环介导等温扩增技术在转基因成分检测中的应用

冀国桢 1,2,李 刚 1,赵建宁 1,杨殿林 1,修伟明 1,2,*
(1.农业部环境保护科研监测所,农业部产地环境质量重点实验室/天津市农业环境与农产品安全重点实验室/天津市农田生态
与环境修复技术工程中心,天津 300191;2.沈阳农业大学植物保护学院,辽宁 沈阳 110866)

摘 要:随着全球转基因作物商业化种植面积持续增长,转基因成分检测作为转基因作物安全管理的重要技术支撑受到越来越多的关注,世界各国与地区不断致力于转基因成分检测技术的开发。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术由于简单快速等特点,近年来在转基因检测领域备受青睐。本文对LAMP技术在转基因成分检测中的最新研究与应用及其发展前景加以综述。

关键词:环介导等温扩增;转基因成分;检测

2014年是转基因作物商业化种植的第19年,28 个国家转基因作物种植面积达1.815 亿hm 2,比2013年增加了630 万hm 2。全球转基因作物的种植面积从1996年的170 万hm 2增加了100多倍,转基因技术成为农业领域发展最为迅速的生物技术 [1]。随着全球转基因作物种植面积的不断扩大,转基因技术带来的食品安全、环境风险等问题成为人们关注的焦点。因此,越来越多的国家和地区要求加强转基因产品标识管理。我国是唯一采用定性按目录强制标识的国家。而这些都离不开有效的转基因成分检测技术。目前常用的转基因检测技术分为两大类,一类是检测外源基因,一类是检测外源基因表达的蛋白质产物 [2]。由于核酸,尤其是DNA的稳定性较高,加工过程当中不容易被降解,所以核酸检测技术在转基因成分检测中应用最为广泛。基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的传统检测技术,对实验设备和操作人员的要求较高,耗时较长,一般仅适用于室内检测,在大田应用中受到限制。近年来,易于操作、反应高效、灵敏的检测技术逐渐被建立起来 [3]。其中,日本荣研化学株式会社Notomi博士于2000年建立的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,由于反应快速(30~60 min)、温度恒定(65 ℃左右)、操作简单等特点,在转基因成分检测领域得到了广泛的应用 [4]

本文将从LAMP技术在转基因成分不同检测策略中的应用以及最新改进措施加以综述,力求为今后转基因成分检测、转基因产品标识管理等提供参考。

1 LAMP在转基因成分检测中的应用

根据检测的靶标基因,一般转基因成分检测可分为4 种策略,即通用元件检测、基因特异性检测、构建特异性检测和事件特异性检测(图1) [5-6]。目前,关于LAMP法检测转基因成分的研究主要集中在通用元件检测、基因特异性检测以及事件特异性检测展开。

图1 4 种转基因成分检测策略对应检测位点示意图 [[55--66]]
Fig. 1 Schematic presentation of 4 GMO detection strategies based on different sites [5-6]

1.1 LAMP在通用元件筛查检测中的应用

通用元件筛选检测主要以转基因产品的调控元件和标记基因为目标片段。

1.1.1 调控元件LAMP检测

已有LAMP检测法的目标调控元件有3 种,分别为花椰菜花叶病毒35S(Cauliflower mosaic virus 35S,CaMV35S)启动子,胆碱酯合成酶终止子(nonpaline synthase terminator,T-NOS)以及玄参花叶病毒35S启动子(Figwort mosaic virus promoter,P-FMV)。

CaMV35S由于表达高效以及保守区相当稳定,是植物基因工程操作中最常用的启动子,也是LAMP法通用元件检测研究最多的靶基因。Fukuta等 [7]建立了CaMV35S的LAMP检测法,并通过实时浊度仪检测转基因大豆,其检出范围为0.5%~5%。肖维威等 [8]用8 种转基因大豆标准品对建立的CaMV35S LAMP检测法进行验证,其检测灵敏度达200 个拷贝,且对35 种农产品和加工品进行检测,检测结果与SYBR Green荧光PCR一致。陈金松等 [9]针对玉米表达载体的CaMV35S设计LAMP引物,进行体系优化及灵敏度检测,该研究建立的LAMP灵敏度为常规PCR的10~100 倍。Zahradnik等 [10]建立了转基因玉米CaMV35S的LAMP法,并与依赖解旋酶恒温扩增技术(helicase-dependent amplification,HDA)和普通PCR进行了比较,HDA和PCR检出限为0.5%,LAMP为1%。李向丽等 [11]建立了LAMP法检测食用植物油中的CaMV35S启动子,反应在56 min内完成,且灵敏度比常规PCR高10 倍。

T-NOS为最常用的终止子,在转基因检测研究中,常常同时检测CaMV35S和T-NOS,以得到更为准确的结果。Kiddle等 [12]将LAMP技术与实时荧光检测技术相结合,检测转基因玉米中的CaMV35S和T-NOS,其检出范围为0.1%~5%。熊槐等 [13]建立LAMP法分别检测水稻与大豆中的CaMV35S和T-NOS,并用大豆稀释样品进行灵敏度测试,结果表明检测CaMV35S的检出限为0.1%,检测T-NOS的检出限为0.5%,实验中还采用了实时荧光LAMP技术与HF反应管。

P-FMV也是转基因操作中较常用的一种启动子,是转基因成分初筛检测的重要指标之一。邝筱珊等 [14]建立了LAMP法检测食品和饲料中的FMV35S启动子,并利用实时浊度法进行结果检测,经与实时荧光PCR比较,验证了所建方法的可靠性。

1.1.2 标记基因LAMP检测

植物基因工程中,常需要通过标记基因的存在状态对转基因植株做出鉴定。常见的标记基因有通过编码抗生素的抗性基因,如新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase II,NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(hygromycin B phosphotransferase,HPT)基因、β-内酰胺酶(β-lactamase,bla)基因等;发生显色反应进行标记的报告基因,如红色荧光蛋白(discoma coralderived red fluorescent protein,dsRed2)基因、β-D-葡萄糖苷酶(β-glucuronidase,uidA)基因等。标记基因的应用很广泛,但是在一些转基因植物研发中,一旦获得了转基因植株,就会选择消除某些不必要的标记基因 [15]。因此,标记基因的LAMP检测法研究相对较少。Randhawa等 [16]采用LAMP可视化检测法、实时荧光LAMP检测法和OptiGene LAMP荧光检测系统分别对P-35S、P-FMV、AAD、NPTII、uidA进行检测,结果显示,LAMP可视化检测法检出限为40 个拷贝,实时荧光LAMP检测法检出限为10 个拷贝,OptiGene LAMP荧光检测系统检出限为4 个拷贝。

1.2 LAMP在基因特异性检测中的应用

基因特异性检测是以外源基因特异性片段作为目的基因进行检测。已经批准商业化种植或进口作为食用或饲料的转基因植物中,依据转入的基因特性可分为:抗除草剂基因、抗虫基因、抗病毒病基因、品种改良基因、抗逆性基因、育性改变基因等 [17]现已经建立针对基因特异性的LAMP检测法有以下三类。

1.2.1 抗虫基因LAMP检测

已批准的转基因植物中外源基因属于抗虫类的有:抗鞘翅目昆虫、抗鳞翅目昆虫、以及抗多种昆虫等基因 [17]

现有报道中关于LAMP法检测抗虫基因的研究主要包括抗鞘翅目-苏云金芽孢鳞杆菌伴孢晶体蛋白(Bacillus thuringiensis Cry3A delta-endotoxin,cry3A)基因,抗翅目苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白(Bacillus thuringiensis Cry2Ab delta-endotoxin,cry2Ab)基因、cry1Ac、cry1Ab、cry1A,抗多种昆虫豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor,CpTI)基因(表1)等。Li Feiwu等 [18]建立了cry3A和cry2Ab的LAMP法,其灵敏度为5 个拷贝,比普通PCR灵敏5 倍。Zhou Dinggang等 [19]采用沉淀法、钙黄绿素和Mn 2+混合法以及SYBR Green I 3种可视化方法,针对转基因甘蔗中cry1Ac进行LAMP检测。Li Qingchao等 [20]提取水稻基因组DNA并构建cry1Ab基因质粒,建立LAMP法。刘佳 [21]针对cry1Ac基因建立LAMP检测法,检出限为0.005%,并能成功检出经蒸煮、发酵的转基因稻米加工品。王永等 [22]建立LAMP法特异性检测CpTI基因,灵敏度达0.005%,能够定性检测含有CpTI基因的转基因植物以及转CpTI基因植物为唯一原料的产品,但不适合判定包括豇豆类等天然具有CpTI基因的样品中的转基因成分。

1.2.2 耐除草剂基因LAMP检测

已批准的转基因植物中外源基因属于耐除草剂类的有:耐2,4-D、耐麦草畏、耐草铵膦、耐草甘膦、耐异恶唑草酮、耐甲基磺草酮、耐左丹、耐磺酰脲等基因 [17]

目前,针对耐除草剂基因建立的LAMP检测法主要围绕使用最为广泛的耐草甘膦(cp4-5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate,cp4-epsps)基因和耐草铵膦(phosphinothricin acetyltransferase,pat)基因(表1)。兰青阔等 [23]利用LAMP法检测大豆中cp4-epsps基因,结果显示其灵敏度为0.005%。柳毅等 [24]改进DNA的提取方法,并用LAMP法检测cp4-epsps基因,灵敏度为0.01%。Chen Jinsong等 [25]针对pat基因建立LAMP检测法,进行反应体系优化,并成功检测耐除草剂玉米中的pat基因。

1.2.3 品质改良基因LAMP检测

主要通过基因调控改善植物品质,其种类比较多,包括调控木质素产量基因、抗过敏基因、黑斑挫伤调控基因、延缓水果变软基因、延熟基因、增强光合作用/增产基因、甘露糖代谢调控基因、α-淀粉酶调控基因、花色改变基因、脂肪酸基调控因、淀粉/碳水化合物调控基因、烟碱调控基因、褐变调控基因、植酸酶调控基因、降低丙烯酰胺基因等 [17]

但目前关于此类基因的LAMP法很少。Huang Xin等 [3]采用LAMP法检测用于转基因玉米的植酸酶基因(表1),该方法检出限为30 个拷贝,灵敏度为普通PCR的33.3 倍。

表1 LAMP检测基因相关信息[17]
Table 1 Information of genes detected by LAMP[17]

特性基因基因来源产物功能抗鞘翅目昆虫cry3A苏云金芽孢杆菌拟布甲亚种Bacillus thuringiensis ssp. Tenebrionis Cry3A δ-内毒素通过选择性破坏鞘翅目昆虫的中肠壁,对其产生抗性抗鳞翅目昆虫cry1A苏云金芽孢杆菌Cry1Aδ-内毒素通过选择性的破坏鳞翅目昆虫中肠壁,对其产生抗性cry1Ab(截短片段)来源于苏云金芽孢杆菌kumamotoensis亚种的人工合成cry1Ab Cry1Ab δ-内毒素cry1Ac苏云金芽孢杆菌Kurstaki亚种HD73株系Cry1Ac δ-内毒素cry1Ab-Ac来源于苏云金芽孢杆菌的人工合成融合基因Cry1Ab-Ac δ-内毒素(融合蛋白)cry2Ab2苏云金芽孢杆菌kumamotoensis亚种Cry2Ab δ-内毒素抗多种昆虫CpTI豇豆(Vigna unguiculata)胰蛋白酶抑制剂对多种昆虫产生抗性耐草铵膦pat绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)草铵膦乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase,PAT)用过乙酰化作用去除草铵膦的除草活性pat (syn)绿色产色链霉菌Tu494株系pat基因的人工合成基因耐草甘膦cp4 epsps (aroA∶CP4)根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CP4株系5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(双重突变型)降低与草甘膦的结合度,从而对草甘膦产生抗性调控植酸酶phyA2黑曲霉(Aspergillus niger)963株系植酸酶将种子中的植酸磷降解为无机磷酸盐,以便动物吸收

1.3 LAMP在事件特异性检测中的应用

事件特异性检测是检测外源插入载体与植物基因组相连接的序列,每个转基因植物品系都具有特异的连接区序列,因此事件特异性检测具有很高的特异性和准确性。从1994年到2014年10月,共计38 个国家批准转基因作物用作粮食和饲料或释放到环境中,涉及27 种转基因作物和357 个转基因事件的3 083 项监管审批 [1]。目前,主要针对转基因大豆、玉米、水稻、小麦、油菜以及苜蓿6 种作物开展了事件特异性LAMP检测研究。

1.3.1 转基因大豆事件特异性LAMP检测

针对转基因大豆GTS40-3-2(Roudup Ready)、MON89788的LAMP检测法报道最多,其次是针对A2704-12、DP-305423、A5547-127等品系。

Guan Xiaoyan等 [26]建立的LAMP法检测转基因大豆GTS40-3-2和MON89788,63 ℃条件下恒温反应60 min,结合SYBR Green I染色和琼脂糖凝胶检测结果,其检出限为0.005%。沈会平 [27]针对转基因大豆GTS40-3-2和MON89788设计LAMP引物,建立检测方法,并采用实时浊度仪监测反应峰图,反应进行30 min后开始出峰,且峰值较高,反应进行60 min后,质量分数0.1%的GTS40-3-2样品开始出峰,质量分数0.01%的MON89788样品开始出峰,检测结果与染色检测一致,灵敏度符合欧盟检测要求。叶蕾等 [28]也建立了转基因大豆GTS40-3-2和MON89788的实时浊度LAMP检测法,结果与沈会平 [27]的研究一致。实时浊度LAMP检测法可以实时监测反应的进行,通过出峰的时间以及峰值判断反应效率,更方便、准确。Liu Mei等 [29]建立了转基因大豆Roundup Ready的LAMP检测法,反应在70 min内即可完成,检出限达5 个拷贝,而巢式PCR需要300 min,检出限为50 个拷贝,相比之下,LAMP检测法更为快速方便。邵碧英等 [30]应用建立的LAMP法检测大豆制品中转基因大豆A2704-12品系,检测结果与实时荧光PCR完全一致。唐大运等 [31]发明专利公开了转基因大豆DP-305423及其衍生品的LAMP检测法,其灵敏度为0.005%,是普通PCR的10倍。蔡颖等 [32]建立了LAMP实时浊度法特异性检测大豆及其制品中转基因大豆A5547-127品系成分,灵敏度达到0.1%,特异性和稳定性均符合检测要求。

1.3.2 转基因玉米事件特异性LAMP检测

转基因玉米T25、Bt176、Bt11、MON863、TC1507、MON810、DAS-59122-7、MON89034、LY038、NK603、GA21、MIR604、MON88017和EVENT98140的事件特异性LAMP检测法已建立。Chen Lili等 [33]同时建立了DAS-59122-7、T25、Bt176、TC1507、MON810、Bt11、MON863 7 个转基因玉米品系的LAMP检测法,所建方法中除MON810的检出限为40 个拷贝,其他转基因玉米品系检出限均为4 个拷贝。Xu Junyi等 [34]建立的转基因玉米T25 LAMP检测法检出限为5 g/kg,实时荧光PCR的检出限为0.5 g/kg,是LAMP法的10 倍,但LAMP反应时间更短、更方便。凌莉等 [35]也研究了转基因玉米Bt176品系LAMP检测法,采用实时浊度仪和显色法比较,结果显示一致,且LAMP法灵敏度为0.5%(5 g/kg),特异性和稳定性均符合检测要求。王清华等 [36]针对转基因玉米Bt11品系,建立LAMP检测法,经精密度实验分析,其稳定性和灵敏度(0.5%,5 g/kg)均符合转基因成分检测要求。张隽等 [37]成功建立了转基因玉米MON89034的实时浊度LAMP检测法,其检出限为1 pg,是普通PCR法的10 倍。闫兴华等 [38]建立了转基因玉米LY038品系的LAMP检测法,63 ℃条件下恒温反应50 min,即可检测到0.01%的样品,并通过EcoRV酶切分析扩增产物进行验证,评价方法的可行性。甄贞等 [39]建立转基因玉米品系NK603品系的LAMP检测方法,检测灵敏度为0.1%,并具有较高的特异性和较好的稳定性。邵碧英等 [40]建立了转基因玉米GA21品系LAMP检测方法,检测限达到0.05%,检测结果与实时荧光PCR法的结果完全一致。凌莉等 [41]采用实时浊度仪,建立了转基因玉米MIR604事件特异性LAMP检测法,所建方法灵敏度高,特异性和稳定性均符合检测要求,且可准确检测出玉米MIR604的标准品、含有MIR604转基因成分的冷冻玉米及其加工品玉米酒糟粕,完全可用于实际检测工作中。曾静等 [42]建立了转基因玉米MON88017的LAMP检测法,结合浊度观察、颜色变化和琼脂糖凝胶电泳检测结果,并建立了实时荧光PCR,LAMP法检测到人工污染样品0.5%含量的添加,实时荧光PCR检测到0.2%含量的添加。李志勇等 [43]一项发明专利公开了转基因玉米EVENT98140及其衍生品种的LAMP检测法,灵敏度达0.005%,检测结果与实时荧光PCR一致,LAMP检测法更快速高效。

1.3.3 转基因水稻事件特异性LAMP检测

转基因水稻Bt63、KF6、KMD1、TT51-1事件特异性LAMP检测法已建立。吴少云等 [44]采用LAMP实时浊度法检测转基因水稻Bt63品系,实时监控扩增过程,其检出限为0.01%,灵敏度为普通PCR的10 倍。Chen Xiaoyun等 [45]同时建立了3 种转基因水稻KMD1、TT51-1以及KF6的LAMP检测法,结果采用SYBR Green I和羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)2 种染液可视化检测,所建方法的灵敏度为0.01%~0.005%,是常规PCR的10~100 倍。

1.3.4 转基因小麦事件特异性LAMP检测

根据农业生物技术应用国际服务组织(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA)转基因批准数据库显示,到目前为止批准进口作为食用、饲料用或商业化种植的转基因小麦只有MON71800 [17],但目前并未建立LAMP快速检测法。Cheng Yang等 [46]针对转基因小麦B73-6-1品系PHMW1Dx5载体的3’端设计LAMP引物,通过条件优化,建立可行的LAMP检测法,实验表明该方法具有高特异性和高灵敏度。

1.3.5 转基因油菜事件特异性LAMP检测

马路遥 [47]建立了转基因油菜RT73品系的LAMP检测法,当转基因成分≥0.5%时稳定性良好,灵敏度为0.01%(0.01 ng),特异性高,结果检测通过实时浊度仪、染色法及目视法相结合进行判断,相互验证。Lee等 [48]成功建立了转基因油菜MS8和RF3的LAMP检测法,并构建质粒加以验证。黄素文等 [49]公开的一项发明专利中建立了转基因油菜籽MS8品系的LAMP检测法,检出限可达65.12 ng/μL,并具有良好的特异性。

1.3.6 转基因苜蓿事件特异性LAMP检测

刘二龙等 [50-51]成功建立了转基因苜蓿草J163和J101事件特异性LAMP检测法,检出限均为16 pg,相当于10 个拷贝转基因苜蓿基因组DNA,方法特异性好、灵敏度高,能够快速、准确、稳定地检测转基因苜蓿J163和J101成分。

综上所述,LAMP法检测转基因成分灵敏度高,一般与常规PCR和实时荧光PCR的检出限一致或高10~100 倍,特异性好,与其他检测方法相比,LAMP法最大的优点是反应时间短,仅需30~60 min,对仪器的要求比较低,恒温反应即可完成,一方面降低了检测成本,另一方面可以应用于大田检测。因此,LAMP作为一种快速简便的检测方法,预计在未来的转基因成分检测工作中将得到继续推广和大力发展。

2 LAMP技术的改进

2.1 LAMP检测效率的改进

基于核酸分析的转基因成分检测中最主要的3 个步骤为核酸提取,目标片段扩增以及扩增产物检测,因此,从这3 个步骤着手进行改进,有利于提高方法的检测效率 [52]。目前,关于转基因成分LAMP检测法的改进也主要围绕这三个方面展开。

2.1.1 核酸提取方法的改进

转基因成分检测中核酸提取的质量会直接影响后续的扩增效果,在短时间内高效率提取高纯度的核酸是检测工作中的关键环节。转基因产品经深加工后会导致DNA降解,并且其他成分比较复杂,这两个问题会影响DNA提取的质量,Wang Xiumin等 [53]分别采用十六烷基三甲基溴化铵法(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)法、十二烷基苯磺酸钠法(sodium dodecyl sulfate,SDS)法以及胍盐酸化物试剂盒提取植物基因组DNA,结果表明SDS法提取的DNA量大纯度高,CTAB法适中,试剂盒提取的效率最低。柳毅等 [24]通过将经典的CTAB方法进行改进,提取转基因大豆基因组DNA并进行LAMP扩增,使提取时间缩短1 h,提高了检测效率,并降低了提取的成本。Zhang Miao等 [52]将硅胶膜滤管与改造后的注射器相结合,可以在15 min内完成植物基因组DNA提取,装置简便,适合大田应用。

2.1.2 LAMP扩增反应的改进

LAMP检测法的特点在于恒温条件下快速完成反应,通过对扩增反应体系和反应仪器改进,可有效完善LAMP法。LAMP反应的引物一般为2 条外引物F3和B3以及2 条内引物FIP和BIP,反应通过形成一系列茎环结构,循环大量扩增。Nagamine等 [54]的实验证明,环状引物LF/LP可以加速LAMP反应,在短时间内产生大量产物。因此,在有些研究中会采用6 条引物进行反应 [18]。常用于LAMP扩增的聚合酶主要是Bst DNA大片段聚合酶,该酶在60~65 ℃反应活性较强,这也是LAMP反应最适温度一般都在65 ℃左右的原因之一。Randhawa等 [16]采用Bst DNA大片段聚合酶和即时OpiGene等温扩增混合物2 种体系,以及传统加热、热启动循环仪、Light Cycler480实时PCR系统、等温实时系统(GeneiII)对筛查元件进行扩增比较,结果表明,4 种反应系统中等温实时系统(GeneiII)扩增最为有效,可在35 min内检测到4 个拷贝数的目的片段,且在使用该系统扩增时,即时OpiGene等温扩增混合物比Bst DNA大片段聚合酶更快速有效且更灵活。

2.1.3 LAMP扩增产物检测方法的改进

LAMP扩增反应合成大量产物的同时,产生副产物焦磷酸镁,可以通过短暂离心后肉眼观察白色沉淀物判断反应的发生,但是在产物量低时不能准确分辨,实时浊度仪可以在没有探针以及指示剂的情况下,实时定量监测LAMP反应的发生 [55]。吴少云 [44]和王小玉 [56]等使用日本荣研化学株式会社的实时浊度仪LA-320C分别对转基因水稻Bt63品系和转基因玉米MON810进行LAMP扩增,实时监控整个过程,有效排除非特异性扩增。

在反应产物中加入染液如SYBR Green、钙黄绿素和Mn 2+混合物、HNB,通过颜色变化,直接肉眼可快速判断是否有产物产生 [19,45]。同时,由于LAMP反应最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物,因此琼脂糖凝胶电泳检测可通过是否产生梯状条带,判断反应的发生 [55]。但是显色法和凝胶电泳检测都需要开盖检测,容易造成交叉污染,因此LAMP法产物闭管可视化检测在转基因检测中越来越受到欢迎 [26]。Zhang Miao等 [52]反应装置中采用微晶体蜂蜡包裹SYBR Green 染液小珠既避免了提前加入的染液抑制反应,又有效减少交叉污染的风险。熊槐等 [13]采用广州华峰生物科技有限公司的HF反应管,将反应体系加入反应液区,SYBR Green加入显色液区,并加入石蜡油和石蜡混合液密封,反应结束后上下颠倒混合进行显色,不开盖成功检测出转基因大豆、玉米中的T-NOS和P-CaMV35S基因。

2.2 LAMP技术与其他技术的结合应用

将LAMP技术与其他方法相结合,从而使检测更准确、更简便。汪琳等 [57]针对epsps基因进行LAMP扩增,并用核酸试纸条对产物进行检测,整个过程30 min即可完成,在基层有很好的应用前景。Kiddle等 [12]结合生物传感器实时指示器与LAMP法相结合,在有标准参照下,可在低浓度污染(质量分数0.1%~5.0%)环境中准确检测出转基因成分,并适用于大基因组片段如玉米等作物提取的样品检测。

2.3 LAMP检测局限性的改进

LAMP扩增反应具有灵敏度高、检测快速等优点,但与此同时,低浓度的DNA模板污染也会引起扩增,造成假阳性,这给LAMP技术在转基因检测中的应用带来局限性。在检测中,可以通过一些操作处理降低假阳性率、排除污染。核酸提取,目标片段扩增以及扩增产物检测这3 个步骤要严格分区进行,实验前后用紫外灯、酒精、次氯酸钠等处理超净工作台,并保证实验室的通风,一旦出现了污染,应停止实验一段时间 [58]。Chen Jinsong等 [25]采用DNase对反应体系预处理,结果表明经处理过的反应体系具有良好的重复性。除此之外,实时浊度仪和产物闭管可视化检测装置的应用也可以减少气溶胶污染,降低LAMP检测假阳性产生。

3 结 语

本文综述了LAMP法在转基因成分检测中的研究进展。综合国内外研究发现LAMP法在转基因成分检测中有很好的应用前景。目前建立的LAMP检测法大多处于研究阶段,未真正应用到基层检测工作中,今后可从以下几个方面发展:

随着转基因作物品种和外源基因越来越多,现有LAMP法检测转基因成分的研究对象比较集中,基因特异性和事件特异性LAMP检测还有很大的空白,未来的研究中依旧需要继续丰富转基因成分LAMP检测方法。

需将LAMP法与现有的其他转基因检测技术相结合,尤其是一些新的检测技术,发挥LAMP法快速可视化的优势,并通过其他技术实现准确定量,进一步提高检测灵敏度,同时减少检测中的污染,降低假阳性率,保证检测工作顺利进行。

开发更多LAMP反应简易装置,通过提供恒温反应条件,短时间内完成反应,只有这样的装置得到开发和推广,LAMP法才能真正应用于大田检测。

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Application of Loop-Mediated Isothermal Amplification in the Detection of Genetically Modified Components

JI Guozhen 1,2, LI Gang 1, ZHAO Jianning 1, YANG Dianlin 1, XIU Weiming 1,2,*
(1. Key Laboratory of Original Agro-environment Quality of Ministry of Agriculture/Tianjin Key Laboratory of Agro-Environment and Agro-Product Safety/Tianjin Engineering Research Center of Agricultural Ecological & Environmental Remediation, Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture, Tianjin 300191, China; 2. College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Abstract:As the global area of transgenic crops grows continually, special concerns have been raised on the detection of genetically modified components which is regarded as important technical supports for the safety management of genetically modified organisms (GMO). A series of detection techniques for GMOs have been developed in various countries and regions worldwide. Recently, due to the advantages of fast and convenient operation, loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has been widely used in the detection of genetic modification. The present paper tries to review the latest research and application of LAMP assays in the detection of genetically modified components.

Key words:loop-mediated isothermal amplification (LAMP); genetically modified components; detection

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611045

中图分类号:TS201.6

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2016)11-0255-07

引文格式:

冀国桢, 李刚, 赵建宁, 等. 环介导等温扩增技术在转基因成分检测中的应用[J]. 食品科学, 2016, 37(11): 255-261. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611045. http://www.spkx.net.cn

JI Guozhen, LI Gang, ZHAO Jianning, et al. Application of loop-mediated isothermal amplification in the detection of genetically modified components[J]. Food Science, 2016, 37(11): 255-261. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611045. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2015-09-03

基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(农业部环境保护科研监测所)资助项目;

国家自然科学基金青年科学基金项目(31200424)

作者简介:冀国桢(1990—),女,硕士研究生,研究方向为转基因生物安全。E-mail:jiguozhen1990@163.com *通信作者:修伟明(1978—),男,副研究员,博士,研究方向为转基因生物安全。E-mail:xiuweiming@caas.cn