叶黄素对母鼠乳腺分泌IgA的促进作用

崔焕忠，张辉，杨雨江，尹剑，兰海楠，郑鑫 *
（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118）

摘要：为明确叶黄素对母鼠乳腺分泌IgA能力的影响，本实验对妊娠母鼠添加饲喂叶黄素，检测母鼠血清中IgG、IgA和IgM含量变化，母鼠乳腺组织中IgA mRNA表达量和IgA抗体分泌细胞数量变化，以及仔鼠胃内容物中IgA浓度变化。结果表明：在妊娠21 d和分娩后7 d时，实验组血清中IgG和IgA浓度显著高于正常对照组（P＜0.05），IgM含量虽有升高，与正常对照组相比，无显著性差异（P＞0.05）；乳腺组织中IgA mRNA表达量无显著变化（P＞0.05）；分娩后14 d IgA抗体分泌细胞数量显著增加（P＜0.05）；仔鼠胃内容物中IgA含量极显著高于对照组（P＜0.01）。说明给妊娠母鼠添加饲喂叶黄素可以增强乳腺分泌IgA的能力。

叶黄素（lutein）属于类胡萝卜素（carotenoid），在蔬菜、水果、花卉和某些藻类生物中广泛存在 [1]。天然叶黄素具有独特的生物学功能，目前对叶黄素的研究主要集中在抗氧化作用 [2-3]、抑制肿瘤细胞增殖 [4-7]、预防心血管与老年性疾病 [8-10]以及对机体免疫功能的调节 [11-13]。鉴于叶黄素安全无毒，已被作为食品补充剂在食品、饮料、化妆品、保健食品，甚至婴幼儿食品中添加，研究开发以叶黄素为功能因子的功能性食品和膳食补充剂已成为食品产业中的研究热点 [6]。本实验室前期研究表明，妊娠母鼠饲喂叶黄素，可以增强仔鼠被动免疫能力。被动免疫是新生儿能够存活和健康生长的关键，而初乳和常乳是新生儿营养和免疫组成的来源，其中乳汁中IgA是提供新生儿消化道黏膜免疫主要免疫球蛋白。母鼠免疫水平高低直接影响新生仔鼠免疫水平，且乳腺分泌IgA能力的高低与仔鼠被动免疫密切相关，妊娠母鼠添加叶黄素提高仔鼠被动免疫水平是否是通过提高母鼠乳腺生成与分泌IgA能力来实现尚未见报道。本研究对妊娠母鼠添加饲喂叶黄素，检测母鼠血清中免疫球蛋白及乳腺生成与分泌IgA水平，明确添加叶黄素对妊娠母鼠乳腺分泌IgA能力的影响，为富含叶黄素食品开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

清洁级健康7～8 周龄雌性昆明鼠50 只、雄性昆明鼠25 只，体质量24～28 g，购自于吉林大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（吉）2003-0001。

Mouse IgA、IgG及IgM酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）定量试剂盒美国Bethyl公司；SABC three-step试剂盒杭州博士德生物有限公司；RNAiso Plus Kit、PrimeScript RT ®Reagent Kit with gDNA Eeaser（Perfect Real Time）、SYBR ®Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）宝生物工程（大连）有限公司。

小鼠购买后，给予1 周的时间适应环境，饲养环境为无致病菌，饲养环境温度为21～24 ℃，相对湿度为48%～65%。1 周后开始实验，将2 只雌鼠和1 只雄鼠于20：00放于同一笼中饲养，第二天8：00检查阴道栓，选取阴道栓阳性的雌鼠32 只，随机分为4 组，每组8 只，两组为叶黄素添加实验组，两组为正常对照组。其中实验一组用于母鼠妊娠7、14、21 d的血液样品、母鼠分娩后7 d的血液样品和乳腺组织样品以及仔鼠出生7 d胃内容样品的采集；实验二组用于母鼠分娩后14 d血液样品和乳腺组织样品以及仔鼠出生14 d胃内容样品的采集。所有实验小鼠单笼饲养，参照张静等 [12]饲喂小鼠叶黄素的剂量1.2 mg/（kg·d）（以体质量计，下同）以及Kim等 [14]饲喂犬的剂量，从妊娠开始实验一组和实验二组小鼠按每千克日粮添加50 mg叶黄素进行添加饲喂实验，正常对照组小鼠饲喂正常日粮（含有叶黄素），添加时间为从母鼠妊娠开始至实验结束。

分别于母鼠妊娠7、14、21 d、分娩后7 d和14 d时，乙醚麻醉实验组和正常对照组各8 只母鼠，断尾采集母鼠的血液样品，样品室温放置1 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，分装后，置于－20 ℃保存，用于免疫球蛋白含量的测定。

分别于母鼠分娩后7 d和14 d时，乙醚麻醉实验组和正常对照组各8 只母鼠，在完成上述血液样品采集后，处死母鼠，采集乳腺组织，一部分乳腺组织样品迅速用液氮冻存，用于IgA mRNA表达量的分析；另一部分乳腺组织样品用10%福尔马林中性固定液进行固定，用于免疫组化分析IgA抗体分泌细胞（IgA antibody-secreting cell，IgA ASC）数量。

分别在仔鼠出生7 d和14 d时，每窝各取5 只仔鼠，实验组和正常对照组各取40 只仔鼠，乙醚麻醉后处死仔鼠，采集胃内容样品，分装后，置于－20 ℃保存，用于IgA含量的测定。

将血清样品于室温解冻，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）稀释2 000 倍，按照Mouse IgA、IgG及IgM ELISA定量试剂盒说明书操作步骤，测定血清样品中IgG、IgA及IgM的含量，根据样品稀释倍数，计算样品中IgG、IgA及IgM的含量，分析妊娠7、14、21 d、分娩后7 d和分娩后14 d血清中免疫球蛋白含量的变化 [14-15]。

液氮研磨乳腺组织样品，利用RNAiso Plus Kit提取样品中总RNA，利用PrimeScript RT ®Reagent Kit将RNA反转录为cDNA，按照SYBR ®Premix Ex Taq™ II说明书步骤进行实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），引物序列如下：IgA C段恒定区：正向引物5’-TGCACAGTTACCCATCCTGA-3’，反向引物5’-GCACCAGCACTTCTTTAGGG-3’；β-actin：正向引物5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’，反向引物5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’。以β-actin为内参基因，采用ΔΔCt方法分析IgA mRNA表达变化。

乳腺组织样品用10%福尔马林中性固定液固定24 h后，进行脱水、透明、浸蜡处理，包埋于石蜡中，制成6 μm厚度的切片，切片经烘片、脱蜡、复水后，利用SABC three-step试剂盒进行免疫反应，显色结束后，再进行脱水透明和封片。每只母鼠随机选取5 个不同400×电镜下视野，利用Image-Pro Plus 6.0软件分析阳性细胞数量。

将胃内容物样品于室温解冻，用含有蛋白酶抑制剂的PBS进行200 倍稀释，利用ELISA定量试剂盒测定样品中IgA含量。

实验结果以

?±s表示（母鼠n=8，仔鼠n=40），数据分析采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，同时采用最小显著性差异法（least signifi cant difference，LSD）进行组间显著性比较。

2 结果与分析

图1 母鼠血清中IgG（a）和IgA（b）含量（n==88）
Fig. 1 Serum IgG (a) and IgA (b) concentrations in maternal mice (n = 8)

从妊娠开始至分娩后14 d，每隔7 d采血一次，利用ELISA定量试剂盒测定血清中IgG、IgA和IgM的含量，结果如图1所示，从妊娠第7天开始，IgG和IgA含量开始升高，妊娠21 d时达到最高，妊娠21 d和分娩后7 d时均显著高于正常对照组（P＜0.05），表明添加饲喂叶黄素可以增加母鼠血清中IgG和IgA水平；血清中IgM的含量与正常对照组相比，无显著性差异（图中未显示）。

图2 母鼠乳腺中IgA mRNA表达量（n==88）
Fig. 2 IgA mRNA expression in maternal mammary glands (n = 8)

根据IgA C区恒定区序列设计1 对引物，实时荧光定量PCR检测IgA mRNA表达量，结果如图2所示，在分娩后7 d和14 d时，实验组母鼠乳腺中IgA mRNA表达量与正常对照组相比均没有显著变化（P＞0.05）（图中未显示）。

表1 母鼠乳腺中IgA ASC数（x =8）
Table 1 Number of IgA ASC in maternal mammary glands ( s, = 8)

注：*. 与正常对照组相比，差异显著（P＜0.05）。

组别IgA ASC数量/（个/10 000 μm 2）分娩后7 d 分娩后14 d正常对照组 6.3±0.48.8±0.6实验组 6.7±0.511.9±0.9*

免疫组化方法检测IgA ASC数量，由表1可知，实验组母鼠分娩后7 d和14 d IgA ASC数量均增加，并于分娩后14 d显著高于正常对照组（P＜0.05）。

表2 仔鼠胃内容物中IgA含量测定结果（ ±s，n==4400）
Table 2 IgA content in stomach contents of neonatal mice ( , n = 40)

注：**. 与正常对照组相比，差异极显著（P＜0.01）。

组别IgA含量/（μg/g）分娩后7 d分娩后14 d正常对照组14.1±3.141.9±4.5实验组26.8±3.7**71.2±8.6**

检测出生仔鼠胃内容物IgA含量，结果如表2所示，实验组仔鼠在分娩后7 d和14 d胃内容物中IgA含量均极显著高于正常对照组（P＜0.01）。

3 结论与讨论

在化妆品、饮料和食品行业中作为食品添加剂和保健食品原料被广泛使用的叶黄素，其在提高机体免疫能力方面的作用越来越被重视。研究表明，给禽类添加饲喂叶黄素，不仅可以有效阻止自由基对胚胎的过氧化损伤 [17-18]，还可提高幼雏血清抗氧化水平 [19]。种蛋中叶黄素含量高，孵化后其子代具有良好的淋巴细胞合成能力和细胞免疫能力。给雌鹌鹑及子代鹌鹑饲料中添加叶黄素，可以显著提高卵黄中IgG水平，子代鹌鹑血清IgG的含量与叶黄素的添加量成正比，高剂量叶黄素可显著提高1 日龄子鹌鹑血清中IgG水平 [20]。

高品质乳汁对新生儿获得最佳营养和被动免疫至关重要，IgA是乳汁中最主要的一种免疫球蛋白，可为新生儿提供保护对抗致病微生物抗原 [21-22]。本研究开展了对妊娠母鼠添加饲喂叶黄素，检测乳腺分泌IgA的能力，结果表明，添加饲喂叶黄素可以显著增加母鼠血清中IgG和IgA含量，乳汁中和黏膜分泌物中的IgA可能来自于血清中IgA [23]，因此血清中IgA含量的增加有助于向乳汁中转移。母鼠添加饲喂叶黄素，虽然乳腺组织中的IgA mRNA表达量没有显著变化，但乳腺中IgA ASC数量显著增加，表明乳腺分泌IgA的能力增强。分娩后14 d，仔鼠胃内容物中IgA含量升高极显著，也反映出添加叶黄素可有效增加母鼠乳汁中IgA的含量，这与β-胡萝卜素营养作用类似 [24-25]。综上，妊娠母鼠添加饲喂叶黄素，可有效增加乳腺分泌IgA的能力，有助于增强仔鼠被动免疫能力。因此，叶黄素作为保健食品原料或食品添加剂，可能提高母体乳汁中IgA的含量，提高新生儿被动免疫能力，促进人类健康。

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Promoting Effect of Lutein on the IgA Secretion Capacity of Mammary Glands in Maternal Mice

CUI Huanzhong, ZHANG Hui, YANG Yujiang, YIN Jian, LAN Hainan, ZHENG Xin*
(College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Abstract：The present experiment was conducted to explore the effect of supplemental lutein on the serum concentrations of IgG, IgA and IgM, the mRNA expression of IgA C-region and the number of IgA antibody-secreting cells (ASC) in breast of maternal mice as well as IgA concentration in stomach contents of neonatal mice. Maternal mice were fed rodent feed or 50 mg/kg lutein-supplemented rodent feed during pregnancy and after parturition. The serum concentrations of IgG and IgA increased signifi cantly at 21 days of pregnancy and at 7 days after parturition (P < 0.05), but IgM concentration and the mRNA expression of IgA C-region were not signifi cantly affected by lutein supplementation (P > 0.05). The number of IgA ASC at 14 days after parturition (P < 0.05) and the IgA concentration in stomach contents of neonatal mice at 7 and 14 days after parturition were enhanced markedly (P < 0.01) in response to lutein supplemention. These results indicated that supplemental lutein for maternal mice is effective in enhancing the secretion of IgA in mammary glands.

崔焕忠, 张辉, 杨雨江, 等. 叶黄素对母鼠乳腺分泌IgA的促进作用[J]. 食品科学, 2016, 37(11): 214-217. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611037. http://www.spkx.net.cn

CUI Huanzhong, ZHANG Hui, YANG Yujiang, et al. Promoting effect of lutein on the IgA secretion capacity of mammary glands in maternal mice[J]. Food Science, 2016, 37(11): 214-217. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611037. http://www.spkx.net.cn

基金项目：吉林省科技厅国际科技合作项目（20130413037GH）；吉林省科技厅自然科学基金项目（20140101028JC）

作者简介：崔焕忠（1973—），男，副教授，博士研究生，研究方向为动物营养免疫调控。E-mail：huanzhongcui@163.com

*通信作者：郑鑫（1965—），女，教授，博士，研究方向为动物营养调控。E-mail：zhengxinjilin@126.com