金慧鸣，郭红英，谭兴和*，刘梦浩，王 锋，蔡 文，张 喻，邓洁红
（湖南农业大学食品科技学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）
摘 要：为纯化茅岩莓总黄酮，先用HPD-100型大孔吸附树脂（macroporous adsorption resin，MAR）层析柱进行初步纯化，再用聚酰胺（polyamide，PA）层析柱进行第2次纯化，得到的HPD-100型MAR最适宜吸附工艺参数为上样液总黄酮质量浓度6 mg/mL、上样流速1 mL/min、上样液体积130 mL，在此条件下吸附率为97.14%；最适宜解吸工艺参数为洗脱液乙醇体积分数70%、洗脱流速1 mL/min、洗脱液体积40 mL，在此条件下解吸率为94.10%。经HPD-100型MAR纯化后的总黄酮纯度从55.00%提高到了72.25%。PA的最适宜吸附工艺参数为上样液总黄酮质量浓度6 mg/mL、上样流速2 mL/min，在此条件下吸附率为99.57%；最适宜解吸工艺参数为洗脱液乙醇体积分数70%、洗脱流速1 mL/min、洗脱液体积55 mL，在此条件下解吸率为76.50%。经PA纯化后总黄酮纯度从72.25%提高到了80.75%。该方法为茅岩莓黄酮的纯化提供了一种更高效的方法，具有良好的应用前景。
关键词：茅岩莓；总黄酮；大孔吸附树脂；聚酰胺；纯化
引文格式：
金慧鸣, 郭红英, 谭兴和, 等. 大孔吸附树脂-聚酰胺联用纯化茅岩莓总黄酮[J]. 食品科学, 2016, 37(12): 13-18.
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茅岩莓，学名显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），系葡萄科蛇葡萄属的一种野生藤本植物，其干燥的叶片黄酮类化合物含量极高，最高可达干质量的45%左右，具有抗氧化、抑菌、降血糖、降血脂、保肝护肝的功效[1-4]。其中，总黄酮中含量最高的是二氢杨梅素，最新研究证明其具有抑制乳腺癌细胞和前列腺癌细胞增殖的作用[5-7]。随着人们对黄酮保健作用认识的加强，茅岩莓黄酮的利用越来越得到重视。
近年来，大孔吸附树脂（macroporous adsorption resin，MAR）被广泛用于化学和医药行业中，尤其是植物粗提物中生物活性物质的提取纯化分离，它具有操作成本低、溶剂耗费少、工作强度小、容易再生等优点[8-11]。聚酰胺（polyamide，PA）是一种以酰胺键聚合形成的高分子化合物，主要通过氢键之间相互作用的亲和力进行吸附[12-13]，其对黄酮化合物有很强的吸附性能，且分离和脱色效果好，可以弥补MAR的一些不足。本研究试图通过MAR与PA联用，确定纯化茅岩莓总黄酮的工艺参数，旨在为茅岩莓总黄酮的纯化提供一种更高效的方法。
1.1 材料与试剂
干茅岩莓叶（用中药粉碎机将其粉碎，过120 目筛，装入密封袋备用） 张家界茅岩莓公司；二氢杨梅素标准品（色谱级，纯度≥99%） 成都曼思特生物科技有限公司；HPD-100型MAR 郑州勤实科技有限公司；PA粉（80～100 目）、无水乙醇（分析纯）、三氯化铝（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯） 天津市风船化学试剂科技有限公司；盐酸（分析纯） 衡阳市凯倍化工试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FW177中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-250DE超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；RE-2000B旋转蒸发器、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限公司；FD-1B真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；SKY-200B气浴摇床 上海苏坤实业有限公司；UV-2450紫外-可见分光光度仪、ATX224电子分析天平 日本岛津公司；DENVER电子天平 北京赛多利斯仪器有限公司；100、1 000、5 000 μL移液枪 艾本德（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 茅岩莓黄酮含量的测定
采用紫外分光光度法[14]并做适当改进。精密称取1.8 mg二氢杨梅素标准品于10 mL容量瓶里，用95%乙醇溶液定容；再从中准确吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于25 mL容量瓶中，分别加入3 mL质量分数5%的AlCl3溶液，用95%乙醇溶液定容到刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为0、0.002 88、0.005 76、0.008 64、0.011 52、0.014 40、0.017 28 mg/mL的二氢杨梅素标准溶液，在室温放置40 min，于紫外分光光度计296 nm波长处测定吸光度。以二氢杨梅素质量浓度C为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制茅岩莓总黄酮标准曲线，并通过线性回归得到回归方程：A=48.090 3C－0.000 8，R2=0.999 8。
1.3.2 MAR的预处理
按照文献[15]进行预处理，处理完后置于蒸馏水中备用。
1.3.3 PA的预处理
按照文献[16]进行预处理，处理完后置于蒸馏水中备用。
1.3.4 MAR上样液的制备
上样液制备流程：茅岩莓粉→加入乙醇溶液→超声波辅助乙醇法提取→过滤→旋转蒸发成浸膏状→冷冻干燥→加蒸馏水配制成不同质量浓度总黄酮溶液（超声波助溶）→备用。
提取条件为：乙醇体积分数67%、超声波处理温度58 ℃、超声波处理时间28 min、液料比22.5∶1（mL/g）[17]。
1.3.5 MAR动态吸附与解吸工艺参数的确定
取2 0 m L已处理好的M A R湿法装入层析柱（Φ18 mm×300 mm）中，再将茅岩莓总黄酮溶液上柱，待总黄酮溶液通过树脂柱后，用大约4～5 BV （1 BV=20 mL）蒸馏水冲洗树脂柱，最后用乙醇溶液进行洗脱。通过测定吸附液和洗脱液中总黄酮质量浓度并计算吸附率和解吸率，考察上样液总黄酮质量浓度、上样流速、上样液体积以及洗脱液体积分数、洗脱流速、洗脱液体积对MAR性能的影响，确定最适宜工艺参数。
1.3.6 PA动态吸附与解吸工艺参数的确定
取经MAR最适宜工艺参数吸附和洗脱处理的总黄酮溶液，测得洗脱液中总黄酮的质量，通过旋转蒸发仪去除有机溶剂，再加入水溶液配制成不同总黄酮质量浓度的溶液作为上样液，备用。量取20 mL已处理好的PA湿法装入层析柱（Φ18 mm×300 mm）中，将上样液通过PA柱进行吸附，考察上样液总黄酮质量浓度和上样流速对PA性能的影响，再用4～5 BV蒸馏水冲洗，然后分别用体积分数为30%、50%、70%、90%的乙醇溶液以1 mL/min进行洗脱，每流出5 mL流出液收集并测定总黄酮质量浓度，并以洗脱液体积为横坐标、流出液中总黄酮质量浓度为纵坐标绘制动态洗脱曲线，从而确定最适宜的洗脱液体积和乙醇体积分数。最后考察不同洗脱流速对PA性能的影响。
1.3.7 吸附率和解吸率的计算
通过测定上样液、吸附液和洗脱液中总黄酮的质量浓度来计算吸附率和解吸率，如式（1）、（2）所示：
式中：C0为上样液总黄酮质量浓度/（mg/mL）；C1为吸附液总黄酮质量浓度/（mg/mL）；C2为洗脱液总黄酮质量浓度/（mg/mL）；V1为上样液体积/mL；V2为洗脱液体积/mL。
1.3.8 总黄酮纯度的测定
分别将MAR和PA的洗脱液置于旋转蒸发仪中浓缩成浸膏状，再冷冻干燥成粉末。准确称取适量总黄酮粉，用95%乙醇溶液溶解，用1.3.1节方法测定溶液中总黄酮质量浓度，从而计算样品中黄酮纯度，如式（3）所示：
式中：C为溶液中总黄酮质量浓度/（mg/mL）；V为溶解总黄酮粉所用的乙醇溶液体积/mL；m为称取的总黄酮粉质量/g。
2.1 MAR动态吸附与解吸工艺参数的确定
2.1.1 上样液总黄酮质量浓度对吸附效果的影响
分别取50 mL总黄酮质量浓度为2、4、6、8 mg/mL的上样液，以上样流速1 mL/min通过已处理好的MAR，收集吸附后的流出液，测定其总黄酮质量浓度并计算吸附率。
图1 上样液总黄酮质量浓度对吸附效果的影响
Fig. 1 Effect of total flavonoids concentration in sample on the adsorption efficiency
由图1可知，上样液总黄酮质量浓度较小时吸附率也较低，2～6 mg/mL范围内，吸附率随着质量浓度的增加而增加，上样液总黄酮质量浓度为6 mg/mL时，吸附率达到最大，继而又随着质量浓度的增加而降低。这是由于上样液总黄酮质量浓度越高，单位表面积内的总黄酮与MAR接触量越多，吸附量也就越多大[18]。但如果上样质量浓度太大，可能不仅使总黄酮在树脂中扩散能力下降，而且与总黄酮竞争吸附的杂质量也随之增大[19]，MAR更容易达到饱和，使得总黄酮得不到充分吸附，易造成能源浪费。所以，最适宜的上样液总黄酮质量浓度为6 mg/mL。
2.1.2 上样流速对吸附效果的影响
取50 mL总黄酮质量浓度为6 mg/mL的上样液分别以上样流速0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min通过已处理好的MAR柱，收集吸附后的流出液，测定其总黄酮质量浓度并计算吸附率。
图2 上样流速对吸附效果的影响
Fig. 2 Effect of sample flow rate on the adsorption efficiency
由图2可知，吸附率随着上样流速的增加而逐渐下降，但下降趋势较缓慢。因为上样液流速过快，目标物来不及被树脂充分吸附就会开始泄漏；而上样流速过慢，目标物与树脂接触越充分，从而提高MAR的吸附量，但会降低吸附效率[19-20]，因此在不影响吸附效率的情况下选择合适的上样流速非常重要。综合考虑吸附效果与工作效率两个因素，选择1 mL/min为最适宜的上样流速。
2.1.3 上样液体积对吸附效果的影响
取150 mL总黄酮质量浓度为6 mg/mL的上样液分别以上样流速1 mL/min通过 已处理好的MAR柱，以5 mL为一个体积单位收集流出液，测定其总黄酮质量浓度，并以上样液体积为横坐标、流出液总黄酮质量浓度为纵坐标绘制动态吸附曲线，考察上样液体积对吸附效果的影响。
图3 动态吸附曲线
Fig. 3 Dynamic adsorption curve
从图3可以看出，上样液体积0～125 mL时，流出液总黄酮质量浓度很低，且基本处于稳定平缓的趋势；当上样液体积继续增加到130 mL时，质量浓度开始明显上升；当上样液体积达到135 mL时，流出液总黄酮质量浓度为0.911 mg/mL，已经超过上样液总黄酮质量浓度的1/10，故视130 mL为泄漏点[16]。因此，确定上样液体积为130 mL，经计算吸附率达97.14%。
2.1.4 洗脱液体积分数对解吸效果的影响
取130 mL总黄酮质量浓度为6 mg/mL的上样液以上样流速1 mL/min通过已处理好的MAR柱，再用4～5 BV蒸馏水以1 mL/min的流速冲洗MAR柱使流出液为无色透明。分别用50 mL体积分数为30%、50%、70%、90%的乙醇溶液作为洗脱液在1 mL/min的流速条件下进行洗脱，收集洗脱液，测定其总黄酮质量浓度并计算解吸率。
图4 洗脱液体积分数对解吸效果的影响
Fig. 4 Effect of eluent concentration on the desorption efficiency
考虑茅岩莓黄酮基本用于食品及医药领域，因此选择相对安全性较高的乙醇作为洗脱液。由图4可知，乙醇体积分数30%～70%，解吸率随着乙醇体积分数的增大而增大；乙醇体积分数为70%时，解吸率最高；之后再增加乙醇体积分数，解吸率又随之降低。这是因为乙醇体积分数不同，极性大小也不同，而黄酮与MAR之间存在着一定的范德华力，两物质的极性越相近则范德华力越大[21]。可能由于70%乙醇溶液与茅岩莓黄酮的极性更为接近，因此最容易被洗脱下来，故选择70%为最适宜的洗脱液乙醇体积分数。
2.1.5 洗脱流速对解吸效果的影响
图5 洗脱流速对解吸效果的影响
Fig. 5 Effect of elution velocity on the desorption efficiency
取130 mL总黄酮质量浓度为6 mg/mL的上样液，以上样流速1 mL/min通过已处理好的MAR柱，再用4～5 BV蒸馏水以1 mL/min的流速冲洗MAR柱使流出液为无色透明。用50 mL 70%乙醇溶液作为洗脱剂分别在0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min的流速 条件下进行洗脱，收集洗脱液，测定其总黄酮质量浓度并计算解吸率。
由图5可知，当洗脱流速为0.5～1 mL/min时，解吸率随着洗脱流速的增加而逐渐增加；流速为1 mL/min时，解吸率达到最高；之后解吸率又随着流速进一步增加而逐渐降低，这可能是因为流速过快缩短了MAR表面活性部位与总黄酮相互作用的时间[22]。因此，洗脱流速以1 mL/min为宜。
2.1.6 洗脱液体积对解吸效果的影响
取130 mL总黄酮质量浓度为6 mg/mL的上样液，以上样流速1 mL/min通过已处理好的MAR柱，再用4～5 BV蒸馏水以1 mL/min的流速冲洗MAR柱使流出液为无色透明。用50 mL 70%乙醇溶液作为洗脱剂在1 mL/min的流速条件下进行洗脱，以5 mL为一个体积单位收集流出液，测定其总黄酮质量浓度，并以洗脱液体积为横坐标、流出液总黄酮质量浓度为纵坐标绘制动态洗脱曲线，考察洗脱液体积对解吸效果的影响。
图6 动态洗脱曲线
Fig. 6 Dynamic desorption curve
由图6可知，当洗脱液体积为5 mL时，流出液中总黄酮质量浓度相对较小，随后急剧上升，洗脱液体积为15 mL时，总黄酮质量浓度达到最大值，为65.465 mg/mL；当洗脱液体积达到45 mL时，总黄酮质量浓度只有0.052 mg/mL。因此，选择40 mL为最适宜的洗脱液体积，此时，解吸率为94.10%。从该洗脱曲线可以看出，40 mL的洗脱液可以把茅岩莓总黄酮基本洗脱完全，且峰形较对称，无拖尾。
2.2 PA动态吸附与解吸工艺参数的确定
2.2.1 上样液总黄酮质量浓度对吸附效果的影响
分别将已去除有机溶剂的MAR解吸液（总黄酮含量为702 mg）加入一定量水溶液配制成总黄酮质量浓度为3、4、5、6 mg/mL的溶液，以上样流速1 mL/min通过已处理好的PA柱，收集吸附后的流出液，测定其总黄酮质量浓度并计算吸附率。
由图7可知，上样液总黄酮质量浓度在3、4、5、6 mg/mL时，吸附率分别为99.57%、99.71%、99.59%、99.87%，差别非常小，均在99%以上。说明在此范围内，总黄酮质量浓度对吸附效果影响非常小，且吸附效果非常好。因上样液总黄酮质量已固定，考虑到上样液总黄酮质量浓度越高，上样液体积越小，吸附时间则越短，所以选择6 mg/mL为最适宜的上样液总黄酮质量浓度，此时，上样液体积为117 mL。
图7 上样液总黄酮质量浓度对吸附效果的影响
Fig. 7 Effect of total flavonoids concentration in sample on the adsorption efficiency
2.2.2 上样流速对吸附效果的影响
将已去除有机溶剂的MAR解吸液（总黄酮含量为702 mg），配制成总黄酮质量浓度为6 mg/mL的溶液，分别以上样流速0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min通过已处理好的PA柱，收集吸附后的流出液，测定其总黄酮质量浓度并计算吸附率。
图8 上样流速对吸附效果的影响
Fig. 8 Effect of sample flow rate on the adsorption efficiency
由图8可知，上样流速在0.5～2 mL/min之间时，吸附率分别为99.83%、99.65%、99.58%、99.57%，仍然都在99%以上。因此，为提高效率，选择2 mL/min为最适宜上样流速。
2.2.3 不同洗脱液体积分数的动态洗脱曲线
图9 洗脱液体积分数对解吸效果的影响
Fig. 9 Effect of eluant concentration on the desorption efficiency
将吸附好的PA用4～5 BV蒸馏水冲洗，再分别用体积分数为30%、50%、70%、90%的乙醇溶液以1 mL/min流速进行洗脱，每流出5 mL流出液收集并测定总黄酮质量浓度，并以洗脱液体积为横坐标，总黄酮质量浓度为纵坐标绘制动态洗脱曲线，考察洗脱液体积分数和洗脱液体积对解吸效果的影响。
由图9可知，体积分数为30%的乙醇溶液洗脱下来总黄酮较少，且峰形不集中，拖尾非常严重，这种拖尾现象导致了洗脱时间的延长和洗脱液体积的增大，当洗脱液体积达到200 mL时，流出液总黄酮质量浓度仍有0.260 mg/mL，此时解吸率只有55.9%。这可能是因为30%的乙醇溶液洗脱能力较弱，而一些黄酮化合物与PA形成较多氢键，结合力大，使得不易被洗脱[23]。50%乙醇溶液动态洗脱曲线峰形相对集中，稍有拖尾，55 mL的洗脱液能基本把黄酮洗脱下来，解吸率为72.88%。用70%乙醇溶液洗脱，洗脱液为20 mL时，流出液总黄酮质量浓度达到最高值，出峰较早，洗脱液为30 mL时，又出现一个峰值。这可能是由于PA的柱层析作用，根据吸附物质与PA结合力不同所以会被分开洗脱下来，不同的峰代表不同物质[24]。此时，洗脱液体积为55 mL，解吸率为77.77%，可能是70%的乙醇溶液能最大程度地降低PA和总黄酮的氢键作用。90%乙醇溶液动态洗脱曲线峰形较对称集中，较70%乙醇溶液洗脱曲线出峰晚，且需65 mL乙醇溶液才能基本洗脱完全，此时解吸率为74.23%。因此，选择55 mL、70%为最适宜的洗脱液体积和洗脱液体积分数。
2.2.4 洗脱流速对解吸效果的影响
将吸附好的PA用4～5 BV蒸馏水冲洗，再用55 mL 70%乙醇溶液分别在0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min的流速条件下进行洗脱，收集洗脱液，测定其总黄酮质量浓度并计算解吸 率。
图10 洗脱流速对解吸效果的影响
Fig. 10 Effect of eluent flow rate on the desorption efficiency
由图10可知，解吸率在洗脱流速为0.5 mL/min时很低，之后随着流速的加快解吸率迅速上升；流速为1 mL/min时，解吸率达到最大；流速从1～2 mL/min时，解吸率又随着流速的加快而降低。因此，选择1 mL/min为最适宜的洗脱流速，此时，解吸率为76.50%。
2.3 总黄酮纯度的测定结果
分别准确称取20 mg纯化前、经MAR纯化后、经PA纯化后的黄酮粉，精密加入5 mL 95%乙醇溶液进行溶解。测定溶液中总黄酮含量分别为2.20、2.89、3.23 mg/mL。再通过1.3.8节的公式计算出纯度分别为55.00%、72.25%、80.75%。可见经MAR纯化后纯度提高了17.25%，纯化效果较好。经PA化后的总黄酮虽然纯度只提高了8.5%，但黄酮颜色由黄土赭色变成了象牙白，说明PA脱色效果较好。茅岩莓总黄酮用MAR与PA联用法，纯度提高了25.75%，说明此方法有一定的可行性。
本研究确定了MAR对茅岩莓总黄酮进行初步纯化的最适宜工艺参数为：上样液总黄酮质量浓度6 mg/mL、上样液流速1 mL/min、上样液体积130 mL；洗脱液乙醇体积分数70%、洗脱流速1 mL/min、洗脱液体积40 mL。在此条件下，茅岩莓总黄酮纯度从55.00%提高到了72.25%。确定了PA对茅岩莓总黄酮第2次纯化的最适宜工艺参数为：上样液总黄酮质量浓度6 mg/mL、上样液流速2 mL/min；洗脱液乙醇体积分数70%、洗脱流速1 mL/min、洗脱液体积55 mL。在此条件下，总黄酮纯度提高到了80.75%。用MAR与PA联用法纯化茅岩莓总黄酮，纯度提高了25.75%，而MAR法[25]纯化茅岩莓总黄酮纯度只提高了14.65%。因此MAR-PA联用法达到了较好的纯化目的，并使PA弥补了MAR在纯化工艺上的不足，具有良好的应用前景，为实际生产提供了有效依据。
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Purification of Total Flavonoids from Ampelopsis grossedentata by Combined Use of Macroporous Adsorption Resin and Polyamide
JIN Huiming, GUO Hongying, TAN Xinghe*, LIU Menghao, WANG Feng, CAI Wen, ZHANG Yu, DENG Jiehong
(Key L aboratory for Food Science and Bio-Technology of Hunan Province, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)
Abstract: Sequential column chromatographies on HPD-100 macroporous adsorption resin (MAR) and polyamide (PA) were used to purify total flavonoids from Ampelopsis grossedentata. The optimum adsorption parameters for HPD-100 MAR were determined as follows: sample concentration, 6 mg/mL; sample flow rate, 1 mL/min; and sample volume, 130 mL. Under these conditions, the percentage adsorption was 97.14%. The optimum desorption parameters were established as follows: eluent concentration, aqueous ethanol (70:30, V/V); eluent volume, 40 mL; and flow rate, 1 mL/min. Under these conditions, the percentage desorption was 94.10%. After the treatment with HPD-100 MAR, the purity of total flavonoids was inc reased from 55.00% to 72.25%. The optimum adsorption parameters for PA were determined as follows: sample concentration, 6 mg/mL; and flow rate, 2 mL/min. Under these conditions, the percentage adsorption was 99.57%. The optimum desorption parameters were determined as follows: 70% ethanol in water (V/V) as the eluent; eluent volume, 55 mL; and flow rate, 1 mL/min. Under these conditions, the percentage desorption was 76.50%. After the treatment with PA, the purity of total flavonoids was further increased to 80.75%. The method presented in this study can provided a promising approach for the efficiency purification of total flavonoids from Ampelopsis grossedentata.
Key words: Ampelopsis grossedentata; total flavonoids; macroporous adsorption resin; polyamide; purification
收稿日期：2015-10-14
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31371817）；湖南省自然科学基金项目（2015JJ3076）
作者简介：金慧鸣（1990—），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工技术。E-mail：279697317@qq.com
*通信作者：谭兴和（1959—），男，教授，博士，研究方向为农产品加工技术。E-mail：xinghetan@163.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612003 10.7506/spkx1002-6630-201612003. http://www.spkx.net.cn
中图分类号：TS201.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）12-0013-06