山、阿坝州红原、绵阳、崇州、广安、达州、成都金牛区、南充选取具有代表性的家庭制作的自然发酵香肠，用洁净的自封袋密封带回实验室，在24 h内处理样品进行测定，编号为1～10。

自然发酵香肠制作工艺流程 [10]为：原料肉→预处理→绞碎→添加配料→混合→腌制（4 ℃、4 h）→灌肠→自然晾晒（温度8～15 ℃、相对湿度75～90%）→产品。

植物乳杆菌（L. plantarum）、戊糖片球菌（P. pentosaceus）中国工业微生物菌种保藏管理中心。

β-苯乙胺、组胺盐酸盐、腐胺标准品（纯度99%）美国Sigma公司；酪胺盐酸盐（纯度99%）德国Dr. Ehrenstorfer公司；色胺、尸胺、精胺、亚精胺、1,7-二氨基庚烷标准品（纯度98%）阿拉丁试剂（上海）有限公司；丹磺酰氯标准品比利时Acros Organics公司；甲醇、丙酮、正己烷（均为色谱纯）、乙醚、正丁醇、三氯甲烷、谷氨酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、盐酸、三氯乙酸（均为分析纯）成都市苌征化玻有限公司。

Agilent 1100型高效液相色谱仪（配自动进样器和紫外检测器）美国Agilent公司；Centrifuge 5804型离心机德国Eppendorf公司；YGC-12型氮吹仪成都雅源科技有限公司；FE20型pH计瑞士Mettler Toledo公司；HH-6型恒温水浴锅国华电器有限公司；HZS-H型水浴振荡器哈尔滨市东明医疗仪器厂；绞肉灌肠一体机永康市卓越塑胶有限公司。

选用不同发酵时间、菌种浓度配比（植物乳杆菌/戊糖片球菌，总菌浓10 7CFU/g）及葡萄糖添加量，采用二次饱和D试验设计确定最佳发酵时间、菌种浓度配比和葡萄糖添加量。测定前置于4 ℃冰箱中冷藏50 d，取样后24 h内处理样品进行测定，编号为11～21。

牦牛肉发酵香肠制作工艺流程为：原料肉→切块→混匀（瘦肥比为8∶2）→腌制（4 ℃、24 h）→绞肉→接种→灌肠→结扎、排气→发酵（32 ℃、48 h）→终止发酵（60 ℃、5 h）→产品。

表1 发酵香肠样品信息
Table 1 Information of fermented sausage samples

样品编号产地原料发酵方式、发酵时间/h、菌种浓度配比（植物乳杆菌∶戊糖片球菌）、葡萄糖添加量/% 1成都武侯区猪肉2凉山州西昌牦牛肉3眉山猪肉4阿坝州红原猪肉5绵阳猪肉6崇州猪肉7广安猪肉8达州猪肉9成都金牛区猪肉10南充牦牛肉11自制牦牛肉人工接种发酵、48、0∶0、0.44 12自制牦牛肉人工接种发酵、24、0∶1、0.20 13自制牦牛肉人工接种发酵、24、2∶1、0.20 14自制牦牛肉人工接种发酵、24、0∶1、0.60 15自制牦牛肉人工接种发酵、48、0∶1、0.20 16自制牦牛肉人工接种发酵、38、0∶1、0.44 17自制牦牛肉人工接种发酵、38、1.2∶1、0.20 18自制牦牛肉人工接种发酵、24、1.2∶1、0.44 19自制牦牛肉人工接种发酵、48、7∶10、0.60 20自制牦牛肉人工接种发酵、48、2∶1、0.34 21自制牦牛肉人工接种发酵、32、2∶1、0.60自然发酵

生物胺含量参照GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的测定》中HPLC法进行测定。

准确称取组胺盐酸盐11.87 mg、酪胺盐酸盐12.7 mg、其余6 种生物胺标准品各10 mg，用0.1 mol/L盐酸定容至10 mL，并分别稀释制成终质量浓度为1.00、2.50、5.00、10.00、15.00、25.00 mg/L的混合标准溶液。

色谱柱：Waters Symmetry C 18色谱柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流动相：A为甲醇、B为超纯水，梯度洗脱：0～30 min（55%～100% A），30～35 min（100% A），35～36 min（100%～55% A），36～45 min（55% A）；紫外检测波长：254 nm；进样量：20 μL；柱温：30 ℃；流速：1.5 mL/min。

分别吸取不同质量浓度的生物胺标准混合溶液0.5 mL于10 mL具塞试管，加入20 μL 100 mg/L的1,7-二氨基庚烷内标使用液、1.5 mL饱和碳酸氢钠、1 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯（用丙酮配制），混匀后在60 ℃水浴中反应30 min，每隔10 min快速振荡一次。取出后加入0.1 mL 50 mg/mL的谷氨酸钠（用饱和碳酸氢钠配制）溶液，混匀，60 ℃水浴中保温15 min，中间振荡一次。加入1 mL超纯水，40 ℃条件下氮气吹去丙酮，再加入3 mL乙醚，振荡分层后吸取有机相，重复萃取两次，40 ℃氮气吹干。加入1 mL甲醇溶解残留物，0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC测定。

称取绞碎后的香肠样品10.00 g放入盛有20 mL质量分数5%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液的锥形瓶中，加入2 mL 100 mg/L的1,7-二氨基庚烷内标使用液，混匀后水浴振荡60 min，离心（3 600 r/min，10 min），取上清液，重复两次，用5% TCA定容至50 mL，过滤。吸取10 mL过滤后的提取液于具塞试管中，加入10 mL正己烷，水浴振荡5 min，弃去上层有机相，收集下层溶液，重复两次，以除去提取液中的脂肪。在除去脂肪的溶液中加入适量NaCl使溶液饱和。吸取饱和的样品提取液5 mL置于50 mL离心管中，用0.1 mol/L NaOH调节pH值至12。加入5 mL正丁醇-三氯甲烷（1∶1，V/V），水浴振荡5 min，离心（3 600 r/min，10 min），吸取下层有机相，再重复萃取两次。吸取3 mL萃取液于10 mL具塞试管，加入0.2 mL 1 mol/L的盐酸，40 ℃氮气吹干，再用1 mL 0.1 mol/L的盐酸溶解残留物，待衍生。

吸取待衍生的样品溶液0.5 mL于10 mL具塞试管，加入1.5 mL饱和碳酸氢钠、1 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯，其余操作同1.3.2.3节。

以色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺及生物胺总含量为指标，用SPSS 13.0进行统计分析，每个处理重复3 次，所有实验结果采用±s表示。

2 结果与分析

以标准品峰面积比为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得到8种生物胺标准品回归方程及相关系数（表2）。8种生物胺的峰面积比与其相应质量浓度均成良好的线性关系，相关系数R 2均大于0.99。通过该方法可准确测出样品中生物胺的含量。

表2 测定生物胺的标准曲线回归方程及相关系数
Table 2 Standard curve equations with correlation coeffi cients for biogenic amiinneess

名称回归方程R 2名称回归方程R 2色胺y=23.205x－1.083 40.990 5组胺y=14.740x＋1.283 80.993 2 β-苯乙胺y=21.153x＋1.028 90.993 7酪胺y=13.421x＋0.662 70.991 5腐胺y=7.024 1x＋0.901 70.992 3亚精胺y=9.785 3x－0.586 10.994 9尸胺y=8.297 6x＋1.002 80.992 6精胺y=14.152x＋0.785 60.992 7

由图1可知，1～8号标准品出峰时间依次为10.935、13.163、14.480、15.860、19.928、25.330、26.189、28.855 min，30 min内8 种生物胺得到了有效分离，且峰形对称、无基线漂移和拖尾现象，各生物胺分离效果较理想。

21 种发酵香肠样品经HPLC测定，求平均值，并根据标准曲线，得到8 种生物胺含量及生物胺总量，结果见表3。

表3 发酵香肠中生物胺含量
Table 3 Biogenic amine contents in fermented sausages mg/kg

注：—.未检出。

样品编号色胺β-苯乙胺腐胺尸胺组胺酪胺亚精胺精胺总量1——22.36±0.9318.96±1.02—64.73±0.597.82±0.0224.79±1.80138.66±3.14 2——13.89±1.01—23.92±0.86277.26±12.9330.79±1.8465.26±2.16411.12±13.40 30.14±0.01——63.17±2.1741.43±1.5528.11±0.46132.85±4.18 415.31±0.09——39.98±1.49—42.41±2.506.40±0.7139.25±0.60143.35±2.40 5——17.85±2.52—16.67±1.0916.77±1.5721.04±0.1772.33±2.21 6——14.23±0.0017.78±0.10—14.88±1.6814.30±1.1915.26±0.2576.45±3.01 715.69±1.00——55.92±2.74—98.84±7.8634.34±0.8236.96±2.24241.75±14.64 814.05±0.84——12.96±1.0011.08±0.0019.25±0.4957.34±1.49 911.69±1.47—11.32±0.5617.35±0.34—16.36±0.1021.83±0.9925.04±0.71103.59±2.18 10——13.80±0.60——32.17±1.9016.58±0.4162.55±0.89 1139.01±0.10—14.22±0.2276.57±2.50—83.17±6.4443.42±3.2146.80±1.96303.19±3.65 1238.52±1.85——48.95±0.28—85.72±3.7160.66±3.7933.47±2.46267.32±3.96 1317.03±1.14—12.91±1.9260.59±4.71—47.34±2.5911.74±0.0124.70±1.10174.31±9.25 14——13.35±0.3363.81±3.12—35.96±2.6522.85±0.0530.78±1.00166.75±4.39 1514.35±0.35—14.76±2.0676.15±3.48—77.55±4.2429.20±0.3241.67±2.83253.68±13.26 1610.14±0.03—12.85±0.2656.87±6.15—34.51±2.2814.60±1.3027.68±2.00156.65±11.49 17——14.44±0.1357.72±4.11—25.49±0.828.92±0.1533.14±2.07139.71±3.14 188.83±0.10—11.32±0.6664.86±3.79—77.66±0.8015.11±1.9535.96±0.99213.74±0.82 193.53±0.01—14.05±0.1969.43±4.00—35.16±3.4911.14±0.1728.69±0.90162.00±8.74 2026.63±0.88—13.29±0.4272.20±3.10—42.46±2.8813.00±0.2220.94±2.98188.52±7.44 21——12.71±0.5264.15±4.00—50.84±2.094.52±0.0127.40±1.74159.62±3.14

由表3可知，不同区域自然发酵香肠中生物胺含量差异较大，生物胺总量在57.34～411.12 mg/kg，以8号样品（达州）中生物胺总量最低，2号样品（凉山州西昌）最高。自然发酵香肠中均未检出β-苯乙胺，除2号样品外，其余样品均未检出组胺。

自制牦牛肉发酵香肠中生物胺含量因发酵条件不同存在较大差异，生物胺总量在139.71～303.19 mg/kg，17号样品（发酵时间38 h、植物乳杆菌∶戊糖片球菌= 1.2∶1、葡萄糖添加量0.20%）中生物胺总量最低，11号样品（发酵时间48 h、植物乳杆菌∶戊糖片球菌=0∶0、葡萄糖添加量0.44%）最高。自制牦牛肉发酵香肠中均未检出β-苯乙胺和组胺。

生物胺中组胺毒性最强，酪胺次之 [11]。美国食品及药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）规定食品中生物胺总量≤1 000 mg/kg、组胺含量≤50 mg/kg、酪胺含量≤100 mg/kg。检测的21 个发酵香肠样品中生物胺总量均未超过限量，但2号样品和7号样品中酪胺超标，存在食品安全问题。

21 个样品中色胺检出率为61.90%，检出限0～39.01 mg/kg。色胺是由色氨酸脱羧形成的胺，是香肠中含量较低的胺，一般低于30 mg/kg [12-13]。所测21 个发酵香肠样品，除11号和12号牦牛肉发酵香肠外，其余色胺含量都低于30 mg/kg。

所测21个香肠样品，β-苯乙胺检出率0，检出限0。β-苯乙胺是自然化合物，是由苯丙氨酸脱羧形成，在体内很快被酵素单胺氧化酶代谢。Joosten等 [14]认为β-苯乙胺的形成主要与香肠中存在高浓度的酪胺有关。文献[15]报道，β-苯乙胺和酪胺同时产生，这与本实验研究结论不一致，可能是实验所测样品中的β-苯乙胺被酵素单胺氧化酶代谢后分解生成了其他物质，也可能与四川区域的微生物菌系有关，此结果还没见报道。具体原因有待进一步研究。

实验所测21 个香肠样品，腐胺检出率71.43%，检出限0～22.36 mg/kg；尸胺检出率80.95%，检出限0～76.57 mg/kg。腐胺和尸胺是发酵香肠中主要的生物胺，这与文献[13]报道一致。腐胺是由鸟氨酸脱羧产生，在腐败物中含量较多；尸胺是赖氨酸脱羧后的产物，而赖氨酸是牦牛肉中含量较高的氨基酸，次于天冬氨酸和谷氨酸，其含量高达1.78～2.01 mg/g蛋白质 [16]，这是牦牛肉发酵香肠中尸胺含量较高的原因之一。

腐胺和尸胺对人类健康并无不利影响，但是它们能通过抑制脱毒酶、双胺氧化酶和羟甲基转换酶的活性而潜在地影响组胺含量，当腐胺和尸胺存在时，会加强组胺的毒性 [17]。

实验所测21 个香肠样品，只有2号自然发酵香肠中检出了组胺，组胺检出率4.76%，检出限0～23.92 mg/kg。组胺是由组氨酸脱羧而成，是生物胺中毒性最强的，对人体的健康影响也最大。组胺在发酵香肠中没有规定限量，但在鱼产品中欧洲规定的最高限量为100 mg/kg [18]。组胺主要来源于肠杆菌等微生物的污染，2号自然发酵香肠样品可能是受到了肠杆菌的污染，检出了组胺。

实验所测21 个香肠样品，酪胺检出率95.24%，检出限0～277.26mg/kg，是发酵香肠中含量最高的生物胺，本实验结果与文献[19]报道一致。酪胺是酪氨酸脱羧后的产物，对于一些敏感的个体，摄入100 mg的酪胺就会产生中毒症状。据Nout [20]研究，乳酸菌与酪胺的形成有关，采自凉山州西昌的自然发酵牦牛肉香肠与广安的自然发酵猪肉香肠中酪胺含量高，可能与这两个区域的微生物菌系有关，还可能与加工环境有关。

实验所测21 个香肠样品，亚精胺和精胺检出率均100%，检出限分别为4.52～60.66 mg/kg和15.26～65.26 mg/kg。研究发现 [21]亚精胺和精胺是原料肉中最主要的生物胺，是发酵香肠中始终存在的生物胺，并且在发酵后产品中含量波动小。亚精胺和精胺均是由鸟氨酸脱羧产生的腐胺与S-腺苷甲硫氨酸降解产生的丙胺基结合生成，因此其含量与腐胺有直接关系。国外研究报道香肠中亚精胺和精胺含量一般＜50 mg/kg，本实验所测样品中，除2号自然发酵香肠精胺含量超过50 mg/kg，12号人工接种牦牛肉发酵香肠亚精胺含量超过50 mg/kg，其余样品亚精胺和精胺含量均＜50 mg/kg。

3 讨论

由于香肠的种类和生产工艺、生产条件不同，所以产生的生物胺的种类和数量也不同 [22-23]。自然发酵香肠和人工接种牦牛肉发酵香肠在制作工艺上，最大的区别在于是否人工接种微生物发酵剂及发酵条件。本实验所测大部分牦牛肉发酵香肠生物胺总含量、尸胺及酪胺含量比四川10 区域自然发酵香肠中的含量高，尤其是尸胺含量，这主要与原料有关，发酵香肠中生物胺的浓度和组成受原料肉卫生条件的影响 [19]，牦牛肉发酵香肠所采用的原料是冷冻7 个月的牦牛肉，与刚屠宰的牦牛肉相比，其上附着的微生物种类和数量发生了变化，新鲜度明显下降，生物胺含量增加；其次，牦牛肉相较于猪肉，蛋白质和氨基酸等营养物质的含量要高，牦牛肉蛋白质含量22.5%左右 [24]、猪肉为14.6%左右，牦牛肉在贮藏过程中在微生物或酶作用下，蛋白质转化为氨基酸，生物胺前体物氨基酸的含量直接影响着生物胺的含量，这也能解释2号自然发酵香肠中生物胺含量高的原因；此外，还与发酵微生物有关，2号自然发酵香肠原料是牦牛肉，其生物胺含量比接种了发酵剂的牦牛肉发酵香肠的生物胺含量要高很多，且11号牦牛肉发酵香肠（发酵时间48 h、植物乳杆菌∶戊糖片球菌=0∶0、葡萄糖添加量0.44%）生物胺含量比其他接种了发酵剂的牦牛肉发酵香肠生物胺含量高，这表明是否添加发酵剂及发酵条件也是影响生物胺含量的重要因素。

微生物产生物胺的情况复杂多变，这不仅与食品上微生物的种属有关，还与菌株和环境条件相关。可通过采用优质的新鲜原料肉、适当的发酵剂，改变加工、贮藏条件和卫生条件来减少食品中生物胺的含量 [25]。

4 结论

在被检测的21 个发酵香肠样品中，均检出了酪胺、亚精胺、精胺、尸胺、腐胺、色胺及组胺，β-苯乙胺均未检出；除了2号（凉山州西昌）样品检出了组胺，其余自然发酵香肠和自制牦牛肉发酵香肠中均未检出组胺；亚精胺和精胺是所有样品中均检出的生物胺。

四川10区域自然发酵香肠和人工接种发酵剂的牦牛肉发酵香肠共21 个样品，生物胺总含量在57.34～411.12 mg/kg范围内，除了来自凉山州西昌的2号自然发酵牦牛肉香肠和广安的7号自然发酵猪肉香肠中酪胺含量超过了FDA规定标准，其余样品均在安全摄食范围内。

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Biogenic Amine Contents of Naturally Fermented Sausage and Starter Culture Fermented Yak Meat Sausage in Sichuan Area

LI Sining, TANG Shanhu*, WANG Liu, ZHAO Liang, ZHAO Yanying
(College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

Abstract：A total of 21 fermented sausage samples, including naturally fermented sausages from 10 different areas of Sichuan province and starter culture fermented yak meat sausages, were investigated for the contents of biogenic amines. The results showed that tyramine, spermidine, spermine, cadaverine, putrescine, tryptamine and histamine were determined in these 21 fermented sausage samples, while β-phenylethylamine was not detected. The total content of biogenic amines in samples was in the range of 57.34–411.12 mg/kg. The contents of tyramine in naturally fermented samples collected from Xichang and Guang’an exceeded the limit (≤ 100 mg/kg) set by the U.S. Food and Drug Administration (FDA), and the total content of biogenic amines in other test samples was within the safety range.

Key words：biogenic amine; fermented sausage; yak meat; high performance liquid chromatography (HPLC)

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2015BAD29B02）；四川省科技支撑计划项目（16ZC2530）

作者简介：李思宁（1988—），女，实验师，硕士，研究方向为食品加工与贮藏技术。E-mail：616906108@qq.com

*通信作者：唐善虎（1964—），男，教授，博士，研究方向为动物性食品加工及检测。E-mail：stang01@126.com

四川区域自然发酵香肠及人工接种牦牛肉发酵香肠中生物胺含量的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨 论

4 结 论

3 讨论

4 结论